本發(fā)明涉及分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及一種獼猴桃InDel分子標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

獼猴桃隸屬獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia Lindl)，為多年生雌雄異株植物。獼猴桃以其獨(dú)特的風(fēng)味，富含維生素C、飲食纖維和多種礦物營(yíng)養(yǎng)，以及具有清腸健胃等功效而受到人們的廣泛關(guān)注，現(xiàn)已成為重要的水果種類(lèi)之一。

獼猴桃自然界種間雜交現(xiàn)象明顯，染色體倍性復(fù)雜，采用常規(guī)的方法進(jìn)行遺傳學(xué)研究效率不高，DNA分子標(biāo)記的發(fā)展為獼猴桃研究提供了有效的途徑(黃宏文，2009；董曉莉等，2005)。

分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD、AFLP、SSR等已應(yīng)用于獼猴桃種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、雌雄性別鑒定以及獼猴桃相關(guān)性狀定位等(劉亞令等，2006；湯佳樂(lè)等，2014；Testolin et al.,2001；Fraser et al.,2009)。但是已開(kāi)發(fā)的標(biāo)記數(shù)量有限，有些標(biāo)記具有群體局限性，如在某一群體中開(kāi)發(fā)的雌雄相關(guān)標(biāo)記在其他群體中并不適用；覃瑞(2013)的研究數(shù)據(jù)表明中華獼猴桃SSR引物在軟棗獼猴桃中的通用性為23％。由于受獼猴桃倍性的影響，目前建立的遺傳連鎖圖譜都是基于二倍體建立的(Davide et al.,2015)，這也局限了多倍性獼猴桃中重要品質(zhì)以及抗性性狀等的定位，因此，還需要進(jìn)一步的進(jìn)行獼猴桃分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基于全基因組重測(cè)序的插入/缺失多態(tài)性標(biāo)記(Insertion/deletion,InDel)越來(lái)越受到關(guān)注，InDel標(biāo)記具有在基因組內(nèi)分布廣泛、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)、檢測(cè)容易等優(yōu)點(diǎn)Lv等(2013)通過(guò)全基因組序列比對(duì)分析開(kāi)發(fā)洋白菜InDel標(biāo)記，定位到洋白菜抗枯萎病基因FOC；王林友(2014)利用InDel標(biāo)記鑒定雜交水稻屬性和并進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)，目前在黃瓜、甘藍(lán)、玉米、小麥中也已有應(yīng)用(李斯更等，2013；liu et al.,2013)。基于高通量測(cè)序數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的InDel標(biāo)記，可為獼猴桃重要抗性性狀以及經(jīng)濟(jì)性狀定位、遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

(一)技術(shù)問(wèn)題

本發(fā)明實(shí)施例的目的在于開(kāi)發(fā)獼猴桃InDel分子標(biāo)記，提供多態(tài)性引物，建立獼猴桃InDel標(biāo)記開(kāi)發(fā)的技術(shù)體系，為獼猴桃遺傳多樣性分析提供更多的InDel標(biāo)記，彌補(bǔ)目前獼猴桃InDel標(biāo)記缺乏的不足。

(二)技術(shù)方案

根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明旨在提供一種獼猴桃InDel分子標(biāo)記，包括如下表所示的14個(gè)位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的正向和反向引物。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明旨在提供一種上述InDel分子標(biāo)記的篩選方法，包括以下步驟：

1、提取雜交母本‘永豐一號(hào)’，父本‘11-19雄’的DNA，提取雜交母本‘RB-3’，父本‘魁綠雄’的DNA；

2、基于提取的抗寒雜交群體DNA，構(gòu)建DNA文庫(kù)，利用Illumina Hiseq4000平臺(tái)進(jìn)行重測(cè)序；對(duì)測(cè)序得到的原始雙端序列(reads)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并過(guò)濾得到凈雙端序列(Clean Reads)，將凈雙端序列與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果進(jìn)行InDel位點(diǎn)注釋挖掘，設(shè)置InDel標(biāo)記引物；例如，利用R語(yǔ)言結(jié)合Primer3.0設(shè)置InDel標(biāo)記引物；

