本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及水稻谷氧還蛋白基因osgrxc2在育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

谷氧還蛋白（glutaredoxins，grxs）是一類(lèi)谷胱甘肽依賴(lài)型氧化還原酶，1976年由holmgren等在缺失trx基因的大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)，普遍存在于細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物和植物中的小分子蛋白，分子量約為10-15kda。grxs通過(guò)調(diào)節(jié)二硫鍵的氧化還原發(fā)揮作用，通常含有一個(gè)保守的雙巰基cys-x-x-cys或者單巰基cys-x-x-ser活性位點(diǎn)。植物中的grxs是以grxs或grxc活性位點(diǎn)的第四個(gè)殘基為s或c命名，根據(jù)保守活性位點(diǎn)殘基特點(diǎn)被分為cc-型、cpyc-型和cgfs-型（lemaireetal.,2004;rouhieretal.,2004）。一些編碼grxs蛋白的cdnas已經(jīng)從多種植物中分離（shutianli,2014）。rohini在2010年研究水稻中g(shù)rxs對(duì)各種逆境的響應(yīng)時(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了48個(gè)grxs基因，但這些grxs基因大多功能還不清楚?，F(xiàn)在已經(jīng)報(bào)道grxs基因的功能有：調(diào)控植物的發(fā)育，參與dna合成、信號(hào)傳導(dǎo)和脅迫響應(yīng)，[fe-s]簇的聚集等（rouhieretal.,2004,2007）。盡管grxs在許多種植物中已經(jīng)被鑒定，但是到目前為止只有一小部分基因進(jìn)行了功能研究分析。osgrxc2是本發(fā)明人研究的一個(gè)谷氧還蛋白，推測(cè)其可能在種子貯藏過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

胚是水稻種子的重要組成部分，胚的發(fā)生和發(fā)育直接影響著水稻的繁殖和發(fā)育，胚在植物傳宗接代以及植物形態(tài)發(fā)生中都具有非常重要的作用。水稻的胚位于穎果腹側(cè)基部，雖然只占穎果重量的2%～3%，卻是穎果最重要的組成部分。稻胚是稻株新個(gè)體的原始體，在穎果成熟時(shí)已有胚芽、胚軸、胚根和子葉等器官的分化，胚的發(fā)育對(duì)稻株的個(gè)體發(fā)生和形態(tài)建成至關(guān)重要。目前已經(jīng)研究的關(guān)于種胚發(fā)育的標(biāo)記基因主要包括roc1、atml1、scr、ramy1a和osh1等。roc1、atml1基因在l1層表達(dá)，對(duì)l1表皮原是一個(gè)很好的分子標(biāo)記。擬南芥scr基因特異性的定位在內(nèi)皮細(xì)胞層包括皮質(zhì)、內(nèi)皮起始細(xì)胞。ramy1a和osh1分別是上皮細(xì)胞和芽尖區(qū)域的分子標(biāo)記基因。但目前對(duì)水稻胚胎發(fā)育相關(guān)的分子機(jī)制和細(xì)胞活動(dòng)的認(rèn)識(shí)甚少。

水稻（oryzasatival.）是世界重要糧食作物之一，全世界半數(shù)以上的人口以其為主食，水稻生產(chǎn)是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的大事，與我國(guó)糧食安全保障密切相關(guān)。水稻育種上的每一次突破，都必然給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)一次飛躍。水稻矮稈資源的發(fā)掘和利用，使水稻種植發(fā)生了第一次飛躍。70年代水稻野敗型不育系的發(fā)掘和利用，我國(guó)“三系”雜交稻培育成功,使水稻種植發(fā)生了第二次飛躍。光溫敏核不育等基因資源的發(fā)掘和利用又給水稻育種的突破帶來(lái)新的途徑。但進(jìn)入21世紀(jì)，雜交稻的育成品種大多在低水平上重復(fù)，雜交稻種植面積出現(xiàn)了徘徊局面。究其主要原因是三系雜交稻目前所利用親本的遺傳背景相對(duì)狹窄，受恢復(fù)基因限制，雜種優(yōu)勢(shì)的潛力有限。三系法育種程序和生產(chǎn)環(huán)節(jié)復(fù)雜，以致選育新組合的周期長(zhǎng)、效率低、推廣環(huán)節(jié)多、種子成本高，二系雜交稻也存在制種難度較大等問(wèn)題，影響了雜交稻的進(jìn)一步發(fā)展。常規(guī)稻產(chǎn)量穩(wěn)定品質(zhì)好，然而我國(guó)植物品種保護(hù)制度不完善，也影響其進(jìn)一步的應(yīng)用。

