本發(fā)明屬于家禽育種領(lǐng)域，具體涉及一種利用THRSPα基因培育京海黃雞低脂系的方法。

背景技術(shù)：

過(guò)去大多數(shù)育種專家主要關(guān)注雞的生長(zhǎng)速度和體重的增加情況，卻忽略了雞脂肪性狀尤其是腹部脂肪性狀的選擇，因此在雞生長(zhǎng)速度不斷加快的同時(shí)，也產(chǎn)生了脂肪沉積過(guò)多的問(wèn)題。脂肪沉積主要發(fā)生在雞的皮下、內(nèi)臟、肌肉以及骨骼等部位，其中雞腹部皮下是脂肪沉積的主要部位。肉雞腹脂沉積過(guò)多不僅會(huì)降低飼料利用率，而且還影響肉雞的屠體性狀，蛋雞過(guò)肥會(huì)影響蛋雞的開產(chǎn)日齡及產(chǎn)蛋量，因此對(duì)雞腹脂性狀的遺傳改良越來(lái)越受到育種學(xué)家以及養(yǎng)殖企業(yè)的重視。雖然常規(guī)育種方法在家禽遺傳改良中取得一定進(jìn)展，但該方法育種周期長(zhǎng)，費(fèi)用高，而分子標(biāo)記輔助選擇方法不僅降低了育種成本，更可以加快育種進(jìn)程，為家禽育種工作提供了強(qiáng)有力的工具。

甲狀腺激素應(yīng)答蛋白Spot 14(THRSP)是一個(gè)參與調(diào)控脂肪生成酶活性進(jìn)而影響組織脂類代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，THRSPα是Spot 14的一種亞型,THRSPα基因編碼的蛋白是一種小分子量、酸性的細(xì)胞核內(nèi)蛋白，它正調(diào)控或負(fù)調(diào)控輔激活轉(zhuǎn)錄因子，在組織特異性脂類代謝調(diào)控中起到關(guān)鍵的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用THRSPα基因培育京海黃雞低脂系的方法。該方法利用THRSPα基因外顯子2上發(fā)生的C129T和T160G兩處突變及產(chǎn)生的不同基因型，對(duì)雞的腹脂重和腹脂率進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，該方法不受環(huán)境影響。

本發(fā)明公開了THRSPα基因外顯子2作為京海黃雞腹脂重和腹脂率的分子遺傳標(biāo)記的應(yīng)用。所述應(yīng)用具體是在培育京海黃雞低脂系時(shí)選擇THRSPα基因外顯子2的129和160bp處分別為T和G等位基因的純合個(gè)體。

本發(fā)明公開了THRSPα基因外顯子2上C129T和T160G兩處突變位點(diǎn)作為與京海黃雞腹脂重以及腹脂率顯著相關(guān)的特異分子標(biāo)記的應(yīng)用。

本發(fā)明還公開了一種利用THRSPα基因培育京海黃雞低脂系的方法，是選擇京海黃雞中在THRSPα基因外顯子2的129和160bp處分別為T和G等位基因的純合個(gè)體為基礎(chǔ)群，經(jīng)過(guò)多個(gè)世代的選種選育后，直至低腹脂性狀得到固定,在此選育過(guò)程中每一世代均利用THRSPα基因外顯子2的129和160bp處分別為T和G進(jìn)行選擇。

對(duì)THRSPα基因外顯子2的分子標(biāo)記檢測(cè)方法如下：提取待測(cè)樣本的雞基因組DNA，經(jīng)序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的特異性引物擴(kuò)增得到221bp的目的片段；目的片段經(jīng)SSCP分析，凝膠電泳后用銀染顯色，得到DNA的SSCP圖譜，根據(jù)圖譜中的帶型篩選基因型為DD的個(gè)體；或者是直接測(cè)序，在THRSPα基因外顯子2的129和160bp處分別為T和G等位基因的個(gè)體。

