本發(fā)明涉及一個水稻穗色相關基因及其功能，屬于植物分子遺傳領域。

背景技術：

光合作用是利用葉綠體中的葉綠素(chlorophyll)，在可見光照射下，將二氧化碳和水轉化為有機物。葉綠素含量在一定范圍內與光合速率成正相關。穗的光合作用對籽粒的生物量累積具有一定的作用，如麥穗光合作用對籽粒的貢獻可達10％～76％，而稻穗光合能力較弱，對籽粒的貢獻只有4％～23％，可見稻穗的光合能力還有很大的提升空間。因此，利用新優(yōu)異基因，提高稻穗中葉綠素的含量，增加穗光合作用對籽粒的貢獻率，將可能更有效促地促進水稻高產(chǎn)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種水稻深綠穗基因的用途。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種水稻深綠穗基因的用途，用于提高稻穗中光合色素(包括葉綠素、類胡蘿卜素)的含量；調控該水稻深綠穗的基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。

作為本發(fā)明的水稻深綠穗基因的用途的改進，用于提高稻穗中光合作用的光能轉化效率。

本發(fā)明的技術方案具體如下：

本發(fā)明利用人工輻射誘變粳稻品種中花11，在突變體庫中獲得了一個罕見的深綠穗突變體，迄今在水稻中還未曾報道。與中花11的黃綠穗色相比，該突變體的穗色深綠(圖1)，穗的葉綠素與類胡蘿卜素的含量顯著性增加(圖2)，穗中光合作用的光系統(tǒng)ii原初光能轉換效率也顯著性提高(圖3)，對水稻穗的光合機理研究及其育種應用具有重要意義。

將水稻深綠穗突變體與野生型品種巴香占雜交，f1表型為野生型。在f1自交的f2代群體中，野生型與突變型的比例經(jīng)χ²檢驗符合3:1，表明深綠穗突變表型受一個隱性基因控制。利用圖位克隆技術，將目的基因定位水稻第1號染色體上物理距離為91kb的兩個分子標記之間。根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫的注釋，將其中1個預測基因(登錄號：loc_os01g62060)確定為候選基因，通過rt-pcr分析表明該基因在野生型中表達，在深綠穗突變體中不表達(圖4)。為了驗證該基因的功能，構建loc_os01g62060基因的表達載體，遺傳轉化到水稻深綠穗突變體中，獲得相應的轉基因水稻植株，該轉基因植株的穗色恢復為野生型的黃綠色(圖5)，證明該基因調控穗色深綠的功能，克隆了該基因。生物信息學分析表明該基因編碼的蛋白功能未知，與已知的葉綠素代謝、葉綠體發(fā)育、光合作用等途徑的相關基因沒有任何同源性，是一個沒有報道過的新功能基因，具有重要的研究意義和潛在的應用價值。

附圖說明

下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1為水稻深綠穗突變體與對照中花11的穗色；

圖2為水稻深綠穗突變體與對照中花11穗的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，**表示t檢驗存在極顯著性(p<0.01)差異，下同；

圖3為水稻深綠穗突變體與對照中花11穗的凈光合速率；

圖4為基因loc_os01g62060的rt-pcr表達分析，以持家基因actin做為內參；

圖5為基因loc_os01g62060遺傳轉化水稻深綠穗突變體后的植株穗色。

具體實施方式

實施例1、水稻深綠穗突變體的獲得與種植

采用⁶⁰co的γ射線輻射，以300gy的照射劑量處理水稻粳稻品種中花11的種子500g。5月初，將輻射后的種子(m1)播種在水稻田的苗床上，6月初進行移栽，成熟后單株收獲種子(m2)。第2年，在水稻田中每個m2株系分別種植30株，鑒定表型。其中，在一個m2株系中發(fā)現(xiàn)深綠穗突變表型的植株。收獲突變株的種子，連續(xù)種植2代，即m3與m4代都出現(xiàn)相同的深綠穗突變表型，表明該突變表型是可穩(wěn)定遺傳的。深綠穗突變體m4代收獲的種子(m5)代用于以下的實驗研究。

實施例2、水稻穗的葉綠素、類胡蘿卜素含量測定

在水稻抽穗期，選取長勢一致的9株深綠穗突變體與9株對照中花11，對其新抽的穗，參照lichtenthaler等方法(引自：methodenzymol,1987,148:350-382)測定葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量；每3株的葉片混合成1個樣品，共3個生物性重復樣品。測定時，每份樣品重復測定3次，取平均值，對3份樣品的平均值進行統(tǒng)計分析，采用t-test檢驗突變體與野生型之間的顯著性差異。

所得結果為深綠穗突變體穗的葉綠素a、葉綠素b與類胡蘿卜素含量都顯著性高于野生型對照中花11。

實施例3、水稻穗的凈光合速率測定

在水稻抽穗期，選取長勢一致的9株深綠穗突變體與9株對照中花11，對其新抽的穗，按照向珣朝等方法(引自：中國農(nóng)學通報,2005,21(1):81-84)，測定儀分穗中光合作用的光系統(tǒng)ii原初光能轉換效率，取樣方式和統(tǒng)計分析同實施例2。

所得結果為深綠穗突變體穗中光合作用的光系統(tǒng)ii原初光能轉換效率顯著性高于野生型對照中花11。

實施例4、水稻深綠穗基因的精細定位

用深綠穗突變體與野生型品種巴香占進行雜交，其f1代植株均表現(xiàn)為野生型。f1代自交得到f2群體，f2代中出現(xiàn)野生型與突變型兩種表型，其比例經(jīng)χ²檢驗符合3:1，表明水稻深綠穗突變體是由單個隱性基因控制。采用圖位克隆技術，通過分析f2群體中的深綠穗突變株的染色體交換率，對目的基因進行定位。