因而，培育無(wú)胚水稻新品系，控制水稻種胚的敗育程度，可為水稻育種提供新的材料和思路；過(guò)去，為了解決糧食安全問(wèn)題，高產(chǎn)一直是我國(guó)水稻育種的首要目標(biāo)；如今，兼顧高產(chǎn)與品質(zhì)，早已成為育種的新常態(tài)和新要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供水稻谷氧還蛋白基因osgrxc2在水稻育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案給予實(shí)現(xiàn)的：

一種水稻谷氧還蛋白基因osgrxc2，其序列如seqidno：1所示，或seqidno：1所示序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且與seqidno：1所述基因所編碼的蛋白具有同等功能的基因序列。

所述osgrxc2基因序列全長(zhǎng)384bp，編碼127個(gè)氨基酸。

一種由水稻谷氧還蛋白基因osgrxc2編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如seqidno：2所示，或序列seqidno：2所示序列經(jīng)替換、缺失、或/和添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基而形成的具有同等功能的氨基酸序列、功能片段和/或突變體。

含有本發(fā)明osgrxc2基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞、原核細(xì)胞或酵母細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞為農(nóng)作物細(xì)胞，具體為禾本科植物細(xì)胞，如水稻細(xì)胞。

本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，水稻osgrxc2基因與水稻種胚發(fā)育以及水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)，osgrxc2基因及其編碼的蛋白可用于控制植株種胚的敗育程度以及稻谷千粒重和出米率。

因此，水稻osgrxc2基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值：

應(yīng)用之一為水稻osgrxc2基因在植物育種中的應(yīng)用。

應(yīng)用之二為水稻osgrxc2蛋白在植物育種中的應(yīng)用。

應(yīng)用之三為水稻osgrxc2基因在調(diào)控植物種胚的敗育程度中的應(yīng)用。

應(yīng)用之四為水稻osgrxc2蛋白在調(diào)控植物種胚的敗育程度中的應(yīng)用。

具體地，所述應(yīng)用為在培育無(wú)胚或胚退化植物中的應(yīng)用。

具體地，所述應(yīng)用為在培育高千粒重和高出米率水稻品種中的應(yīng)用。

具體地，是將osgrxc2基因在植物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。

具體地，是通過(guò)控制osgrxc2基因的表達(dá)量從而控制水稻種胚的敗育程度。

優(yōu)選地，是將osgrxc2基因的過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入到植物中進(jìn)行過(guò)表達(dá)。

所述導(dǎo)入方式?jīng)]有限定，只要是能使過(guò)表達(dá)載體成功導(dǎo)入到宿主細(xì)胞的方法都可行。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種利用農(nóng)桿菌的植物改良方法，包括如下步驟：

s1.提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有所述蛋白編碼的osgrxc2基因；

s2.將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟s1中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；

s3.挑選出成功轉(zhuǎn)入osgrxc2基因的植物細(xì)胞或組織或器官；

s4.將步驟s3中的植物細(xì)胞或組織或器官再生成植物。

所述的osgrxc2基因既可為所述基因的cdna序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的dna序列，是將所述基因的cdna貨基因組序列用已知的方法分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。

