Q-pcr法檢測(cè)aqp7基因的snp的多樣本多位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地涉及一種Q-PCR法檢測(cè)AQP7基因的SNP 的多樣本多位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，高血糖導(dǎo)致各種組織，特別是眼、 腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。除此外，其慢性并發(fā)癥還引起大血管病變（心 臟病、高血壓、腦血管意外及下肢血管病變）、微血管病變（糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎 ?。┖蜕窠?jīng)病變等嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的疾病。1型或2型糖尿病均存在明顯的遺傳異質(zhì) 性-即某些基因的特異性序列與該病緊密聯(lián)系。隨著中國(guó)GDP的增長(zhǎng)和人們生活水平的大 幅度提高，我國(guó)已成為世界第一糖尿病大國(guó)，全國(guó)有超過1億的患者，幾乎占了全球病人的 一半，每100個(gè)中國(guó)人中就有12個(gè)是患者。兒童發(fā)病率每10年翻一番。最令人擔(dān)憂的是， 我國(guó)18歲以上居民對(duì)于糖尿病知曉率僅為36. 1%，而且缺乏有效的篩查方法。
[0003] 糖尿病的發(fā)生是機(jī)體遺傳因素和外界環(huán)境因素相互作用、多基因參與、多步驟發(fā) 生的過程。近年研宄結(jié)果顯示，各分子事件之間存在以關(guān)鍵調(diào)控基因?yàn)橹匾?jié)點(diǎn)的多中心 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這些重要節(jié)點(diǎn)通過各種信號(hào)傳導(dǎo)通路參與正常糖代學(xué)，脂肪和甘油代謝，以及糖 異生這些復(fù)雜的代謝過程。目前糖尿病高危人群的大規(guī)模基因篩查暫為空白，臨床上也主 要依據(jù)血液學(xué)結(jié)果，而未應(yīng)用特征性分子事件變化對(duì)上述病變進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩查，無法為患 者提供個(gè)性化治療。
[0004] AQP7基因與糖尿病有緊密聯(lián)系。AQP蛋白廣泛存在于脂肪細(xì)胞膜上，專一的高效 轉(zhuǎn)運(yùn)甘油，而甘油則是脂肪動(dòng)員和糖異生過程中的重要原料。研宄表明，AQP7在哺乳動(dòng)物 的糖異生和抗饑餓過程中受分子信號(hào)調(diào)節(jié)，在基因表達(dá)水平有20倍的增高。至今發(fā)現(xiàn)AQP7 基因存在多個(gè)位點(diǎn)的多種SNP基因型，不同基因型影響到其蛋白對(duì)甘油的運(yùn)轉(zhuǎn)活性，進(jìn)而 影響脂肪動(dòng)員和糖異生。因此在人體內(nèi)，尤其是運(yùn)動(dòng)后或饑餓中，AQP7的SNP基因型對(duì)脂 肪動(dòng)員、甘油轉(zhuǎn)運(yùn)代謝、糖異生和能量平衡發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。AQP7缺失的小鼠在成年 后極易發(fā)生肥胖，導(dǎo)致糖尿病。
[0005] 我們發(fā)現(xiàn)，AQP7有兩個(gè)失活突變SNP，E40K和G264V，其突變后導(dǎo)致該基因的甘油 轉(zhuǎn)運(yùn)活性基本全部喪失。突變SNP則很可能擾亂正常的血糖水平，導(dǎo)致糖尿病的產(chǎn)生。
[0006] 目前，AQP7基因SNP的高效分析和功能鑒定為空白。由于當(dāng)前傳統(tǒng)的SNP基因型 測(cè)序法對(duì)資金和技術(shù)人員要求較高，單個(gè)樣品測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模篩查。我們迫切 需要開發(fā)一個(gè)快速高效的多位點(diǎn)SNP基因型鑒定方法，從分子機(jī)制上建立有效的糖尿病高 危人群篩查系統(tǒng)。以AQP7基因中兩個(gè)重要失活SNP，E40K和G264V為新型的生物標(biāo)記物和 藥物靶標(biāo)來早期診斷和有效治療糖尿病，預(yù)防肥胖，提高我國(guó)人民的生活質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種Q-PCR法檢測(cè)AQP7基 因的SNP的多樣本多位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和探針，通過快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)AQP7基因的SNP的多 樣本多位點(diǎn)，得到樣品中AQP7基因的SNP突變情況作為糖尿病高危人群篩查的標(biāo)志物。