3、利用InDel引物對(duì)四個(gè)軟棗獼猴桃基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和非變性聚丙稀酰胺凝膠檢測(cè)，篩選多態(tài)性InDel標(biāo)記引物。

根據(jù)本發(fā)明又一方面，本發(fā)明利用14對(duì)InDel引物在中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴桃等11個(gè)品種中進(jìn)行遺傳多樣性分析。

根據(jù)本發(fā)明其他方面，本發(fā)明利用篩選的1對(duì)InDel引物在母本‘永豐一號(hào)’，父本‘11-19雄’雜交F1代中進(jìn)行子代真實(shí)性鑒定。

(三)有益效果

本發(fā)明實(shí)施例提供的獼猴桃InDel引物變異穩(wěn)定、檢測(cè)容易，InDel插入/缺失片段較大，可通過(guò)瓊脂糖進(jìn)行分析，可簡(jiǎn)化步驟，能夠用于獼猴桃遺傳多樣性分析、獼猴桃子代真實(shí)性鑒定、輔助分子育種，有利于準(zhǔn)確鑒定獼猴桃品種，加快獼猴桃育種進(jìn)程。

附圖說(shuō)明

圖1為第1-9對(duì)InDel引物在四個(gè)軟棗獼猴桃中的聚丙烯酰胺電泳圖；

圖2為第10-14對(duì)InDel引物在四個(gè)軟棗獼猴桃中的聚丙烯酰胺電泳圖；

圖3為InDel-18在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖4為InDel-15在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖5為InDel-52在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖6為InDel-93在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖7為InDel-100在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖8為InDel-27在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖9為InDel-44在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖10為InDel-23在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖11為InDel-12在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖12為InDel-13在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖13為InDel-8在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖14為InDel-39在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖15位InDel-3在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖16位InDel-55在11個(gè)品種中的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；

圖17為利用InDel-44進(jìn)行‘永豐一號(hào)’ב11-19雄’雜交F1代真實(shí)性鑒定時(shí)的瓊脂糖凝膠電泳圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。以下實(shí)施例中所涉及的原料，如無(wú)特別說(shuō)明均為市售，所涉及檢測(cè)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下面根據(jù)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的描述。

本發(fā)明使用所有試驗(yàn)材料如表1所示。

表1供試獼猴桃材料

其中‘永豐一號(hào)’采自遼寧省大連市步云山鄉(xiāng)，其余均采自中國(guó)農(nóng)科院鄭州果樹(shù)研究所獼猴桃資源圃。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例的獼猴桃InDel分子標(biāo)記篩選方法包括：DNA提取、InDel標(biāo)記的挖掘和引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)、多態(tài)性分析。

各個(gè)步驟的具體描述如下：

(1)DNA提取

對(duì)于對(duì)軟棗獼猴桃‘RB-3’、‘魁綠雄’、‘永豐一號(hào)’、‘11-19雄’，采幼嫩葉片后，將幼嫩葉片用冰袋保存，采用磁珠法提取葉片DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)，將DNA濃度調(diào)至20ng/μl備用。

其中，所用DNA提取試劑盒可購(gòu)自河南惠爾納米科技有限公司。

(2)InDel位點(diǎn)挖掘及引物設(shè)計(jì)

采用illumina HiSeq4000測(cè)序平臺(tái)對(duì)軟棗獼猴桃‘RB-3’、‘魁綠雄’、‘永豐一號(hào)’、‘11-19雄’進(jìn)行全基因組重測(cè)序。對(duì)測(cè)序得到的原始雙端序列(reads)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并過(guò)濾；去除帶接頭(adapter)的reads；若一條reads上N(未能確定出具體的堿基類(lèi)型)的比例大于10％，則過(guò)濾掉該雙端序列(Pair-end reads)，去除低質(zhì)量reads，保證每條reads質(zhì)量值低于10的堿基不超過(guò)50％，保證數(shù)據(jù)Q30在80％或85％以上，得到凈雙端序列(Clean Reads)。