所述的植物包括：水稻、小麥、玉米、高粱、擬南芥等及其它禾谷類(lèi)作物，也包括其他一些重要的經(jīng)濟(jì)作物，例如棉花、油菜或番茄等。

另外，本發(fā)明還提供一種利用所述osgrxc2基因用于水稻育種的方法，可產(chǎn)生無(wú)胚或者胚退化的材料，不能留種繁殖，或培育高千粒重和高出米率水稻品種，具體包括如下步驟：

s1.分離得到水稻種胚發(fā)育相關(guān)基因osgrxc2；

s2.通過(guò)上述改良植物的方法獲得osgrxc2過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因to代株系；

s3.to代轉(zhuǎn)基因株系后代f1出現(xiàn)分離比，去除野生型植株，保留f1代轉(zhuǎn)基因純合植株；

s4.f1代轉(zhuǎn)基因純合株系的下代植株的基因表達(dá)量呈現(xiàn)劑量效應(yīng)，基因表達(dá)量高的植物會(huì)出現(xiàn)種胚退化至敗育的現(xiàn)象（敗育率15～50%），下一代種子由于無(wú)胚率高而達(dá)不到種子發(fā)芽率要求，不能留種繁殖。

本發(fā)明osgrxc2過(guò)量表達(dá)水稻植株后代會(huì)出現(xiàn)不同程度的種胚退化至敗育的現(xiàn)象，而且稻谷千粒重和出米率提高，提高了稻米產(chǎn)量和品質(zhì)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明的osgrxc2基因及其編碼蛋白可用于控制水稻種胚的敗育程度，轉(zhuǎn)osgrxc2基因植株種子的下代材料會(huì)發(fā)生性狀分離，產(chǎn)生無(wú)胚或者胚退化的材料，不能留種繁殖；同時(shí)，轉(zhuǎn)osgrxc2基因純合植株稻谷千粒重和出米率提高，提高了稻米產(chǎn)量和品質(zhì)，在水稻育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

（2）本發(fā)明osgrxc2基因與水稻種胚發(fā)育有關(guān)，為我們研究控制種胚相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控提供了材料，也有助于植物種胚發(fā)育機(jī)制的研究。

附圖說(shuō)明

圖1為水稻osgrxc2基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系與受體品種“中花11（wt）”的表達(dá)量檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)量與wt相比都顯著增加，特別是oe11和oe12表達(dá)量是wt的45倍左右。

圖2為osgrxc2基因在水稻不同組織中的表達(dá)模式分析。osgrxc2基因在種子種的表達(dá)量比其他組織中的表達(dá)量高，25d種子的表達(dá)量是莖中表達(dá)量的35倍。

圖3為水稻osgrxc2基因過(guò)量表達(dá)株系與wt株系的種胚形態(tài)的比較。

其中，3a顯示，水稻osgrxc2基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量高的（oe11和oe12）出現(xiàn)水稻種胚退化至敗育。

3b顯示，3a中的水稻種子吸水萌發(fā)12h后進(jìn)行ttc染色。wt、oe2和oe6種胚正常并且有活力，而oe11和oe12水稻種胚已經(jīng)退化完全檢測(cè)不到活力。

圖4為水稻osgrxc2基因過(guò)量表達(dá)株系與wt株系的千粒重分析。轉(zhuǎn)基因株系的千粒重比wt高，而且水稻種胚退化株系（oe11）千粒重增加更顯著，可提高水稻出米率。

圖5為水稻wt與oe11開(kāi)花后5d、7d和10d種胚發(fā)育過(guò)程形態(tài)觀察；其中，5a顯示，wt植株開(kāi)花后5d形成胚芽鞘，進(jìn)行胚芽鞘和腹鱗分化。開(kāi)花后7d形成幼胚，已經(jīng)進(jìn)行了第1葉原基分化。wt植株開(kāi)花后10d形成成熟胚。但是oe11植株開(kāi)花后5d，7d，10d胚的發(fā)育情況不正常，形成畸形胚。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。

