專利名稱：：黃瓜snp標(biāo)記及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的標(biāo)記及其檢測(cè)方法，具體是一種黃瓜SNP(單核苷酸多態(tài)性)標(biāo)記及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：廣義的分子標(biāo)記(molecularmarker)是指可以遺傳并可檢測(cè)的特異的DNA序列、RNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記僅指DNA標(biāo)記，這一界定標(biāo)準(zhǔn)目前己在世界范圍內(nèi)廣泛采納。分子標(biāo)記是反映DNA分子水平遺傳變異的遺傳標(biāo)記(geneticmarker)。它具有兩個(gè)基本特征，即可遺傳性和可識(shí)別性。DNA分子標(biāo)記的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用對(duì)基因定位和基因組作圖的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用，使之成為遺傳學(xué)乃至整個(gè)生物學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域。從遺傳學(xué)家Botstein首次提出DNA限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性的思想，以及1995年P(guān)CR技術(shù)的誕生至今，己經(jīng)有十幾種基于DNA多態(tài)性的標(biāo)記技術(shù)被建立，這些技術(shù)綜合起來(lái)可以分為以分子雜交和限制性內(nèi)切酶技術(shù)為基礎(chǔ)的第一代分子標(biāo)記(如RFLP等)；以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的第二代分子標(biāo)記(如RAPD，SRAP，SSR等)；以及與測(cè)序技術(shù)結(jié)合的以單核苷酸多態(tài)性為基因的第三代分子標(biāo)記(如SNP)。同時(shí)，還衍生出以PCR技術(shù)與限制性內(nèi)切酶技術(shù)相結(jié)合的分子標(biāo)記(如AFLP，CAPs等)。單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotidepolymorphism,SNP)標(biāo)記技術(shù)最早始于人類基因組計(jì)劃中構(gòu)建高密度人類遺傳圖譜的需要。1998年科學(xué)家首次提出并建立了SNP技術(shù)，目的是檢測(cè)人類基因組中單個(gè)核苷酸的變異。SNP標(biāo)記是由DNA序列中因單個(gè)核苷酸的變異而引起的遺傳多樣性，其在所有分子標(biāo)記中數(shù)量最多，密度最高。有報(bào)道稱水稻基因組中平均每lkb基因組序列存在1.70個(gè)SNP潛在位點(diǎn)。因此，SNP標(biāo)記可以極大的增加標(biāo)記數(shù)量，提高用于基因定位和遺傳作圖的標(biāo)記密度。然而，由于SNP標(biāo)記的開發(fā)和檢測(cè)都是已DNA分子測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的，由此而來(lái)的檢測(cè)成本和技術(shù)要求相對(duì)較高。在植物遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究中，特別是3在植物分子標(biāo)記基因定位工作中，往往需要構(gòu)建比較大的分離群體(一般均需>1000單株)，進(jìn)而需要對(duì)所有(或部分)單株進(jìn)行標(biāo)記掃描分析。傳統(tǒng)鑒定和檢測(cè)方法在這種大通量的分析工作中顯得費(fèi)時(shí)費(fèi)力，高成本。這也在一定程度上制約了SNP標(biāo)記在植物分子遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用。同時(shí)，對(duì)一些基因組序列信息并不豐富的植物材料(如本發(fā)明中所使用的黃瓜材料)，SNP標(biāo)記位點(diǎn)的鑒定工作本身也具有一定難度。因此，發(fā)展SNP標(biāo)記的開發(fā)和檢測(cè)的新方法，縮短標(biāo)記的開發(fā)和驗(yàn)證時(shí)間，減少標(biāo)記的檢測(cè)成本，是當(dāng)前SNP技術(shù)應(yīng)用于植物分子標(biāo)記定位和大群體掃描的重要問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種黃瓜SNP標(biāo)記及其檢測(cè)方法。