本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)檢測牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的單核苷酸多態(tài)性的方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的變化而引起的多態(tài)性，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。SNP屬于第三代分子標(biāo)記，具有密度高、雙等位基因、易實現(xiàn)自動化檢測等優(yōu)點。由于SNP具有其它標(biāo)記無法比擬的優(yōu)點，所以它作為一種研究工具已經(jīng)在生命科學(xué)的各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

目前，檢測SNPs主要采用以下幾種方法，即DNA直接測序法、單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)(SSCP)、PCR-RFLP法等。其中，PCR-RFLP方法是一種檢測SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準(zhǔn)確性，又克服了費用昂貴、操作繁瑣、假陽性的缺點。

分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇(molecular mark-assist selection,MAS)，是借助DNA分子標(biāo)記對遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良。在畜禽育種中，通過對生長性狀密切相關(guān)的、并且與數(shù)量性狀緊密關(guān)聯(lián)的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。

PCAF又名KAT2B，為p300/CBP相關(guān)因子，是一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，具有乙酞基轉(zhuǎn)移酶活性，在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活、細(xì)胞循環(huán)阻滯和體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化中起重要作用。PCAF參與前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，提示PCAF可能調(diào)控牛的脂肪分化與沉積，影響牛的生長性狀。

目前，關(guān)于牛PCAF基因遺傳變異的研究，在中國牛群中尚未見相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測牛PCAF基因單核苷酸多態(tài)性的RFLP方法及試劑盒，可用于牛分子育種中的標(biāo)記輔助選擇，進(jìn)行早期選擇，從而加快良種選育速度。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種檢測牛PCAF基因單核苷酸多態(tài)性的RFLP方法，包括以下步驟：以包含PCAF基因的待測牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2和P3為引物，分別PCR擴(kuò)增含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的單核苷酸多態(tài)位點的PCAF基因片段；然后采用限制性內(nèi)切酶HindIII、ApaI和ApaI分別消化含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的單核苷酸多態(tài)位點的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，鑒定牛PCAF基因在第61908位、第62131位和第73406位三個SNP位點的多態(tài)性。所述的牛PCAF基因單核苷酸多態(tài)性即包括：第61908位的T>C(g.T61908C)、第62131位的T>C(g.T62131C)、第73406位的C>T(g.C73406T)的堿基多態(tài)性。

所述的引物對P1、P2和P3序列信息如表1所示。

表1.PCR反應(yīng)的引物信息

所述的PCR擴(kuò)增條件為：25μL反應(yīng)體系包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix(內(nèi)含Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs、Buffer等)，1μL(50ng/μL)牛血液基因組DNA，10μmol/L的P1、P2或P3對應(yīng)上、下游引物各0.5μL和滅菌超純水10.5μL。

所述的PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸30s，退火溫度在每個循環(huán)降低1℃，共18個循環(huán)；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，25個循環(huán)；72℃延伸10min。

所述的限制性內(nèi)切酶的酶切體系為：PCR產(chǎn)物5μL，10×T Buffer 1.0μL，0.1％BSA 1.0μL，HindIII/ApaI(15U/μL)0.2μL，ddH₂O 2.7μL，酶切消化條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化8～10h。

所述的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為3.0％。

所述的根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果鑒定牛PCAF基因第61908位多態(tài)性為：TT基因型表現(xiàn)為21bp和57bp的條帶；CC基因型表現(xiàn)為78bp的條帶；TC基因型表現(xiàn)為78bp，57bp和21bp的條帶。

所述的根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果鑒定牛PCAF基因第62131位的單核苷酸多態(tài)性為：CC基因型表現(xiàn)為191bp和27bp的條帶；TT基因型表現(xiàn)為218bp的條帶；TC基因型表現(xiàn)為218bp的條帶，191bp和27bp的條帶。

所述的根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果鑒定牛PCAF基因第73406位的單核苷酸多態(tài)性為：CC基因型表現(xiàn)為287bp和27bp的條帶；TT基因型表現(xiàn)為314bp的條帶；CT基因型表現(xiàn)為314bp，287bp和27bp的條帶。

以GenBank Accession No.AC_000158.1為參考，檢測的牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位3個SNPs與牛多種重要生長性狀相關(guān)。

一種檢測牛PCAF基因單核苷酸多態(tài)性的RFLP試劑盒，包括用于分別擴(kuò)增包含牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位的SNP位點的PCAF基因片段的引物對P1、P2和P3，如表1所示。

所述試劑盒還包括12.5μL的2×Taq PCR MasterMix(內(nèi)含Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、dNTPs、Buffer等)和滅菌超純水10.5μL

