專利名稱：一種定性檢測hla-b*1502基因亞型的熒光pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外核酸檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種在臨床樣本中區(qū)分HLA-B基因中的1502基因亞型的熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑盒。
背景技術(shù)：
HLA(human leukocyte ant igen,人類白細胞抗原)系統(tǒng)是目前所知人體最復(fù)雜的多態(tài)系統(tǒng)。自1958年發(fā)現(xiàn)(Jean Dausset)第一個HLA抗原，到20世紀70年代，HLA便成為免疫遺傳學(xué)、免疫生物學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的ー個重要新興研究領(lǐng)域。HLA是具有高度多態(tài)性的同種異體抗原，其化學(xué)本質(zhì)為ー類糖蛋白。HLA按其分布和功能分為I類抗原和II類抗原。HLA I類抗原，由HLA-A、B、C位點編碼；HLAII類抗原受控于HLA-D區(qū)(包含5個亞區(qū))。以上各基因(名稱為WHO命名委員會1975年修訂)均系多態(tài)性位點(復(fù)等位)，且共顯性。如果把MHC作為ー個整體來看待，其多態(tài)性則更為突出。保守地估計，至少存在1300個不同的單體型，相應(yīng)地約有17X107個基因型。這就是除同卵雙生子以外幾乎無HLA相同者的遺傳基礎(chǔ)，從而HLA可視作個體的“身份證”。近年的研究表明，HLA-B的基因多態(tài)可能與癲癇患者服用芳香族抗癲癇藥物后發(fā)生的嚴重不良反應(yīng)相關(guān)。在眾多HLA-B等位基因與SJS/TEN關(guān)聯(lián)性的研究中，HLA_B*1502基因型是關(guān)注的熱點之一。Locharernkul C等在泰國人群中對10例服用芳香族抗癲癇藥物發(fā)生嚴重不良反應(yīng)和50例健康對照組進行HLA2B等位基因分型發(fā)現(xiàn)，HLA-B等位基因HLA-B^l502與芳香族抗癲癇藥物所致的嚴重不良反應(yīng)相關(guān)，此結(jié)果與Chung WH、Hung SI、Man CB等在香港、臺灣的人群的研究結(jié)果一致,而Lonjou C等對高加索人群的研究未能得出上述結(jié)論。因此，HLA-B*1502多態(tài)與芳香族藥物所致嚴重不良反應(yīng)是否相關(guān)，以及能否作為芳香族抗癲癇藥物不良反應(yīng)易感性標志，成為抗癲癇藥物安全用藥領(lǐng)域的熱點問題。現(xiàn)在社會對于藥物不良反應(yīng)的重視程度越來越高，所以檢測1502基因亞型成了卡馬西平用藥指導(dǎo)也有了一定的趨勢。針對HLA主要是借助血清學(xué)、細胞學(xué)或分子生物學(xué)方法檢測個體的HLA抗原特異性或HLA基因型。目前常規(guī)采用血清學(xué)方法進行HLA-B的分型，但由于高質(zhì)量的抗血清難于獲得及抗血清之間存在較多的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致血清學(xué)分型結(jié)果錯誤和空白較多。PCR序列特異寡核苷酸探針(sequence specific oligonucleotide probe, SS0P)是近年發(fā)展起來的一種較有希望的HLA-DNA分型方法，但該方法操作較煩瑣，而且耗時長，這些缺陷在大批量樣品的檢測上尤其突出。由于我們主要針對的是單獨的1502基因亞型的分型，所以需要找到ー個相對準確、快速、簡單的方法。熒光PCR技術(shù)在1995年由美國PE公司率先研制成功，它兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點，結(jié)果直觀，能直接監(jiān)測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結(jié)果可實時觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了PCR產(chǎn)物污染的風險。熒光PCR技術(shù)的熒光探針以發(fā)展形成多種類型，如Taqman探針，F(xiàn)RET探針等，本方法涉及的是Taqman探針技術(shù)。其工作原理是它能被DNA合成酶(例如Taq酶)的5’一 3’酶切活性所降解，探針的5’端有ー熒光報告基團，3’端有一熒光淬滅基團，當兩個基團相互靠近的時候，由于發(fā)生能量傳遞作用，報告基團不能發(fā)出熒光，但隨著擴增反應(yīng)的進行，5’端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅發(fā)生能量傳遞作用，從而能發(fā)出熒光，被信號探測器所捕獲。常同探針5’端相結(jié)合的基團有FAM(6-羧基熒光素)，TET(四氯_6_羧基突光素)，JOE (2, 7- ニ甲基-4, 5- ニ氯-6-羧基突光素)，HEX (六氯-6-甲基突光素)或VIC等，常與3’端相結(jié)合的熒光淬滅基團常為TAMRA (6-羧基四甲基若丹明)或DABCYL (4-(4惡烷氨基苯偶氮)苯甲酸)等。目前市場上還沒有利用熒光PCR技術(shù)進行HLA-B基因分型的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性高、成本低并且能夠作分型檢測的定性檢測 HLA-B^l502基因亞型的熒光PCR試劑盒。為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案ー種定性檢測HLA-B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒，包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及熒光探針；所述PCR分型引物序列如SEQ ID NO :3_4和/ 或 SEQ ID NO :6-7 所示。進ー步地，所述熒光探針序列如SEQ ID NO :5和/或SEQ ID NO 8所示。進ー步地，所述試劑盒還包括陰性對照品和陽性對照品。進ー步地，所述陽性對照品為插入有如SEQ ID NO :1和/或SEQ IDNO :2，所述的核苷酸序列的重組質(zhì)粒。進ー步地，所述質(zhì)粒為HLA_B*1502質(zhì)粒。進ー步地，所述的陽性對照品的濃度為1.0父106-9.0父106拷貝/微升。進ー步地，所述的陽性對照品的濃度為5. OX IOltl拷貝/微升。進ー步地，所述陰性對照品為人的基因組DNA。進ー步地,所述突光探針為Taqman探針,標記探針5’端的突光報告基團為FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、TAMRA、CY3、CY5中的ー種；標記探針3’端的熒光猝滅基團為TAMRA、DABCYL、NFQ 中的ー種。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果I)本發(fā)明提供的定性檢測HLA_B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒定性準確，兼有PCR的高靈敏性、DNA雜交的特異性和光譜技術(shù)精確定量的優(yōu)點，結(jié)果直觀，能直接監(jiān)測PCR過程中的變化。