本發(fā)明縮短了SNP標(biāo)記的開發(fā)和驗(yàn)證時(shí)間，減少了標(biāo)記的檢測(cè)成本。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種黃瓜SNP標(biāo)記，具有SEQIDNO:l所示的序列。所述黃瓜SNP標(biāo)記由SEQIDNO:2所示上游引物和SEQIDNO:3所示的下游引物擴(kuò)增得到。本發(fā)明涉及還一種黃瓜SNP標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括如下步驟步驟一，選取純合黃瓜親本，對(duì)目標(biāo)DNA區(qū)間進(jìn)行測(cè)序，確定候選SNP位點(diǎn)；步驟二，由純合親本雜交獲得R代單株，對(duì)F,代單株進(jìn)行步驟一中的目標(biāo)DNA區(qū)間的測(cè)序；步驟三，檢測(cè)R代測(cè)序結(jié)果的峰型圖，確定出現(xiàn)雜合峰的候選位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及一種在黃瓜F2代分離群體中SNP標(biāo)記的多態(tài)性單株的檢測(cè)方法，包括如下步驟步驟一，選取純合黃瓜親本，雜交獲得R代，F(xiàn)^t自交得到F2代分離群體；步驟二，選取F2代中隱性表型單株，等量混合其DNA，構(gòu)建隱性基因池；步驟三，利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的峰型圖，當(dāng)出現(xiàn)R代測(cè)序結(jié)果峰型圖的雜合峰時(shí)，則隱性基因池中含有交換株；步驟四，對(duì)隱性基因池單株分別利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的峰型圖，當(dāng)出現(xiàn)R代測(cè)序結(jié)果峰型圖的雜合峰時(shí)，該隱性單株即為SNP標(biāo)記多態(tài)性單株。本發(fā)明中的標(biāo)記方法和檢測(cè)結(jié)果通過(guò)研究黃瓜單性花決定基因#的試驗(yàn)過(guò)程加以驗(yàn)證。本發(fā)明利用單性花自交系親本S52(華南類型自交系)和兩性花自交系親本H34(歐洲溫室類型自交系)雜交獲得R代，F(xiàn)J直株再自交獲得較大的F2分離群體。隨后利用標(biāo)記S—ME8SA7篩選該擴(kuò)大的群體，在該標(biāo)記和#//基因位點(diǎn)間獲得兩個(gè)交換單株。同時(shí)利用該標(biāo)記篩選黃瓜基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)，獲得含有該標(biāo)記片段的BAC克隆B78。該BAC克隆經(jīng)末端測(cè)序獲得兩末端序列，并利用其M13末端序列開發(fā)出SNP標(biāo)記P73。利用上述分離群體進(jìn)行連鎖分析發(fā)現(xiàn)，該標(biāo)記與S—ME8SA7位于i/基因位點(diǎn)同側(cè)，并存在3個(gè)交換單株，這一結(jié)果證明了SNP標(biāo)記P73的開發(fā)和檢測(cè)方法的可行性。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明縮短了SNP標(biāo)記的開發(fā)和驗(yàn)證時(shí)間，減少了標(biāo)記的檢測(cè)成本；本發(fā)明的方法可以在黃瓜分子標(biāo)記精細(xì)定位，染色體步移等遺傳操作中有效發(fā)揮作用。本發(fā)明中涉及的分子標(biāo)記S—ME8SA7己在文獻(xiàn)《Lietal.Devel叩mentandfinemappingofthreeco-dominantSCARmarkerslinkedtothei^sgeneinthecucumberplant(C"c"j7issaWmsL).Theor.Appl.Genet.2008，117:1253-1260》中公開。本發(fā)明中涉及的黃瓜基因組BAC文庫(kù)的篩選操作已在文獻(xiàn)《Guanetal.ConstructionofaBAClibraryfromcucumber(C"c證j'51ss^ViASL)andidentificationoflinkagegroupspecificclones.Prog.Nat.Sci.2008,18:143-147》中公開。