本發(fā)明的原理是：針對(duì)THRSPα基因外顯子2設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，以京海黃雞全基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP分析產(chǎn)生6種基因型(AA、BB、CC、DD、AB和CD)，直接測(cè)序表明BB型與AA型相比在129bp處發(fā)生了C→T突變，CC型與AA型相比在160bp處發(fā)生T→G突變,DD型與AA型相比分別在129bp和160bp處發(fā)生C→T和T→G兩處突變。將不同基因型與京海黃雞腹脂重和腹脂率進(jìn)行相關(guān)分析(由于BB基因型個(gè)體數(shù)小于3，不參與相關(guān)分析)，分析結(jié)果表明DD基因型個(gè)體腹脂重和腹脂率最低，且極顯著低于其它基因型個(gè)體(P<0.01)。該選擇的效果顯著，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快捷，且不受外界環(huán)境的影響，可以用于檢測(cè)京海黃雞低腹脂率的分子遺傳標(biāo)記。

附圖說(shuō)明

圖1是THRSPα基因的SSCP圖譜。

圖2是THRSPα基因的測(cè)序圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1.試驗(yàn)材料

選取飼養(yǎng)于江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司同一批次的379只京海黃雞，進(jìn)行翅靜脈采血和屠宰測(cè)定。記錄和整理這批雞的屠體性狀指標(biāo)。采用酚氯仿抽提法提取雞基因組DNA，溶于TE，NANODROP1000核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度后-20℃保存。

2.引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

2.1 SSCP引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已發(fā)表的THRSPα基因外顯子2序列(登錄號(hào)：NC＿006088.3)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為221bp。引物序列如下：

F:5’-ACTGTGTCCGTTCTCCCAAC-3’(SEQ ID NO：1)

R:5’-CTCATTTCTGCCCTGCCTAC-3’(SEQ ID NO：2)

1.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μL：10×buffer(25mmol/L)2μL；Mg²⁺(10pmol/μL)2.2μL；dNTPs(2.5mmol/L)0.8μL，DNA模板1μL，引物(均為10pmol/L)各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL，雙蒸水11.8μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存產(chǎn)物。引物退火溫度為60℃。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.3 PCR‐SSCP檢測(cè)

將2.5μL PCR產(chǎn)物和7.5μL上樣緩沖液混合，98C變性10min后，迅速冰浴10min。取變性后的PCR產(chǎn)物7μL進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，先用250V電壓預(yù)電泳5min，再用110V的電壓電泳10～12h后，銀染顯色。

引物擴(kuò)增片段的SSCP圖譜如圖1所示，顯示6種基因型，分別定義為AA、BB、CC、DD、AB和CD基因型(帶型表明形成了6種基因型，四種純合型分別用AA、BB、CC和DD表示，兩種雜合型用AB和CD表示，AA型在129和160bp處的等位基因分別為C和T，BB型在相應(yīng)的位點(diǎn)分別為T和T，CC型在相應(yīng)的位點(diǎn)分別為C和G，DD型在相應(yīng)的位點(diǎn)分別為T和G)。將各基因型PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：BB與AA相比在外顯子2中檢測(cè)到C129T突變，CC與AA相比在外顯子2中檢測(cè)到T160G突變，DD與AA相比在外顯子2中檢測(cè)到C129T和T160G兩處突變(圖2)。

2.4 THRSPα基因各基因型與京海黃雞腹脂重和腹脂率關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用下列模型：Y_ij＝μ+G_j+e_ij，分析THRSPα基因各基因型對(duì)京海黃雞腹脂性狀的遺傳效應(yīng)，其中，Y_ij為腹脂性狀的記錄值；μ為群體平均值；G_i為基因型效應(yīng)，e_ij是隨機(jī)誤差。京海黃雞DD基因型與其他基因型腹脂重以及腹脂率的比較見表1。

表1京海黃雞THRSPα基因不同基因型腹脂重和腹脂率的比較

注：同行數(shù)據(jù)肩注不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)，肩注不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

在所有基因型中，DD基因型的腹脂重和腹脂率均為最低，DD基因型的腹脂重比AB基因型低41.89g(P<0.01)，腹脂率比AB基因型低3.59％(P<0.01)，DD基因型腹脂重比5種基因型平均腹脂重24.54g低4.92g，腹脂率比5種基因型平均腹脂率4.52％低2.32％。篩選THRSPα基因DD基因型可以降低京海黃雞腹脂重和腹脂率，所以根據(jù)雞THRSPα基因的SSCP圖譜篩選DD基因型可作為培育京海黃雞低脂系的方法。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 利用THRSPα基因培育京海黃雞低脂系的方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<212> DNA

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