[0008] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出一種Q-PCR法檢測(cè)AQP7基因的SNP 的多樣本多位點(diǎn)的擴(kuò)增引物和探針，所述AQP7基因的兩個(gè)待檢測(cè)SNP為E40K和G264V，所 述AQP7基因的定量PCR擴(kuò)增靶標(biāo)的引物和探針序列如下：
[0009] 對(duì)于 E40K :
[0010] HQ7E40K-GA Forward :5' CCGTGATAGCAAAGATCCAGGAAA 3'
[0011] HQ7E40K-GA Reverse :5' CCCACTCACCATCATGACATATGTG 3'
[0012] HQ7E40K-GA V2 VIC :5' CTCATGAACTCGGCC 3'
[0013] HQ7E40K-GA M2 FAM :5' CTCATGAACTTGGCC 3'；
[0014]對(duì)于 G264V:
[0015] HQ7G264V-GT Forward :5' CTCTTGCCTGCAGCAATGG 3'
[0016] HQ7G264V-GT Reverse :5' GCCAATGAAGACCAGGTAGATGATG 3'
[0017] HQ7G264V-GT VI Cy3 :5'ACTTCTGGGTGCCTAT 3'
[0018] HQ7G264V-GT Ml Cy5 :5' CACTTCTGGTTGCCTAT 3'。
[0019] 本發(fā)明同時(shí)提出了一種用于檢測(cè)AQP7基因的SNP的多樣本多位點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，包 含權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增引物和探針。
[0020] 本發(fā)明同時(shí)提出了采用上述的擴(kuò)增引物和探針的Q-PCR擴(kuò)增體系，具體地，在PCR 反應(yīng)管中加入下述組分，使終濃度為：〇. 1~lng/ul模板DNA25 ul、200~400nM上游引物 lul、200~400nM下游引物lul和200~400nM探針lul、10XPCR反應(yīng)緩沖液5ul、5XNTP 10ul，加水至50ul總反應(yīng)體積。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了使用上述擴(kuò)增體系進(jìn)行AQP7基因的SNP的多樣本多位點(diǎn)檢 測(cè)的方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0022] (1) DNA總樣本的提取；
[0023] (2)引物和探針設(shè)計(jì)：
[0024]對(duì)于 E40K :
[0025] HQ7E40K-GA Forward :5' CCGTGATAGCAAAGATCCAGGAAA 3'
[0026] HQ7E40K-GA Reverse :5' CCCACTCACCATCATGACATATGTG 3'
[0027] HQ7E40K-GA V2 VIC :5' CTCATGAACTCGGCC 3'
[0028] HQ7E40K-GA M2 FAM :5' CTCATGAACTTGGCC 3' ；
[0029] 對(duì)于 G264V :
[0030] HQ7G264V-GT Forward :5' CTCTTGCCTGCAGCAATGG 3'
[0031] HQ7G264V-GT Reverse :5' GCCAATGAAGACCAGGTAGATGATG 3'
[0032] HQ7G264V-GT VI Cy3 :5' ACTTCTGGGTGCCTAT 3'
[0033] HQ7G264V-GT Ml Cy5 :5' CACTTCTGGTTGCCTAT 3'；
[0034] (3) Q-PCR擴(kuò)增：用權(quán)利要求2所述的Q-PCR擴(kuò)增體系，利用步驟⑵所述的引物 和探針，進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)的程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C復(fù)性45s， 72°C延伸30s，總共42個(gè)循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線在40個(gè)循環(huán)以內(nèi)出現(xiàn)上升峰即判定為陽性， Melting Curve出現(xiàn)在65度以上的單峰為擴(kuò)增專一,性的判定，從而判定樣品中是否有AQP7 基因的SNP突變。