實(shí)施例1osgrxc2基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得

1、水稻的培養(yǎng)

水稻種子放在50ml的三角瓶中個(gè)，先用75%酒精消毒90s，再用2.5%的次氯酸鈉消毒45min，無(wú)菌水沖洗5次后，放在無(wú)菌濾紙上晾干，最后播種在滅菌的ms固體培養(yǎng)基（1.5%蔗糖，0.8%瓊脂，ph5.8）上，16h/8h（28℃）的晝夜交替，白熾燈光照培養(yǎng)。

2、水稻rna提取：采用本領(lǐng)域常規(guī)的trizol法提取水稻rna。

3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（cdna合成）

用takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

4、目的基因的pcr擴(kuò)增

根據(jù)osgrxc2基因的cds以及酶切信息，分別選取合適的酶切位點(diǎn)將目的片段克隆到pcambia1390表達(dá)載體上，其中所用引物如下：

5’端寡核苷酸引物序列為：

5’-ggatccatgggaatcgcctcctcc-3’（seqidno：3）

3’端引物序列為：

5’-ggatccctatgcggtgattgtcgtctttg-3’（seqidno：4）

pcr反應(yīng)體系：10×buffer2μl，10mmdntpmix2μl，mgso40.8μl，primern（10μmol/l）0.5μl，primerc（10μmol/l）0.5μl，dna模板1μl，kod酶（2.5u/μl）0.5μl，ddh2o補(bǔ)充至20μl；

pcr反應(yīng)程序：98℃變性2min；按98℃10s，56℃30s，68℃30s共28個(gè)循環(huán)；68℃終延伸延伸6min。

5、構(gòu)建基因的過(guò)表達(dá)載體

過(guò)量表達(dá)osgrxc2用的是phqsn1載體，該載體由植物表達(dá)載體pcambia1390改造而來(lái)，含有一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)（ori）、卡那霉素基因、潮霉素抗性基因（hygr）、ubi和camv35s啟動(dòng)子，nos基因的終止信號(hào)序列以及后兩者之間的限制性?xún)?nèi)切酶克隆位點(diǎn)（mcs）。將目標(biāo)基因的編碼序列克隆到ubi啟動(dòng)子之后，能夠在其強(qiáng)驅(qū)動(dòng)下獲得很高的表達(dá)。

（1）osgrxc2編碼序列的克?。?/p>

首先以水稻“中花11”（wt）的rna為模板，合成第一條cdna，用該dna序列的5’和3’端的pcr寡核苷酸為引物（seqidno：3和seqidno：4），用高保真taq酶kod進(jìn)行擴(kuò)增，獲得含有酶切位點(diǎn)全長(zhǎng)cds396bp的cdna擴(kuò)增產(chǎn)物。并將該產(chǎn)物加a克隆到pmd18-t載體，并對(duì)多個(gè)重組子進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證序列的正確性。該重組的過(guò)渡質(zhì)粒載體成為osgrxc2-pmd18-t。

（2）將osgrxc2-pmd18-t以及phqsn1載體用bamh1單酶切后在將粘性末端連接，連接物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，在含有kan（50μg/ml）的lb培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選單菌落提取質(zhì)粒，用bamh1酶切挑選出有約396bp片段插入的克隆，并用5’端引物測(cè)序檢驗(yàn)核苷酸序列是否正確，并選擇osgrxc2正向連接表達(dá)載體的質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。正向成功構(gòu)建osgrxc2-phqsn1質(zhì)粒。把osgrxc2-phqsn1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌a.tumefacienseha105，在含有卡那霉素和利福平的培養(yǎng)基上挑取單克隆，并用pcr鑒定陽(yáng)性克隆。

6、eha105介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化：

用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型中花11愈傷，經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有抗性的愈傷組織，分化、生根、煉苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用hiei等人報(bào)道的方法（參見(jiàn)agrobacterium-mediatedtransformationofriceusingimmatureembryosorcalliinducefrommatureseed，2008，natureprotocol.doi:10.1038/nprot.2008.46）基礎(chǔ)上進(jìn)行。