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明提供的牛PCAF基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法，針對第61908位的內(nèi)含子13中T到C的突變，PCR擴(kuò)增PCAF基因內(nèi)含子13區(qū)78bp的基因片段后，當(dāng)由T突變成C時，不能形成HindIII識別位點，不能被切開；而沒有發(fā)生突變時，則含有HindIII識別位點，可以被酶切形成21bp和57bp大小的條帶。

本發(fā)明提供的牛PCAF基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法，針對第62131位和第73406位的T與C之間的突變，PCR擴(kuò)增PCAF基因內(nèi)含子13區(qū)和3’UTR的目的片段后，當(dāng)多態(tài)位點為C堿基時，則形成ApaI識別位點，可分別被ApaI酶切形成191bp、27bp大小的條帶和287bp、27bp大小的條帶；而多態(tài)位點為T堿基時，則不能被ApaI酶切，則分別為218bp和314bp大小的條帶。

因此，本發(fā)明中利用的HindIII、ApaI可快速鑒定3個多態(tài)位點，從而簡單、快速、成本低、精確地檢測牛PCAF基因單核苷酸的多態(tài)性，可用于牛的分子育種，便于肉牛生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的肉牛種群。

附圖說明

圖1是牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位多態(tài)位點的測序圖。

圖2是牛PCAF基因DNA片段及引物序列圖，其中A、B、C分別為第61908位、第62131位、第73406位多態(tài)位點。圖2A中上游引物中把原序列的G突變成A(加框)引入HindIII酶切位點(A^AGCTT)；斜體加框為第61908位T突變成C的多態(tài)位點。圖2B中上游引物中把原序列的T突變成G(加框)引入ApaI酶切位點(GGGCC^C)；斜體加框為第62131位T突變成C的多態(tài)位點。圖2C中上游引物中把原序列的C突變成G(加框)引入ApaI酶切位點(GGGCC^C)；斜體加框為第73406位C突變成T的多態(tài)位點。

圖3是牛PCAF基因酶切電泳結(jié)果圖，其中A、B、C分別為第61908位、第62131位、第73406位多態(tài)位點PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明首先根據(jù)NCBI公布的牛PCAF基因序列(GenBank Accession No.AC_000158.1)設(shè)計引物，分別以3個中國牛類群的基因組DNA池為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對其純化，測序。然后，進(jìn)行測序圖分析和序列比對篩查出SNP位點；其次，利用PCR-RFLP方法對待測群體進(jìn)行多態(tài)位點檢測；最后，根據(jù)在群體中檢測到的基因型，進(jìn)行群體遺傳統(tǒng)計分析和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析，篩選出與牛生長性狀密切相關(guān)的分子標(biāo)記。

1、牛樣本采集

本發(fā)明具體以3個中國牛類群作為檢測對象，具體采集樣本見表2，采集時間為2015年10月：秦川牛(69頭)、福牛(52頭)、牦牛(48頭)。福牛是牦牛與柴達(dá)木黃牛雜交所產(chǎn)生的雌犏牛，再與安格斯公牛交配所產(chǎn)生的后裔群體；

表2.牛樣本的采集

2、基因組DNA的分離、提取、純化

參考文獻(xiàn)Sambrock et al(2002)方法。

3、擴(kuò)增引物設(shè)計

以NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牛PCAF基因序列(GenBank Accession No.AC_000158.1)為參考序列，利用Primer 5.0設(shè)計PCR引物分別擴(kuò)增PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位多態(tài)位點(參見圖1)的目的片段，由上海生工生物工程有限責(zé)任公司合成PCAF基因3對引物P1、P2、P3，其引物對序列信息見表1。

上游引物F1中，把原序列的G突變成A引入HindIII酶切位點(A^AGCTT)；上游引物F2中，把原序列的T突變成G引入ApaI酶切位點(GGGCC^C)，上游引物F3中，把原序列的C突變成G引入ApaI酶切位點(GGGCC^C)；從而分別人為構(gòu)建了HindIII、ApaI、ApaI的酶切位點，可使用PCR-RFLP方法進(jìn)行基因型的判定(參見圖2)。

4、PCR擴(kuò)增

分別以3個品種共169頭牛的基因組DNA為模版，用上述設(shè)計的引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個1.5mL離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系見表3：

表3.PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序：

5、PCR產(chǎn)物酶切

對含牛PCAF基因第61908位的單核苷酸多態(tài)位點的PCR產(chǎn)物進(jìn)行HindIII酶切，對含牛PCAF基因第62131位的單核苷酸多態(tài)位點的PCR產(chǎn)物進(jìn)行ApaI酶切，對含牛PCAF基因第73406位的單核苷酸多態(tài)位點的PCR產(chǎn)物進(jìn)行ApaI酶切，然后根據(jù)電泳結(jié)果判定其SNP多態(tài)性。

1)酶切體系為10μL：包括5μL PCR產(chǎn)物，10×Buffer 1μL，0.1％BSA 1.0μL，限制性內(nèi)切酶3U，滅菌超純水2.7μL；

