本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子標記方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是一種重要的單子葉作物，是全世界最重要的糧食作物之一，也是世界上一半人口的主糧。但是，各種病蟲害的發(fā)生，嚴重制約了水稻的產(chǎn)量，其中，由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病，是水稻最具威脅性的病害之一。稻瘟病威脅著幾乎所有水稻種植地區(qū)的生產(chǎn)安全，它是由子囊菌引起的病害，每年由于這種真菌性病害而造成的水稻產(chǎn)量損失，約占全球水稻總產(chǎn)量的10～30％。目前，稻瘟病危害的防治措施，主要采取施用農(nóng)藥的化學(xué)藥劑防治方式，但農(nóng)藥施用即造成環(huán)境污染，又增加水稻生產(chǎn)成本。僅在日本，每年抗稻瘟病殺菌劑的銷售額就達26億日元(約2億人民幣)。同時，由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)復(fù)雜、易變，往往造成含單個抗性基因的水稻新品種在種植3～5年后，就很容易喪失抗性，這在大面積種植的水稻品種中特別明顯，所以，選育廣譜持久水稻稻瘟病抗性新品種，是實現(xiàn)水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的基礎(chǔ)，也是解決人口增長和糧食產(chǎn)量矛盾的重要途徑。因此，發(fā)掘和定位更多新的抗性基因(QTLs)，利用分子標記技術(shù)，將多個稻瘟病抗性基因(QTLs)聚合到高產(chǎn)的水稻品種中，培育出廣譜持久的抗病水稻新品種，是防治稻瘟病最有效的措施。

天津野生稻(TY)是在對38000份國內(nèi)外不同的稻種資源進行稻瘟病抗性鑒定過程中，篩選出的具有廣譜持久抗性的抗源材料。因此，通過SSR等分子標記，鑒定TY的廣譜持久抗性基因，對水稻抗病育種十分必要。在前期的研究中，利用TY與稻瘟病高感品種CO39雜交，構(gòu)建的F₂群體為研究對象，利用稻瘟病菌株CHL1743、110-2和318-2進行室內(nèi)接種鑒定，F(xiàn)₂群體的抗感單株分離比符合3∶1，表明其對3個稻瘟病菌株的抗性均由1個主效基因控制，命名為Pi2-1。利用群體分離分析法和隱性群體分離法進行初步定位分析，將Pi2-1基因定位在水稻第6號染色體著絲粒附近的SSR標記AP5659-5到RM7213之間，與2個標記的遺傳距離分別為0.9cM和1.4cM【天津野生稻稻瘟病抗性的遺傳分析與抗瘟基因Pi2-1的初步定位，王悅等，2013，39(1)，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)】。因此，進一步對Pi2-1基因進行精細定位，將為抗病基因分子標記輔助選擇奠定基礎(chǔ)，同時也為抗病育種提供豐富的抗源材料。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)存在的問題，提供一種水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子標記方法及應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子標記方法，提取水稻樣品基因組DNA，利用與稻瘟病抗性基因Pi2-1緊密連鎖的分子標記WY6-8和T6，對育種群體的DNA進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測，如擴增出對應(yīng)大小的DNA片段，則標志著Pi2-1基因的存在；

所述分子標記WY6-8上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列為SEQ ID No.2所示；所述分子標記T6上游引物序列為SEQ ID No.3所示，下游引物序列為SEQ ID No.4所示。

進一步的：所述PCR擴增反應(yīng)體系為：20ng/μL的DNA模板1μL，2pmol/μL所述分子標記引物1μL，10×Buffer 1μL，2.5mM dNTPs 0.2μL，5U/μL的rTaq 0.1μL，ddH₂O 6.7μL；反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55～58℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃再延伸7min。

本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供所述的一種水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子標記方法在選育水稻抗稻瘟病品種中應(yīng)用。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明采用水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子標記方法，該方法是應(yīng)用篩選到的與水稻廣譜持久抗性品種TY第6號染色體上定位到的稻瘟病抗性基因Pi2-1緊密連鎖的2個分子標記，它們能有效預(yù)測水稻育種群體的稻瘟病抗性，加快抗病品種的選育速度。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明Pi2-1基因連鎖圖譜；

圖2是本發(fā)明WY6-8和T6電泳圖；A：TY；B：R006；1…46：TY/R006BC₁F₂株系；M：Low ladder。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