使用bwa軟件將Clean Reads與參考基因組‘紅陽(yáng)’獼猴桃進(jìn)行比對(duì)。InDel檢測(cè)可使用GATK軟件工具包。根據(jù)預(yù)測(cè)的InDel位點(diǎn)，兩兩進(jìn)行比較，在獼猴桃29條染色體上，每條染色體上隨機(jī)選擇位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，同時(shí)沒(méi)有比對(duì)到染色體上的序列中的InDel也隨機(jī)選擇4個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。

選取的InDel位點(diǎn)均為50bp左右的大片段插入/或者缺失的位點(diǎn)，采用primer3軟件，在插入/缺失位點(diǎn)的上下游設(shè)計(jì)引物。引物可由上海生工生物科技有限公司合成。共設(shè)計(jì)120對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證。

(3)PCR擴(kuò)增及電泳

PCR反應(yīng)體系為10μl，采用2×Es Taq MasterMix高保真酶擴(kuò)增(北京康為世紀(jì)科技有限公司)，擴(kuò)增體系為：PCR mix 5μl；引物0.5μl；DNA 0.5μl；ddH2O 3.5μl。反應(yīng)程序?yàn)椋涸?4℃下擴(kuò)增120s，在94℃下擴(kuò)增30s，在60℃下擴(kuò)增30s，在72℃下擴(kuò)增60s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)。然后，在72℃下擴(kuò)增10min，反應(yīng)完成后保持4℃待用。

利用濃度為6％的丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳檢測(cè)的電壓80V，電泳時(shí)間為2h，而后，銀染顯色后照相保存，讀帶型分析。

(4)多態(tài)性分析

在120對(duì)引物中共篩選出14對(duì)在四個(gè)軟棗獼猴桃品種中具有InDel標(biāo)記多態(tài)性的引物，以便用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

如圖1所示，第一道電泳為DL500marker,2-5道為InDel-55,6-9道為InDel-27,10-13道為InDel-18，14-17道為InDel-52，18-21道為InDel-100，22-25道為InDel-93，26-29道為InDel-3，30-33道為InDel-44，34-37道為InDel-15。其中，每相鄰四道電泳的模板點(diǎn)樣順序均為‘RB-3’，‘魁綠雄’，‘永豐一號(hào)’，‘11-19雄’。

如圖2所示，第一道電泳為DL500marker,2-5道為InDel-8,6-9道為InDel-39,10-13道為InDel-23，14-17道為InDel-12，18-21道為InDel-100，22-25道為InDel-13，每相鄰四道電泳的模板點(diǎn)樣順序均為‘RB-3’，‘魁綠雄’，‘永豐一號(hào)’，‘11-19雄’。

實(shí)施例2

一種實(shí)施例1所篩選的InDel分子標(biāo)記在獼猴桃遺傳多樣性分析中的應(yīng)用，其應(yīng)用步驟如下：

所用材料包括‘RB-3’、‘魁綠雄’、‘RB-4’、‘11-19雄’、‘LD134’、’11-19’、‘博山碧玉’、‘紅陽(yáng)’、‘Hot16-A’、‘徐香’、‘海沃德’。

提取上述材料DNA后，應(yīng)用篩選的14對(duì)InDel引物在這11個(gè)品種進(jìn)行PCR，采用聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)，銀染染色后照相，進(jìn)行帶型分析，分析結(jié)果如圖3-14所示。圖3-14中，從左到右依次為：1:‘RB-3’,2:‘魁綠雄’,3:‘徐香’,4:‘RB-4’,5:‘11-19雄’,6:‘Hort16A’,7:‘LD134’,8:‘11-19’,9:‘博山碧玉’,10:‘紅陽(yáng)’,11:‘海沃德’。

根據(jù)每對(duì)引物對(duì)11個(gè)樣本擴(kuò)增獲得的條帶位置確定基因型，有帶記為1，無(wú)帶記為0，形成一個(gè)0、1矩陣。利用popgene軟件計(jì)算等位基因數(shù)，Shannon′s多樣性信息指數(shù)I(Shannon′s information index)和基因多樣性指數(shù)H(Nei′s gene diversity)，如表2所示。