2)酶切消化條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化8～10h；

6、瓊脂糖凝膠電泳分析

1)制作3.0％的瓊脂糖凝膠(已經(jīng)加入核酸染料)，點樣后120V電壓電泳40min；

2)待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)成像；

3)根據(jù)凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果，對各樣品進(jìn)行判型、記錄其基因型。

牛PCAF基因第61908位的單核苷酸多態(tài)性為(參見圖3A)：TT基因型表現(xiàn)為21bp和57bp的條帶；CC基因型表現(xiàn)為78bp的條帶；TC基因型表現(xiàn)為78bp，57bp和21bp的條帶。其中由于21bp條帶較小，故在瓊脂糖電泳分析中不易觀察到，但通過78bp和57bp條帶還是能夠準(zhǔn)確的鑒別CC基因型、TC基因型和TT基因型。

牛PCAF基因第62131位的單核苷酸多態(tài)性為(參見圖3B)：CC基因型表現(xiàn)為191bp和27bp的條帶；TT基因型表現(xiàn)為218bp的條帶；TC基因型表現(xiàn)為218bp，191bp和27bp的條帶。其中由于27bp條帶較小，故在瓊脂糖電泳分析中不易觀察到，但通過218bp和191bp條帶還是能夠準(zhǔn)確的鑒別CC基因型、TC基因型和TT基因型。

牛PCAF基因第73406位的單核苷酸多態(tài)性為(參見圖3C)：CC基因型表現(xiàn)為287bp和27bp的條帶；TT基因型表現(xiàn)為314bp的條帶；CT基因型表現(xiàn)為314bp，287bp和27bp的條帶。其中由于27bp條帶較小，故在瓊脂糖電泳分析中不易觀察到，但通過314bp和287bp條帶還是能夠準(zhǔn)確的鑒別CC基因型、CT基因型和TT基因型。

7、牛PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位SNP位點的頻率統(tǒng)計分析

1)基因和基因型頻率

基因型頻率是指一個群體中某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位點的AA基因型頻率；N_AA表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)；N為檢測群體的總數(shù)量。

基因頻率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式可以寫成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+N_Aa3+N_Aa4+……+N_Aan)/2N，式中P_A表示等位基因A頻率，N_AA表示群體中具有AA基因型的個體數(shù)量，N_Aai表示群體中具有Aai基因型個體數(shù)量，a1－an為等位基因A的n個互不相同的復(fù)等位基因。

在3個牛類群PCAF基因的第61908位、第62131位和第73406位SNP中，基因型頻率及等位基因頻率如表4所示。

表4.牛PCAF基因SNP的基因型和等位基因頻率

8、牛PCAF基因SNP效應(yīng)分析

基因型數(shù)據(jù)：PCAF基因第61908位、第62131位和第73406位SNPs的基因型。

生長數(shù)據(jù)：福牛(母)6月齡體長、管圍、十字部高；秦川牛(母)24月齡體高、胸寬、腰角寬、十字部高；牦牛(公)24月齡體重。

關(guān)聯(lián)分析模型：先對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值；再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正；根據(jù)數(shù)據(jù)特征，應(yīng)用SPSS 19軟件分析各基因型間的生長性狀效應(yīng)。在對基因型效應(yīng)進(jìn)行分析時采用了固定模型：

Y_ijk＝μ+G_j+e_ijk，

其中：Y_ijk為性狀觀察值，μ為總體均值，G_j為第j個單SNP標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)，e_ijk為隨機(jī)誤差。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明(見表5)：牛PCAF基因第61908位SNP與福牛體長顯著相關(guān)(P<0.05)，優(yōu)勢基因型為TT；第62131位SNP與秦川牛胸寬、體高、腰角寬和十字部高顯著相關(guān)(P<0.05)，CC基因型的表型分別顯著低于其他兩種基因型，且該SNP與福牛管圍極顯著相關(guān)(P<0.01)，而雜合子TC顯著低于純合子CC和TT；第73406位SNP則與牦牛體重極顯著相關(guān)(P<0.01)。由此可見，PCAF基因的這3個SNP位點對牛生長發(fā)育有重要影響，TT基因型可以作為一個提高牛生長性狀的候選分子遺傳標(biāo)記。

表5.PCAF基因3個SNPs與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

核苷酸序列表

<110> 西北農(nóng)林科技大學(xué)

<120> 一種檢測牛PCAF基因單核苷酸多態(tài)性的RFLP方法及試劑盒

<160> 6

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggttcccac tgcacaggcc aagct 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtccatcaga cgcccccaca cagag 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

accttcaagg ccttttacat gcggg 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tcaaagagga atggacacag gcaga 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctcttcccag tctcactttt gtggg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aggcacactg tttgatgagt ttcta 25