圖1為SNP標(biāo)記P73在黃瓜親本材料S52單株目標(biāo)DNA區(qū)間的PCR擴(kuò)增測(cè)序峰型圖2為SNP標(biāo)記P73在黃瓜親本材料H34單株目標(biāo)DNA區(qū)間的PCR擴(kuò)增測(cè)序峰型圖3為SNP標(biāo)記P73在黃瓜K世代單株目標(biāo)DNA區(qū)間的PCR擴(kuò)增測(cè)序峰型圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1SNP位點(diǎn)快速鑒定的方法步驟一，對(duì)黃瓜親本材料進(jìn)行目標(biāo)DNA區(qū)間的測(cè)序，確定候選SNP位點(diǎn)；隨后對(duì)親本雜交獲得的F,代單株進(jìn)行目標(biāo)DNA區(qū)間的測(cè)序本發(fā)明中利用PCR標(biāo)記對(duì)黃瓜基因組BAC文庫(kù)進(jìn)行掃描篩選，進(jìn)而獲得與#基因連鎖的相關(guān)基因組序列。所有PCR反應(yīng)體系均為BAC文庫(kù)質(zhì)粒20ng，雙向引物各O.2nmol/L，200nmol/LdNTPs，2mmol/LMgCl"lxTaq緩沖液，0.5UTaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10|iL,其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公司。擴(kuò)增程序?yàn)?4。C3min;40cycles，94°C20s，65°C30s，72°C30s;72°C5min，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果。本發(fā)明首先利用標(biāo)記S—ME8SA7篩選該擴(kuò)大的群體，在該標(biāo)記和#/歷基因位點(diǎn)間獲得兩個(gè)交換單株，確定該標(biāo)記與#基因的緊密連鎖關(guān)系。同時(shí)利用該標(biāo)記篩選黃瓜基因組細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)，獲得含有該標(biāo)記片段的BAC克隆B78。我們對(duì)BAC克隆B78的兩個(gè)末端進(jìn)行了測(cè)序，獲得兩個(gè)約900bp的序列信息，利用此信息設(shè)計(jì)引物分別在兩親本及R單株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。步驟二，觀察Fi代測(cè)序結(jié)果的峰型圖，若候選位點(diǎn)出現(xiàn)雜合峰，則該位點(diǎn)為SNP標(biāo)記如圖l，2所示，發(fā)現(xiàn)來(lái)自該BAC克隆M13末端的片段在兩親本間可以產(chǎn)生差異擴(kuò)增序列片段，差異位點(diǎn)為引物P73f側(cè)下游217位核苷酸，其中為"A"的片段與單性花基因i/連鎖，為"C"的片段與兩性花基因歷連鎖，該核苷酸序列信息列于SEQIDNO:1中，此SNP標(biāo)記命名為P73。通過(guò)試驗(yàn)檢測(cè)，本發(fā)明中所涉及的SNP標(biāo)記開發(fā)和檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性和實(shí)用性。利用本發(fā)明中介紹的方法開發(fā)SNP標(biāo)記，可以在黃瓜分子標(biāo)記精細(xì)定位，染色體步移等遺傳操作中有效發(fā)揮作用。實(shí)施例2遺傳分離群體的構(gòu)建與交換單株的鑒定步驟一，F(xiàn)2分離群體的構(gòu)建歐洲溫室類型自交系H34(父本)，兩性花品種，正常生長(zhǎng)條件下全株著生兩性花，植株生長(zhǎng)速度較快，成熟果實(shí)成球型，深綠色；華南類型自交系S52(母本)，單性花品種，植株生長(zhǎng)早期(較低節(jié)位)著生雄花，隨后雄花雌花交替分布，生長(zhǎng)后期(較高節(jié)位)完全著生雌花，植株生長(zhǎng)速度較慢，成熟果實(shí)長(zhǎng)條狀，白色。二者雜交獲得Fi子代，單性花株(強(qiáng)雌株)，果實(shí)長(zhǎng)條狀，墨綠色。自交系S52、H34、F,子代和單性花株/兩性花株判斷標(biāo)準(zhǔn)，已在文獻(xiàn)《Lietal.Developmentandfinemappingofthreeco-dominantSCARmarkerslinkedtothei^/7geneinthecucumberplant(C"c";w-ssaz^Vt/sL.).Theor.Appl.Genet.2008，117:1253-1260》中公開。本實(shí)施例利用F代自交產(chǎn)生&代群體。共種植約2700株F2單株，鑒定單性花株/兩性花株，卡方分析法進(jìn)行驗(yàn)證。步驟二，交換單株的篩選①黃瓜基因組DNA的提取用CTAB法提取親本及F2分離群體的葉片總DNA。