表2根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的獼猴桃InDel標(biāo)記信息

以11份獼猴桃種質(zhì)資源基因組DNA為模板，在64對(duì)引物中隨機(jī)挑選14對(duì)引物，用PCR方法檢測(cè)引物有效性。這14對(duì)引物均能擴(kuò)增出特異的目的條帶，均為共顯性標(biāo)記，其中存在2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的引物7對(duì)，3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的引物5對(duì)，4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的引物3對(duì)。14對(duì)引物在11份種質(zhì)資源中共擴(kuò)增出43個(gè)多態(tài)1性位點(diǎn)，平均每個(gè)引物2.87個(gè)位點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例，基于兩個(gè)軟棗獼猴桃重測(cè)序數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的InDel引物在中華獼猴桃和美味獼猴桃中同樣適用。

實(shí)施例3

一種實(shí)施例1所篩選的InDel鑒定子代真實(shí)性中的應(yīng)用，其應(yīng)用步驟如下：

提取‘永豐一號(hào)’和‘11-17’22個(gè)子代DNA，根據(jù)實(shí)施例1的多態(tài)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果，選用InDel-44引物進(jìn)行子代真實(shí)性鑒定。

如圖3所示，其中第一電泳道為DL2000marker，第二電泳道為母本，第三電泳道為父本，應(yīng)用此引物可將沒(méi)有父本帶型的子代排除。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施例，本發(fā)明所述的獼猴桃InDel分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)方法應(yīng)用于包括中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴桃等在內(nèi)的獼猴桃屬植物的InDel分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所

<120> 獼猴桃InDel分子標(biāo)記及其篩選方法和應(yīng)用

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-55F）

<400> 1

GAGTTATTGCTGGAGAGTGAATTTG 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-55R）

<400> 2

CTCTTCCTCTCTACTTTCGTGAGTG 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-27F）

<400> 3

GCTTGAAATGTTGGTCTTTACTGG 24

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-27R）

<400> 4

GCTGAAGGTTAAATGCTGATAAGTG 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-18F）

<400> 5

GGAAACCGACTTTGATTCTATGAGT 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-18R）

<400> 6

GCCTTCTATCTATCTCTCGGTTGTT 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-52F）

<400> 7

ATAGTGGAGGTAATGCTGAAACCTT 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-52R）

<400> 8

GGTTGTATGCCTCCATTATTATGTC 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-100F）

<400> 9

AGAAGGGTCAGGTTCATATTAGTCC 25

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-100R）

<400> 10

AGAGTGAGCTGCAGTCAAGGTT 22

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-93F）

<400> 11

CAGAAGTCTCAGAGAAGCAGAAATC 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-93R）

<400> 12

GAACTATGTGAAGCAGGGATTTAAC 25

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-3F）

<400> 13

GGATTTGGCAATGTGTCTGA 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-3R）

<400> 14

TGTGCATCATACGGGTCACT 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-23F）

<400> 15

ACGCATGCTAGCTTTGGTAACTAAT 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-23R）

<400> 16

AACAACTTTGGGCATACTAGCTCTT 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-44F）

<400> 17

TGGAGCTAAGCTATCCACTGTATTC 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-44R）

<400> 18

CATTGGTGAATTAGTTATGGGACAC 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-12F）

<400> 19

TACAATTATCGTGATGCAGTAGGTG 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-12R）

<400> 20

TAGTGCTGTTGGTGGTGGTAATAAT 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-15F）

<400> 21

ATCAGCATGCTAACATGATTTCTCC 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-15R）

<400> 22

TTCATGAGAGTTAACGGAACTGACF 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-8F）

<400> 23

CTGCTATTCATACCAAAGCAGTAGG 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-8R）

<400> 24

TTGTGTAAAGTTTGGTCTCTGTACG 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-39F）

<400> 25

ACTTCAATAGCTGAACAAGGACAAC 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-39R）

<400> 26

GTACAGAACCTACAGCATCCAAATC 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-13F）

<400> 27

TGGGCTGTAGTGGTAGTTCTGTTAT 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（InDel-13R）

<400> 28

TGTACAGAACAGTGATTCAAACAGG