本發(fā)明涉及水稻抗逆育種領(lǐng)域，具體涉及一種水稻耐鹽基因及其緊密連鎖分子標(biāo)記的育種應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是我國重要的糧食作物之一，目前我國65％以上的人口以此作為主食。但隨著人口與經(jīng)濟(jì)的快速增長，糧食生產(chǎn)面臨著巨大的挑戰(zhàn)，其中水稻安全生產(chǎn)對于中國的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。水稻對鹽堿表現(xiàn)為中度敏感，其生長和結(jié)實會受到鹽堿的抑制。當(dāng)前，土地鹽堿化已成為威脅水稻生產(chǎn)的重要因素之一，鹽堿可以使糧食作物嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至高達(dá)40％以上。目前，全球大約20％的耕地存在鹽堿化現(xiàn)象，其中中國約為2000萬公頃，加之灌溉技術(shù)不當(dāng)，造成的耕地次生鹽堿化面積也在日益擴(kuò)大。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種水稻耐鹽基因及其緊密連鎖分子標(biāo)記的育種應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種鑒定或輔助鑒定水稻耐鹽性的方法，包括如下步驟：檢測待測水稻的基因組DNA中rs12_14215505SNP位點的基因型，如果所述rs12_14215505SNP位點的基因型為CC基因型、待測水稻為感鹽水稻，如果所述rs12_14215505SNP位點的基因型為TT基因型、待測水稻為耐鹽水稻。

所述“檢測待測水稻的基因組DNA中rs12_14215505SNP位點的基因型”的實現(xiàn)方法如下：提取待測水稻的基因組DNA，以所述基因組DNA為模板，采用引物F和引物R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測待測水稻的基因組DNA中rs12_14215505SNP位點的基因型的方法，包括如下步驟：提取待測水稻的基因組DNA，以所述基因組DNA為模板，采用引物F和引物R組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。

本發(fā)明還保護(hù)一種特異DNA分子(分子標(biāo)記)，如序列表的序列1所示。

本發(fā)明還保護(hù)所述特異DNA分子在檢測水稻耐鹽性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法或所述特異DNA分子，在水稻育種中的應(yīng)用。

所述育種的目的是選育耐鹽性水稻。

本發(fā)明還保護(hù)一種特異引物對，由所述引物F和所述引物R組成。

本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對在鑒定水稻耐鹽性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述特異引物對的試劑盒；所述試劑盒的應(yīng)用為鑒定水稻耐鹽性。

以上任一所述rs12_14215505SNP位點為水稻基因組中序列表的序列1自5’末端第12位核苷酸。所述rs12_14215505SNP位點為C/T多態(tài)。

以上任一所述引物F為如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物R為如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代且與序列3具有相同功能的DNA分子。

以上任一所述耐鹽水稻具體可為VI_R≥0.3的水稻。

以上任一所述感鹽水稻具體可為VI_R＜0.3的水稻。

VI_R的計算方法如下：將待測水稻的種子分為兩組，一組進(jìn)行鹽溶液處理，一組進(jìn)行水處理，在平行試驗的情況下，計算VI，進(jìn)一步計算VI_R；VI_R＝鹽溶液處理組的VI/水處理組的VI。

VI為種子活力指數(shù)。

VI＝GL×SL，GL表示發(fā)芽指數(shù)；SL表示第10天的平均芽長。

GL＝∑(Ni/n)/i，Ni為第i天種子總發(fā)芽數(shù)，n為種子總數(shù)，i為實驗進(jìn)行到第i天。

所述鹽處理具體可為采用60mM NaCl水溶液處理。

所述水處理具體可為采用蒸餾水處理。

所述鹽處理和所述水處理的條件具體可為：放置在30℃，相對濕度為80％的恒溫箱中處理10天(12h光照/12h黑暗)。

計算發(fā)芽指數(shù)時，具體可從第3天開始，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)目并統(tǒng)計芽長，當(dāng)芽長為種子長度一半，同時根長大于種子本身長度時作為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)。