與普通PCR相比，其結(jié)果可實時觀察，產(chǎn)物不需要凝膠電泳檢測，完全閉管操作，有效地降低了 PCR產(chǎn)物污染的風險；2)本發(fā)明提供的定性檢測HLA_B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒靈敏度和特異性高。由于采取特異性和引物和探針的雙保險設(shè)計，靈敏度和特異性均有很大提高，能在臨床癥狀出現(xiàn)之前檢測到病毒的感染；3)本發(fā)明提供的定性檢測HLA_B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒檢測速度快；4)本發(fā)明提供的定性檢測HLA_B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒步驟簡單；5)本發(fā)明提供的定性檢測HLA_B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒可同時進行高通量的樣本檢測。熒光PCR技術(shù)靈敏度高，特異性好，可實時監(jiān)測反應(yīng)進程，反應(yīng)時間短，而且是閉管操作，無需后續(xù)處理，可最大限度避免反應(yīng)產(chǎn)物污染，可以取代傳統(tǒng)細胞檢測。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，并配合附圖，作詳細說明如下。


圖I為臨床樣本的檢測結(jié)果分布圖；圖2為臨床純合子的擴增曲線；圖3為臨床雜合子的擴增曲線； 圖4為陰性對照的擴增曲線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進ー步的詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實施例I :試劑盒的制備I.引物和探針的設(shè)計與合成使用Primer Express 2· 0，針對HLA_B*1502的2號外顯子和3號外顯子以及中間的內(nèi)含子區(qū)域，研究表明目前針對HLA-B基因分型主要集中在這個區(qū)域(Hughes AL7NeiM.Pattern of nucleotide suostitution at MHC class I loci reveals overdominantselection. Nature，1988，335(6186) :167-170 ;Hughes AL, Yeager M. Natural selectionat major histo-compatibility complex loci of vertebrates. Annu Rev Genet，1998，32 :415-435 ；Gao X，Nelson GW, Karacki P，Martin MP, Phair J，Kaslow R，Goedert JJ,Buchbinder S，Hoots K，Vlahov D，Or Brien SJ, Carrington M. Effect of a singleamino acid change in MHC class I molecules on the rate of progres—sion to AIDS. NEngl J Med，2001，344(22) :1668-1675 ;徐筠娉，鄧志輝，鄒紅巖等，中國漢族個體HLA_A、_B基因全長序列的測定及調(diào)控區(qū)多態(tài)性。遺傳HEREDITAS(Beijing)，2010年7月，32(7)685-693)，篩選特異的突變位點，在選擇好的突變位點上進行熒光探針的篩選，在設(shè)計好熒光探針基礎(chǔ)上設(shè)計相應(yīng)的上下游引物。引物與熒光探針均委托專業(yè)公司合成，其中引物為PAGE純化，熒光探針為HPLC純化，標記探針5’端的熒光報告基團為FAM、TET、J0E、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5中的ー種；標記探針3’端的熒光猝滅基團為TAMRA、DABCYL、NFQ中的ー種。優(yōu)選地，熒光探針分別在5’端標記FAM熒光基團和VIC熒光基團，3’端標記TAMRA熒光基團。擴增序列如表I :表I.特異性熒光探針與引物序列
權(quán)利要求
1.一種定性檢測HLA-B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒，其特征在于，包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及熒光探針；所述PCR分型引物序列如SEQ IDNO :3-4 和 / 或 SEQ ID NO :6_7 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光探針序列如SEQID N0:5和/或 SEQ ID NO 8 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陰性對照品和陽性對照品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品為插入有如SEQIDNO :1和/或SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述質(zhì)粒為HLA-B*1502質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品的濃度為1·0Χ106-9·0Χ106 拷貝 / 微升。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品的濃度為5.OX 101°拷貝/微升。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照品為人的基因組DNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光探針為Taqman探針，標記探針5’端的熒光報告基團為FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY5中的一種；標記探針3’端的熒光猝滅基團為TAMRA、DABCYL、NFQ中的一種。
全文摘要
本發(fā)明提供一種定性檢測HLA-B*1502基因亞型的熒光PCR試劑盒，屬于體外核酸檢測領(lǐng)域，所述試劑盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR分型引物以及熒光探針；所述PCR分型引物序列如SEQ IDNO3-4和/或SEQ ID NO6-7所示。本發(fā)明提供的試劑盒靈敏度高，特異性好，可實時監(jiān)測反應(yīng)進程，反應(yīng)時間短，而且是閉管操作，無需后續(xù)處理，可最大限度避免反應(yīng)產(chǎn)物污染，可以取代傳統(tǒng)細胞檢測。
文檔編號G01N21/64GK102660635SQ201210010718
公開日2012年9月12日 申請日期2012年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月14日
發(fā)明者張璇 申請人:長沙三濟生物科技有限公司