[0035] 更進(jìn)一步地，本發(fā)明提出一種用于糖尿病高危人群篩查的標(biāo)志物，所述的標(biāo)志物 為AQP7基因的兩個(gè)SNP，分別E40K和G264V，其中，所述的AQP7基因的目標(biāo)核苷酸序列如 SEQ N01 所示。
[0036] SEQ N01：
[0037] ATGGTTCAAGCATCCGGGCACAGGCGGTCCACCCGTGGCTCCAAAATGGTCTCCTGGTCCGTGATAGCA AAGATCCAGGAAATACTGCAGAGGAAGATGGTGCGAGAGTTCCTGGCCGAGTTCATGAGCACATATGTCATGATGGT ATTCGGCCTTGGTTCCGTGGCCCATATGGTTCTAAATAAAAAATATGGGAGCTACCTTGGTGTCAACTTGGGTTTTG GCTTCGGAGTCACCATGGGAGTGCACGTGGCAGGCCGCATCTCTGGAGCCCACATGAACGCAGCTGTGACCTTTGCT AACTGTGCGCTGGGCCGCGTGCCCTGGAGGAAGTTTCCGGTCTATGTGCTGGGGCAGTTCCTGGGCTCCTTCCTGGC GGCTGCCACCATCTACAGTCTCTTCTACACGGCCATTCTCCACTTTTCGGGTGGACAGCTGATGGTGACCGGTCCCG TCGCTACAGCTGGCATTTTTGCCACCTACCTTCCTGATCACATGACATTGTGGCGGGGCTTCCTGAATGAGGCGTGG CTGACCGGGATGCTCCAGCTGTGTCTCTTCGCCATCACGGACCAGGAGAACAACCCAGCACTGCCAGGAACAGAGGC GCTGGTGATAGGCATCCTCGTGGTCATCATCGGGGTGTCCCTTGGCATGAACACAGGATATGCCATCAACCCGTCCC GGGACCTGCCCCCCCGCATCTTCACCTTCATTGCTGGTTGGGGCAAACAGGTCTTCAGCAATGGGGAGAACTGGTGG TGGGTGCCAGTGGTGGCACCACTTCTGGGTGCCTATCTAGGTGGCATCATCTACCTGGTCTTCATTGGCTCCACCAT CCCACGGGAGCCCCTGAAATTGGAGGATTCTGTGGCGTATGAAGACCACGGGATAACCGTATTGCCCAAGATGGGAT CTCATGAACCCACGATCTCTCCCCTCACCCCCGTCTCTGTGAGCCCTGCCAACAGATCTTCAGTCCACCCTGCCCCA CCCTTACATGAATCCATGGCCCTAGAGCACTTCTAA
[0038] 其中，E40K和G264V的存在標(biāo)志著糖尿病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高。
[0039] 本發(fā)明同時(shí)提出了上述標(biāo)志物在糖尿病高危人群篩查中的應(yīng)用。
[0040] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種針對(duì)AQP7基因基因多態(tài)性（SNP)的多樣本多位點(diǎn)的檢測(cè)方法， 靶位點(diǎn)通過設(shè)計(jì)寡核苷酸DNA引物和熒光標(biāo)記探針，在單管中用不同引物探針的組合，捕 獲同一樣本的不同SNP位點(diǎn)（E40K和G264V)，并用特異性熒光探針進(jìn)行檢測(cè)。
[0041] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用人體內(nèi)特有的唯一的甘油轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白 AQP7基因序列，合理設(shè)計(jì)Q-PCR引物和探針，結(jié)合TaqMan方法做實(shí)時(shí)Q-PCR擴(kuò)增，進(jìn)行擴(kuò)增 曲線判讀和MeltingCurve擴(kuò)增專一性判斷，鑒定人體樣品中是否有AQP7基因的SNP突變， 導(dǎo)致AQP7基因在脂肪動(dòng)員和糖代謝中功能喪失，引起人體內(nèi)血糖紊亂，增大糖尿病患病幾 率。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、程序化高、鑒定快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適合大規(guī)模篩選篩查等優(yōu)點(diǎn)，避 免傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)或瓊脂糖電泳技術(shù)等鑒定方法耗時(shí)耗力、成本高，難以程序化管理，不能進(jìn) 行高通量篩選等缺點(diǎn)。由于所述AQP7兩個(gè)重要S