供試材料

本實施例的水稻材料為：以湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻基因組學(xué)實驗室所提供的TY和高感病品種CO39及其兩者雜交的F₂群體為試驗材料。

本實施例的稻瘟病菌菌株：318-2，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻基因組學(xué)實驗室保存提供。

育苗

試驗于4月20日播種，將TY、CO39和TY/CO39F₂群體種子于37℃浸種(兩干兩濕)，露白后間隔播種于育秧盤中，溫室育苗，育苗土為購買的營養(yǎng)土。當幼苗在接種前一周(二葉期)時，施少量氮肥(2g/盤)。

稻瘟病菌菌株的培養(yǎng)

菌絲體生長：將已純化的稻瘟病菌株分別接種于燕麥-西紅柿平板培養(yǎng)基(燕麥-西紅柿培養(yǎng)基的配制方法：稱取燕麥片30g，放入攪拌機中，加600mL蒸餾水，將其攪碎，紗布過濾去掉殘渣，再加入200mL西紅柿汁，最后加入瓊脂粉20g，蒸餾水定容至1L，分裝到3個三角燒瓶中，滅菌后倒成平板培養(yǎng)基備用)上培養(yǎng)，將接種后的平板培養(yǎng)基放入26℃恒溫箱中，黑暗培養(yǎng)7～10天，至菌絲覆蓋整個平板培養(yǎng)基時，加入3～5mL的滅菌水，用棉簽將菌絲輕輕刮掉，使其從營養(yǎng)生長變成生殖生長。

稻瘟病孢子培養(yǎng)：將菌絲刮掉后的平板培養(yǎng)基放置在智能光照培養(yǎng)箱中，24h光照培養(yǎng)，溫度控制在26～28℃，4～7天之后等到產(chǎn)孢充分，每個平板培養(yǎng)基用20mL含有0.02％Tween20的無菌水洗下孢子，過濾到盛有滅菌水的燒杯中，經(jīng)攪拌制成接種懸浮液，其濃度為每毫升20～30萬個孢子。用血小球計數(shù)板觀察稻瘟病菌孢子的數(shù)量，接種濃度為在100倍顯微鏡下，平均每個視野的孢子數(shù)量20～30個孢子。

稻瘟病菌株的接種

當幼苗生長至三葉一心時，將育秧盤放入塑料保濕箱中，然后將保濕箱移至專用接種室內(nèi)進行接種，接種室內(nèi)設(shè)有空調(diào)、加濕器、植物生長燈等設(shè)備以保證室內(nèi)有適宜的溫度(26～28℃)和濕度(80～95％)。用噴霧器將適宜濃度的接種懸浮液，以氣霧的形式均勻噴灑在秧苗上，使每個葉片都布滿均勻的霧點。接種完后，將保濕箱放置在專用接種室內(nèi)，黑暗保濕24h(秧苗以26～28℃和保持葉片上有水珠的濕度條件為佳)，而后移出室外，正常光照周期進行培養(yǎng)，并注意保溫、保濕，確保病斑的正常擴展。

稻瘟病抗性調(diào)查

一般接種7天后即可進行病情鑒定，或當感病對照品種達到高度發(fā)病時調(diào)查。以國際水稻所0～9級評判標準為依據(jù)，逐株鑒定和記載，分級標準：0級，無病斑；1級，僅有小的針尖大小的褐點；2級，較大褐點；3級，直徑1～2mm圓形稍大灰色病斑，邊緣褐色；4級，1～2mm灰色紡錘形病斑，通常局限于2條葉脈之間；5級，灰色梭形病斑，受害面積為葉面積的4％～10％；6級，灰色梭形病斑，受害面積為葉面積的11％～25％；7級，灰色梭形病斑，受害面積為葉面積的26％～50％；8級，灰色梭形病斑，受害面積為葉面積的51％～75％；9級，灰色梭形病斑，受害面積大于葉面積的75％或葉片全部枯死。統(tǒng)計分析時，0～3級為抗病類型(R)，4～9級為感病類型(S)。通過抗性調(diào)查，總共獲得極端感病群體1019株。

