專利名稱：檢測bcrp基因中g(shù)34a和c421a兩個位點基因型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用熒光定量PCR的方法測定人類乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)基因中 G34A和C421A兩個位點基因型的方法。

背景技術(shù)：
作為"第三代DNA遺傳標(biāo)記"的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記SNP (single皿cleotide Poly =rphismS， SNP)具有位點豐富、具代表性、遺傳穩(wěn)定性和分析自動化的等特點，是研究藥 物基因組學(xué)的分子基礎(chǔ)。人類基因序列的變異大多數(shù)是SNP，但在不同的人群中SNP的分布 存在差異，這些差異可以代表某一種族或某人群間的遺傳變異.因此，研究SNP有助于解釋 個體的表型差異、不同群體和個體對疾病，特別是對復(fù)雜疾病的易感性以及對各種藥物的 耐受性和對環(huán)境因素反應(yīng)的差異。如果確定了某SNP的基因型與某種腫瘤易感性的強相關(guān) 關(guān)系，就可以此SNP作為分子遺傳標(biāo)記，進行分子標(biāo)記診斷，在流行病學(xué)調(diào)查中確定患某種 腫瘤的高危人群，以及進行患病危險程度評價，達到有效的一級預(yù)防目的。
BC RP < A BCG2基因位于染色體22，由655個氨基酸組成，編碼72_kDa的跨膜蛋 白。BCRP抗體在胎盤上皮、腸上皮、乳腺導(dǎo)管等處表達。從結(jié)構(gòu)上看，它只有一個ATP結(jié)合 區(qū)、一個跨膜區(qū)，與MDR基因不同。構(gòu)造上的獨特提示其藥物轉(zhuǎn)運機制可能與其它ABC轉(zhuǎn)運 蛋白不同。BCRP基因表達增加可以在多種不同類型的耐藥腫瘤中觀察到。
由于BCRP基因G34A(Vail2Met)和C421A(Glnl41Lys)多態(tài)性存在較高頻率且高 發(fā)于大多數(shù)種族人群中，研究發(fā)現(xiàn)它的表達與BCRP蛋白活性有關(guān)。不同基因型所表達的 BCRP蛋白活性也不盡相同，在人胎盤組織中，421A等位基因純合子的蛋白水平比421C等位 基因純合子要低很多，同時雜合子則介于中間水平與野生等位基因型對比，34A和42A等位 基因變異可降低BCRP轉(zhuǎn)運蛋白活性。許多研究結(jié)果顯不BCRP基因G34A和C421A多態(tài)性 與DLBCL易感和生存相關(guān)。 本發(fā)明通過設(shè)計特殊的熒光定量PCR的核酸引物和探針來檢測BCRP基因G34A和 C421A位點的多態(tài)性，避免了測序的繁瑣過程，從而可以更加準(zhǔn)確、快速、方便地實現(xiàn)基因型 的檢測。 發(fā)明概述 本發(fā)明提供了一種用于測定人類乳腺癌耐藥蛋白基因(BCRP)中G34A和C421A兩 個位點基因型的方法，該方法通過一組特殊的、用于熒光定量PCR反應(yīng)的探針，對包括血液 樣本在內(nèi)的多種樣本進行處理，分析其結(jié)果而判斷出基因型。
附圖簡述 圖l.樣本中BCRP基因G34A位點G/A基因型的兩種探針的熒光定量PCR的圖形。
圖2.樣本中BCRP基因G34A位點G/G基因型的兩種探針的熒光定量PCR的圖形。
圖3.樣本中BCRP基因G34A位點A/A基因型的兩種探針的熒光定量PCR的圖形。
圖4.樣本中BCRP基因C421A位點C/A基因型的兩種探針的熒光定量PCR的圖形。
圖5.樣本中BCRP基因C421A位點C/C基因型的兩種探針的熒光定量PCR的圖形。
發(fā)明詳述
3
本發(fā)明提供了在人類細(xì)胞、組織和包括血清和唾液在內(nèi)的體液中檢測BCRP基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法。 在實施方案中，本發(fā)明提供了一種測量血液樣本中BCRP基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法，該方法通過使用熒光定量PCR，利用兩組特殊探針對樣本進行處理，其中每種探針都只會與一種特定的基因型核酸結(jié)合，通過對這一組探針對同一樣本處理的結(jié)果判斷G34A和C421A兩個位點的基因型。通過測序證實基于這種方法的判斷是準(zhǔn)確的。
實施例 以下的實施例用于為本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員提供有關(guān)如何實施和使用本發(fā)明的完整披露和描述，并且這些例子并非意在對本發(fā)明者所認(rèn)為的發(fā)明范圍進行限制，亦非意指下文的實驗是被實施的全部實驗而且是僅可實施的實驗。 實施例1 :血滴樣本中BCRP某因G34A位點G/A某因型的兩種探針的熒光定量PCR白勺賺。 我們分別使用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的核酸引物及SEQID NO. 6和SEQ IDNO. 7的核酸探針，使用熒光定量PCR對同一樣本進行處理，得到

圖1中的一組圖形，判斷該樣本G34A位點的基因型為G/A。該結(jié)果通過測序得到確證。 實施例2 :血液樣本中BCRP某因G34A位點G/G某因型的兩種探針的熒光定量PCR白勺賺。 我們分別使用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的核酸引物及SEQID NO. 6和SEQ IDNO. 7的核酸探針，使用熒光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該樣本G34A位點的基因型為G/G。該結(jié)果通過測序得到確證。 實施例3 :血液樣本中BCRP基因G34A位點A/A基因型的兩種探針的熒光定暈PCR的圖形。 我們分別使用SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的核酸引物及SEQID NO. 6和SEQ IDNO. 7的核酸探針，使用熒光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該樣本G34A位點的基因型為A/A。該結(jié)果通過測序得到確證。 實施例4 :血液樣本中BCRP基因C421A位點C/A基因型的兩種探針的熒光定暈PCR的圖形。 我們分別使用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的核酸引物及SEQID NO. 8和SEQ IDN0.9的核酸探針，使用熒光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該樣本C421A位點的基因型為C/A。該結(jié)果通過測序得到確證。 實施例5 :血液樣本中BCRP基因C421A位點C/C基因型的兩種探針的熒光定暈PCR的圖形。 我們分別使用SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5的核酸引物及SEQIDNO. 8和SEQ ID