（1）挑選飽滿的成熟種子去殼，用75%的酒精消毒90s，用2.5%naclo溶液搖45min，180rpm。無(wú)菌水漂洗3～5次，風(fēng)干，鋪在nbo培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)4周，15天繼代一次。

（2）將農(nóng)桿菌在lb培養(yǎng)基上劃線涂板，28℃暗培養(yǎng)3天。

（3）挑取單菌落接種到5ml含抗生素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

（4）將新鮮的農(nóng)桿菌菌液離心，收集（濃度適中）放入aam液體培養(yǎng)基中，26℃避光培養(yǎng)2～5h。

（5）選擇致密的愈傷組織顆粒（直徑3～5mm）用于轉(zhuǎn)化。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織顆粒在準(zhǔn)備好的aam菌液中浸染5min，放在無(wú)菌濾紙上除去過(guò)多的菌液后，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)3天。

（6）共培養(yǎng)后，用無(wú)菌水洗3次，用aam培養(yǎng)液潤(rùn)洗一次，，吹干愈傷組織，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基含抗生素上篩選1個(gè)月。

（7）篩選后的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基含抗生素上在光照條件下26℃繼續(xù)培養(yǎng)至分化出綠苗。把小苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基含抗生素中培養(yǎng)，將其從生根培養(yǎng)基中移除，洗凈殘留培養(yǎng)基，在清水中煉苗。當(dāng)白色的新根長(zhǎng)出時(shí)，將其移栽到溫室或大田。

經(jīng)篩選的陽(yáng)性植株移至土壤生長(zhǎng)，待成熟收集種子即得to代植株，經(jīng)過(guò)hpt（潮霉素）篩選及半定量rt-pcr分析，我們從篩選到的株系中選擇四個(gè)株系oe2、oe6、oe11和oe12進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其表達(dá)量結(jié)果如圖1所示，該四個(gè)株系中osgrxc2基因表達(dá)水平較野生型均明顯上調(diào)，且株系oe11和oe12上調(diào)非常顯著，并出現(xiàn)了無(wú)種胚的種子，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了較為理想的研究材料。

實(shí)施例2osgrxc2基因的功能鑒定

1、osgrxc2基因的組織定位觀察

研究osgrxc2基因的組織定位情況，分別于水稻4葉期、分蘗期、抽穗期取相應(yīng)組織或器官提取總rna，以osactin為內(nèi)參進(jìn)行rt-qpcr檢測(cè)，對(duì)osgrxc2的組織特異性進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示，在根、莖、分蘗期葉片、抽穗期劍葉、蘗、花序和種子中均能檢測(cè)到該基因的表達(dá)，其在種子中表達(dá)水平最高，特別是蠟熟期種子表達(dá)量為莖中的45倍左右。該結(jié)果表明，osgrxc2基因的表達(dá)并無(wú)組織特異性，是組成型表達(dá)基因，在種子成熟期表達(dá)量較高。其中所用的引物如下：