方法為取上部幼嫩葉片在液氮中快速研磨成粉末狀，放于1.5ml的離心管中；加入預(yù)熱的500plCTAB提取緩沖液，6(TC水浴0.5h-lh;加入等體積氯仿異戊醇，其中氯仿與異戊醇的體積比為24:1，混勻后12000r/min4°C離心10min;將上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加等體積異丙醇，輕輕混勻，冰浴0.5h以上；12000r/min4°C離心10min;倒去上清液，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇沖洗沉淀兩次，干燥后，加入TE緩沖液150^1溶解后，加入10嗎/ml的RNA酶去除RNA，37。C水浴30min;在0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以50ng/pl的XDNA為標(biāo)準(zhǔn)，估計(jì)所得DNA的濃度；后用TE稀釋終濃度為30ng/Vl，存于-2(TC備用。②標(biāo)記掃描F2分離群體利用與己有的與#基因連鎖的分子標(biāo)記(S_ME8SA7)和本發(fā)明中開發(fā)的一個(gè)分子標(biāo)記(P73)掃描上述獲得的F2分離群體，尋找標(biāo)記基因型(通過(guò)分析顯隱親本獲得)與性狀表現(xiàn)型(單性花/兩性花)的差別單株，獲得標(biāo)記與#基因的交換單株。PCR體系基因組DNA30ng，引物0.2pmol/L,200ntnol/LdNTPs，2mmol/LMgCl2，lxTaq緩沖液，0.5UTaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10pL(標(biāo)記P73為50pL體系)，其中TaqDNA聚合酶購(gòu)于Promega公司。PCR擴(kuò)增程序程序如下表1。表l標(biāo)記名稱<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上述PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法為標(biāo)記S—ME8SA7使用3%瓊脂糖凝膠電泳顯示結(jié)果；標(biāo)記P73直接送交上海生工進(jìn)行測(cè)序。需要說(shuō)明的是，由于標(biāo)記P73屬于SNP標(biāo)記，使用成本較高，故在本發(fā)明中，我們僅掃描所有隱性單株(約660株)。具體操作方法為選取10株兩性花(隱性表型)單株，等量混合DNA，共構(gòu)建66個(gè)隱性基因池，在50)iL體系中利用標(biāo)記P73引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物直接送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物使用P73f。利用測(cè)序得到的"峰型圖"分析其約217位的核苷酸的峰型(核酸序列"CAGTnAAAT"中的n位點(diǎn))，若為如圖3中F,單株表現(xiàn)的雜合峰型，該隱性基因池中即含有交換株，隨后再以相同方法檢測(cè)該隱性池，獲得其交換株。測(cè)序樣品具體操作將PCR產(chǎn)物中加入goldview熒光染料3nl，4。C下放置10min讓染料同DNA結(jié)合，然后加入上樣緩沖液2pl，混勻后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標(biāo)片段放入1.5ml的離心管中，用脂A回收試劑盒回收，其中DNA回收試劑盒為上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號(hào)為Cat.No.SKI132。序列表<110>上海交通大學(xué)<120〉黃瓜SNP標(biāo)記及其檢測(cè)方法<160>3<210>1<211>802<212〉DNA〈213>黃瓜(ft/ci/肌'ssati'rasL)<220><221>mutation<222>(217)<223>n=A或C<400>1TGCATTATATATCTCGAGGTGGCAACTTTACTTTTCTTGAMTATTTTAGTTTAGTTTCT60ATGTGTGCAAAGAGAATGGGATGTACATATCAATGCATTCTAGTTATTTATTTTTCTACT120ATCCATAAATGTGMATATTGGTCCAACTCTTTTATTATTAMATTGGTTGAATMTMT180AATGATAAAGTTTAAGMTTTATTTTTAATTACAGTnAAATGAATCAAAATATCACTAAA240TGAACCGCGACAMCCAAAATAMCTMTAAAAACCTATCATAGTTTATTATMTCTAAC300ATATATAGATTGTGATATATATTTTGTTATATTTGTAMTATTTTCAAAAGTTTTTTATT360TAAMTAATTTTGTTMGTTAATAMTMTTATGTTAGGTGCATATACATTCTAAACTTT420TGATTTTATAGTTTCTTTACTTTTMGAAATCTTAATTTCMTCTCTGTTGTTTGTTTCG480TTACAGTTGATTTTTTMMACTTTTTATTATTCMTTATMTAMTMTMGTTTGAGA540GACTMTTAAATTTAAGATTTTATTAAAGATATAGATGTTMTTACMTTTTTATGMGG600AAGACATTAGGTTMTATATCATTGAMTGTTTGAGTTM嵐ATGAGTATAMAACTAG660ATTCAGMCATTAGCTTGTGGMGCATMAGATCMAATGTTGTTGTMATTAAATAGAT720GACAATATMTTATTTTGTCCTTTTTTTTTCTTTTCTTTTCTTTAGTTATTACTTTATTG780ACTCTGMTTTGATGAACCCCA802<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列〈400〉2TGCATTATATATCTCGAGGTGGC23<210>3<211>23〈212〉DNA<213>人工序列〈400〉3TGGGGTTCATCAMTTCAGAGTC2權(quán)利要求1、一種黃瓜SNP標(biāo)記，其特征在于，具有SEQIDNO1所示的序列。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃瓜SNP標(biāo)記，其特征是，所述黃瓜SNP標(biāo)記由SEQIDNO:2所示上游引物和SEQIDNO:3所示的下游引物擴(kuò)增得到。3、一種黃瓜SNP標(biāo)記的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，選取純合黃瓜親本，對(duì)目標(biāo)DNA區(qū)間進(jìn)行測(cè)序，確定候選SNP位點(diǎn)；步驟二，由純合親本雜交獲得R代單株，對(duì)R代單株進(jìn)行步驟一中的目標(biāo)DNA區(qū)間的測(cè)序；步驟三，檢測(cè)F,代測(cè)序結(jié)果的峰型圖，確定出現(xiàn)雜合峰的候選位點(diǎn)。4、一種在黃瓜F2代分離群體中SNP標(biāo)記的多態(tài)性單株的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，選取純合黃瓜親本，雜交獲得F,代，R代自交得到F2代分離群體；步驟二，選取F2代中隱性表型單株，等量混合其DNA，構(gòu)建隱性基因池；步驟三，利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的峰型圖，當(dāng)出現(xiàn)F,代測(cè)序結(jié)果峰型圖的雜合峰時(shí)，則隱性基因池中含有交換株；步驟四，對(duì)隱性基因池單株分別利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的峰型圖，當(dāng)出現(xiàn)Fi代測(cè)序結(jié)果峰型圖的雜合峰時(shí)，該隱性單株即為SNP標(biāo)記多態(tài)性單株。全文摘要本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的黃瓜SNP標(biāo)記及其檢測(cè)方法，具體為鑒定黃瓜SNP位點(diǎn)的方法選取純合黃瓜親本，測(cè)序，確定候選SNP位點(diǎn)；雜交獲得F₁代單株，測(cè)序；檢測(cè)F₁代測(cè)序結(jié)果的峰型圖，確定出現(xiàn)雜合峰的候選位點(diǎn)。在黃瓜F₂代分離群體中確定SNP標(biāo)記的多態(tài)性單株的方法選取純合黃瓜親本，得到F₂代分離群體；選取F₂代中隱性表型單株，等量混合其DNA，構(gòu)建隱性基因池；利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的峰型圖；對(duì)隱性基因池單株分別利用SNP引物進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，檢測(cè)測(cè)序結(jié)果的峰型圖。一種黃瓜SNP標(biāo)記，具有SEQIDNO1所示的序列。本發(fā)明縮短了SNP標(biāo)記的開發(fā)和驗(yàn)證時(shí)間，減少了標(biāo)記的檢測(cè)成本。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101591708SQ20091005288公開日2009年12月2日申請(qǐng)日期2009年6月11日優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日發(fā)明者何歡樂(lè),嫻曹,征李,潘俊松,潤(rùn)蔡申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)