N0.9的核酸探針，使用熒光定量PCR對同一樣本進行處理，得到圖1中的一組圖形，判斷該
樣本C421A位點的基因型為C/C。該結(jié)果通過測序得到確證。 序列表 〈110〉天津腫瘤醫(yī)院 〈120〉檢測BCRP基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法
〈130〉〈150〉
〈151〉2008-12-19
〈160〉9
〈210〉1
〈211〉2418
〈212〉DNA
〈213〉人BCRP序列〈400〉1ggg鄉(xiāng)鄉(xiāng)cggtggtcttgatcccaacattcctgagcctgtcttccagtcgcgacagctcatctgctat
C3C3ggtgg3
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6
〈400>65' -tccttgtgacactgg-3'〈210>7〈211>17〈212>DNA〈213〉人BCRP探針<400>75' _tttccttgtgacattgg_3，〈210>8〈211〉16〈212>DNA〈213〉人BCRP探針〈400>85， -ctgctgagaactggaa-3，〈210>9〈211>17〈212>醒〈213〉人BCRP探針〈400>95， 一ctgctgag朋ctgt朋g-3，
權(quán)利要求
一種用于測定人類乳腺癌耐藥蛋白基因(BCRP)中G34A和C421A兩個位點基因型的方法，該方法包括(a)以二種人類BCRP特異性化合物與人類細(xì)胞相接觸從而形成二種化合物-BCRP的多復(fù)合物；以及(b)通過檢測該復(fù)合物的存在及其比例而對該細(xì)胞BCRP中G34A和C421A兩個位點基因型進行測定；其中BCRP特異性化合物選自結(jié)合BCRP的核酸引物和探針，所述核酸引物和探針包括反義寡聚物、siRNA以及shRNA，這些探針應(yīng)與BCRP DNA雜交，其中BCRP的核酸序列為SEQ ID No1，或者任何與Seq ID No1具有至少80％相同性的序列。
2. 權(quán)利要求l中的方法，其中細(xì)胞選自腎上腺細(xì)胞、腦細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、上皮 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟細(xì)胞、免疫細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、肝細(xì)胞、肺細(xì)胞、卵巢細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、前列 腺細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、脾細(xì)胞、胃細(xì)胞、睪丸細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、子宮細(xì)胞和脈管細(xì)胞、癌細(xì)胞或 處于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中上皮細(xì)胞選自內(nèi)皮細(xì)胞、非膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞、結(jié)腸細(xì)胞、乳腺 細(xì)胞、腎臟的近小管細(xì)胞、前列腺的平滑肌細(xì)胞、子宮的平滑肌細(xì)胞以及睪丸的平滑肌細(xì) 胞。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中免疫細(xì)胞選自多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮樣 細(xì)胞、巨大細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞。
5. 權(quán)利要求2的方法，其中該癌細(xì)胞選自肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌、類癌瘤、胃癌、神 經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、頭頸癌、陰道或睪丸癌、腦 瘤、子宮頸癌、食道癌、淋巴瘤、惡性黑素瘤、間皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲 狀腺癌、腎細(xì)胞癌、眼癌、橫紋肌肉瘤、肉瘤、未分化瘤以及白血病。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中該處于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞選自膠質(zhì)纖維原細(xì)胞、膠質(zhì)單 核細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞。
7. 權(quán)利要求2的方法，其中用于測定BCRP基因中G34A位點基因型的核酸引物序列為 SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3，用于測定BCRP基因中C421A位點基因型的核酸引物序列為 SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5。
8. 權(quán)利要求2的方法，其中用于測定BCRP基因中G34A位點基因型的核酸探針序列為 SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7，用于測定BCRP基因中C421A位點基因型的核酸探針序列為 SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用熒光定量PCR的方法測定人類乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)基因中G34A和C421A兩個位點基因型的方法。
文檔編號C12Q1/02GK101760516SQ20081018831
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日 公開號200810188315.8
發(fā)明者閻昭 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院