首先，分別提取f2群體中深綠穗突變型個體的基因組dna。提取方法：取水稻葉片0.1g，用液氮研磨后，加600μl提取液(0.1mol/ltris-clph8.0，500mmol/lnacl，1.25g/lsds)，65℃溫育30min。加200μl5mol/lkac，混勻后，冰浴30min。再加500μl氯仿，混勻，10000r/min離心5min，取上清，加2/3上清體積的異丙醇，混勻，12000r/min離心5min。棄去上清，用70％乙醇洗滌沉淀，倒置晾干，加100μlte溶解dna。

接著，用已公布的覆蓋水稻12條染色的ssr分子標記(引自：nature，2005,436(11):793-800)對f2群體中20個突變株的dna分別進行pcr擴增。pcr試劑采用南京博爾迪生物技術有限公司的2×pcrmix，20μl反應體系，方法見產(chǎn)品說明。pcr擴增條件為：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，55～60℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。

然后，用1×tae電泳液制備濃度為3％的瓊脂糖凝膠，將20μlpcr產(chǎn)物與2μl10×loadingbuffer混合，加到凝膠的點樣孔中，在100v恒壓下電泳30min。用溴化乙錠對凝膠進行染色，顯示dna條帶，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港實驗室出版社，第三版)。在紫外透射儀上，用305nm波段觀察凝膠上的電泳條帶。通過分析每個標記的電泳帶型，計算分子標記與目的基因的遺傳距離，將目的基因初步定位在了水稻1號染色體的長臂上rm8084和rm11860兩個標記之間。

最后，根據(jù)水稻基因組的序列(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)，在標記rm8084與rm11860之間的dna序列上，設計了分子標記id21、id26與caps1的pcr引物，id21：5’-gtggatgtggaatggaggaagt-3’與5’-aggcagcagctggagaagaat-3’，id26：5’-gataatgccacatgattctga-3’與5’-taacacgattggtgcctacat-3’，caps1：5’-tgctcatgaattccgttgca-3’與5’-aatgtccacacctgagaagg-3’。對f2群體中1000個突變株的dna進行pcr擴增，方法同上。caps1標記的pcr產(chǎn)物還要用限制性內切酶taqi(takara，japan)進行酶切，方法見產(chǎn)品說明。電泳分析與ssr標記的方法相同。通過分析每個標記的電泳帶型，計算分子標記與目的基因的遺傳距離，最終將目的基因精選定位在標記id26與caps1之間，物理距離為91kb。

實施例5、水稻深綠穗候選基因的確定

根據(jù)水稻基因組的基因注釋數(shù)據(jù)庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，對標記id26與caps1之間的序列進行基因預測分析，確定了1個可能的候選基因loc_os01g62060。取水稻葉片組織，在液氮中研磨后，用trizol試劑(invitrogen，usa)提取總rna，用m-mlv反轉錄酶(promega，usa)合成cdna第一鏈，方法見產(chǎn)品說明。設計loc_os01g62060基因的pcr引物5’-acatcagattggtgcagcatc-3’與5’-atctcttggaaccagcagct-3’；以水稻持家基因β-actin為標準化的內參，引物序列為5’-ggaactggtatggtcaaggc-3’與5’-agtctcatggatacccgcag-3’。pcr試劑采用南京博爾迪生物技術有限公司的2×pcrmix，20μl反應體系，方法見產(chǎn)品說明。pcr反應程序為：94℃預變性5min；94℃30s，60℃復性30s，72℃延伸1min，25個循環(huán)；72℃延伸5min。pcr產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色后，在紫外透射儀上，用305nm波段觀察凝膠上的電泳條帶，分析loc_os01g62060基因的表達水平。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該基因在野生型中花11有表達，而在深綠穗突變體不表達，因此，確定loc_os01g62060基因為候選基因。

loc_os01g62060基因的序列如seqidno:1所示。

實施例6、水稻loc_os01g62060基因的轉基因功能互補試驗

為驗證侯選基因loc_os01g62060的功能，設計帶有限制性內切酶序列的pcr引物：5’-ggggtaccatggacgacggcggcggc-3’與5’-cgcggatccctagtcgtcgtctccgcc-3’，采用高保真酶premixprimestarhs(takara，japan)，pcr擴增該基因的cdna序列(為seqidno:2)，pcr擴增體系與程序方法見產(chǎn)品說明。pcr產(chǎn)物與表達載體pcambia1300s分別用限制內切酶kpni與bamhi(takara，japan)進行酶切，方法見產(chǎn)品說明。采用t4dna連接酶(promega，usa)將酶切完的pcr產(chǎn)物與pcambia1300s載體進行dna連接，方法見產(chǎn)品說明，構建了loc_os01g62060基因表達載體。并根據(jù)文獻《aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice》(引自：natprotoc,2006,1(6):2796-2802.)的方法，將構建好的loc_os01g62060基因表達載體遺傳轉化到水稻深綠穗突變體中，獲得相應的轉基因水稻，其穗色恢復到了野生型的黃綠色，驗證了loc_os01g62060基因的功能，克隆了該水稻深綠穗基因。即，loc_os01g62060基因對提高稻穗中葉綠素的含量具有負調控的作用。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。