稻瘟病抗性基因Pi2-1的精細定位

為了精細定位稻瘟病抗性基因Pi2-1，將初步定位目的區(qū)間的9311和NPB基因組序列進行Alignment比對，重新設(shè)計了7對分子標記，其中，分子標記WY6-3、WY6-5、WY6-8和T6在TY和高感品種CO39兩個親本之間存在多態(tài)性(表1)。分別利用這4對多態(tài)標記和初步定位采用的5對多態(tài)標記【天津野生稻稻瘟病抗性的遺傳分析與抗瘟基因Pi2-1的初步定位，王悅等，2013，39(1)，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)】，對1019個感病單株進行基因型分析，最終將Pi2-1基因定位在WY6-8和T6之間，前者有2個重組子，后者發(fā)現(xiàn)1個重組子，兩個標記之間的遺傳距離為0.2cM(圖1)。

表1水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1位點引物信息

實施例2

供試材料

本實施例的供試材料為：TY與水稻恢復(fù)系品種R006回交構(gòu)建近等基因系，獲得BC₁F₁，BC₁F₁套袋自交獲得BC₁F₂。

供試的TY、R006和46個TY/R006BC₁F₂株系的種子，預(yù)先在37℃浸種(兩干兩濕)，露白后，播種于塑料育秧盤中。育苗土采用市面上購買的營養(yǎng)土，溫室育苗。當幼苗在三葉一心時，兩親本及BC₁F₂各株系分別取1g的嫩葉，采用CTAB方法提取基因組DNA。

用上述與稻瘟病抗性基因Pi2-1緊密連鎖的分子標記WY6-8(正向引物：5，-TCGAAAATTGGTGAGGAGGA-3，，反向引物：5，-GTGCCCGACGCATGATGACT-3，)和T6(正向引物：5，-GATCGGTCACGCATAGAGG-3，，反向引物：5，-CCACCCATCCCAACAACAC-3，)擴增兩個親本和46個BC₁F₂株系的基因組DNA檢測BC₁F₂各株系的稻瘟病抗性。

PCR反應(yīng)體系為：PCR擴增總體積為10μL，其中，DNA模板(20ng/μL)1μL，引物(2pmol/μL)1μL，10×Buffer 1μL，10mM dNTPs(2.5mM)0.2μL，rTaq(5U/μL)0.1μL，ddH₂O 6.7μL。

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5min；接下來35個循環(huán)：95℃變性30s，55～58℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃再延伸7min，4℃保存。

結(jié)果表明：與稻瘟病抗性基因Pi2-1緊密連鎖的分子標記WY6-8(正向引物：5，-TCGAAAATTGGTGAGGAGGA-3，，反向引物：5，-GTGCCCGACGCATGATGACT-3，)和T6(正向引物：5，-GATCGGTCACGCATAGAGG-3，，反向引物：5，-CCACCCATCCCAACAACAC-3，)在9、13、17、25、39等5個BC1F2株系中均能用電泳檢測到與水稻品種TY相同的帶型，即含有稻瘟病抗性基因Pi2-1，是水稻抗稻瘟病株系。

實施例3

將上述實施例2中的TY和R006兩個親本和46個TY/R006BC₁F₂株系分別種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻基因組學(xué)實驗室和湖南省國家稻瘟病抗性鑒定中心(桃江)，分別進行室內(nèi)稻瘟病人工接種抗性鑒定和田間自然誘發(fā)抗性鑒定。

人工接種抗性鑒定方法參照【天津野生稻稻瘟病抗性的遺傳分析與抗瘟基因Pi2-1的初步定位，王悅等，2013，39(1)，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)】，田間自然誘發(fā)抗性鑒定方法參照【湘資3150微效抗瘟性基因鑒定，黃紅梅等，2011，41(5)，植物病理學(xué)報】

利用與稻瘟病抗性基因Pi2-1緊密連鎖的分子標記WY6-8和T6檢測抗稻瘟病育種群體的方法與室內(nèi)人工接種鑒定和田間自然誘發(fā)鑒定的結(jié)果一致，說明本發(fā)明利用稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子標記方法準確性高。

表2利用分子標記改良水稻恢復(fù)系R006稻瘟病抗性鑒定結(jié)果

A：基因型與TY相同的帶型；B：基因型與R006相同的帶型；H：TY/R006的雜合子帶型。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 水稻稻瘟病抗性基因Pi2-1的分子標記方法及應(yīng)用

<130> 權(quán)利要求書、說明書

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> WY6-8正向引物

<400> 1

tcgaaaattg gtgaggagga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> WY6-8反向引物

<400> 2

gtgcccgacg catgatgact 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> T6正向引物

<400> 3

gatcggtcac gcatagagg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> T6反向引物

<400> 4

ccacccatcc caacaacac 19