osgrxc2的5’端寡核苷酸引物序列為：

5’-ggcacttgctgaatggac-3’（seqidno：5）

3’端引物序列為：

5’-tgcggtgattgtcgtctt-3’（seqidno：6）

osactin的5’端寡核苷酸引物序列為：

5’-ggaactggtatggtcaaggct-3’（seqidno：7）

3’端引物序列為：

5’-acacggagctcgttgtagaag-3’（seqidno：8）

2、轉(zhuǎn)osgrxc2基因水稻株系種胚的表型分析

表達(dá)量較高的轉(zhuǎn)osgrxc2基因水稻株系（oe11和oe12）后代出現(xiàn)了種胚退化至敗育的現(xiàn)象（圖3）。為了觀察種胚退化至敗育的情況，把wt和oe11胚退化種子用清水處理12h，然后縱切種子，進(jìn)行ttc染色30min，然后在體式顯微鏡下觀察胚的情況（圖3）。發(fā)現(xiàn)wt與表達(dá)量低的轉(zhuǎn)基因（oe2和oe6）種子被染成紅色，說(shuō)明wt、oe2和oe6種子有活力；但是oe11和oe12種子不能被染成紅色而且沒(méi)有萌發(fā)的跡象，說(shuō)明oe11和oe12種胚已經(jīng)退化至敗育，沒(méi)有活力，不能萌發(fā)產(chǎn)生后一代。成熟osgrxc2過(guò)量表達(dá)種子粒重增加，表達(dá)量較高的株系oe12增加更明顯（圖4），增加了稻米的品質(zhì)及出米率。為了進(jìn)一步觀察無(wú)胚材料的種胚退化過(guò)程，我們對(duì)wt和oe11種子進(jìn)行5d、7d和10d發(fā)育階段進(jìn)行取材，然后進(jìn)行石蠟切片，并用甲苯胺藍(lán)染色，用正直熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)oe11種子與wt相比在5d時(shí)開(kāi)始種胚退化、形成畸形胚，如不進(jìn)行根芽原基、胚芽鞘和腹鱗分化，細(xì)胞數(shù)量也較少（圖5c-5e）；在7d時(shí)oe11細(xì)胞數(shù)量增多但是也不進(jìn)行第2葉原基分化（圖5h-5j）；在10d時(shí)oe11細(xì)胞數(shù)量減少，沒(méi)有盾片的吸收細(xì)胞層分化（圖5m-5o），形成不正常的胚而不能留種。推測(cè)osgrxc2過(guò)量表達(dá)影響細(xì)胞胚的分化。

其中，石蠟切片依照以下步驟完成：

1）取材：取wt與oe11開(kāi)花后5d、7d和10d種子，固定于4%多聚甲醛24h以上。將組織從固定液取出在通風(fēng)櫥內(nèi)用手術(shù)刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)。

2）脫水：將脫水盒放進(jìn)吊籃里于脫水機(jī)內(nèi)依次梯度酒精進(jìn)行脫水。75%酒精4h→85%酒精2h→90%酒精2h→95%酒精1h→無(wú)水乙醇i30min→無(wú)水乙醇ii30min→醇苯5-10min-二甲苯i5-10min→二甲苯ii5-10min→蠟i1h→蠟ii1h→蠟iii1h。

3）包埋：將浸好蠟的組織于包埋機(jī)內(nèi)進(jìn)行包埋。先將融化的蠟放入包埋框，待蠟?zāi)讨皩⒔M織從脫水盒內(nèi)取出按照包埋面的要求放入包埋框并貼上對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽。于-20°冰箱冷卻，蠟?zāi)毯髮⑾瀴K從包埋框中取出并修整蠟塊。

4）切片：將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上切片，片厚4μm。切片漂浮于攤片機(jī)40℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，并放進(jìn)60℃烘箱內(nèi)烤片。

5）石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯ⅰ20min→二甲苯ⅱ20min→無(wú)水乙醇ⅰ10min→無(wú)水乙醇ⅱ10min→95%酒精5min→90%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min→蒸餾水洗。

6）染色：甲苯胺藍(lán)染液染色10min。

7）分化：95%酒精分化。

8）封片：電吹風(fēng)吹干或烘箱吹干；二甲苯透明數(shù)分鐘，中性樹(shù)膠封片。

9）顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

序列表

<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心

<120>水稻谷氧還蛋白基因osgrxc2在育種中的應(yīng)用

<130>1712557zbsh042

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>384

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

<400>1

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<213>水稻(oryzasativa)

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<213>水稻(oryzasativa)

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<213>水稻(oryzasativa)

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<213>水稻(oryzasativa)

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<213>水稻(oryzasativa)

<400>8

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