以上任一所述待測水稻具體可為栽培稻。

以上任一所述待測水稻具體可為如下水稻材料中的任意一種：ARC 12867：：IRGC 22401-1、AUS 171：：IRGC 29004-1、AUS 233：：IRGC 29036-1、BIR BAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、MADISA：：IRGC 27568-1、MALAGKIT(PINELIPE)：：IRGC 67444-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANI BHOG：：IRGC 35109-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、SADUMONI：：IRGC 25919-1、ARC 7336：：IRGC 20606-1、ARC 11822：：IRGC 21677-1、JHUL DIGA：：IRGC 26478-1、AUS 282：：IRGC 29072-1、AUS 344：：IRGC 29131-1、AUS 449：：IRGC 29230-1、PINIDWA QAN QIPUGO PINGKITAN：：IRGC 23359-1、SAFARI、MIAO ZHAN：：IRGC 76691-1、ADUKKAN：：IRGC 81783-1、AE NOUA：：IRGC 89308-1、BALIBUD：：IRGC 26871-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、LIU TIAO XIAN：：IRGC 72758-1、GORIA：：IRGC 58736-1、HONG YANG ZAO 3：：IRGC 67177-1、BHU BHUSI：：IRGC 70803-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC 74031-1、GITANO：：IRGC 82424-1、ARNG’-KAR PHAR ONG：：IRGC 87196-1、ARC 11901：：IRGC 21727-1、EDAKKADAN 0-69-27：：IRGC 19560-1、ARC 18533：：IRGC 51756-1、FAN WU：：IRGC 70245-1。

以上任一所述待測水稻為以如下水稻材料中的任意一種或兩種為親本得到的后代：ARC 12867：：IRGC 22401-1、AUS 171：：IRGC 29004-1、AUS 233：：IRGC 29036-1、BIR BAHADUR：：IRGC 53889-1、KARIA：：IRGC 6702-1、LAL TAURA：：IRGC 35017-1、MADISA：：IRGC 27568-1、MALAGKIT(PINELIPE)：：IRGC 67444-1、NARIKEL BADI：：IRGC 37550-1、RANI BHOG：：IRGC 35109-1、RANRUWAN：：IRGC 36360-1、SADUMONI：：IRGC 25919-1、ARC 7336：：IRGC 20606-1、ARC 11822：：IRGC 21677-1、JHUL DIGA：：IRGC 26478-1、AUS 282：：IRGC 29072-1、AUS 344：：IRGC 29131-1、AUS 449：：IRGC 29230-1、PINIDWA QAN QIPUGO PINGKITAN：：IRGC 23359-1、SAFARI、MIAO ZHAN：：IRGC 76691-1、ADUKKAN：：IRGC 81783-1、AE NOUA：：IRGC 89308-1、BALIBUD：：IRGC 26871-1、HALSUDU HEENATI：：IRGC 15599-1、LIU TIAO XIAN：：IRGC 72758-1、GORIA：：IRGC 58736-1、HONG YANG ZAO 3：：IRGC 67177-1、BHU BHUSI：：IRGC 70803-1、HONG MI JIU GONG JI：：IRGC 74031-1、GITANO：：IRGC 82424-1、ARNG’-KAR PHAR ONG：：IRGC 87196-1、ARC 11901：：IRGC 21727-1、EDAKKADAN 0-69-27：：IRGC 19560-1、ARC 18533：：IRGC 51756-1、FAN WU：：IRGC 70245-1。

為了克服鹽堿對水稻生產(chǎn)的不利影響，除了采用傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)栽培保護(hù)措施外，種植耐鹽品種成為降低鹽害損失最經(jīng)濟(jì)、最環(huán)保、最有效的重要方式之一。因此，鑒定耐鹽新基因，開發(fā)與耐鹽性緊密相關(guān)的分子標(biāo)記成為水稻育種工作者最亟待解決的問題。通過分子標(biāo)記輔助選擇的方法，挖掘新的耐鹽基因或聚合已知優(yōu)良的耐鹽基因，可以提高水稻的抗逆性，適應(yīng)不同的生長環(huán)境，加快耐鹽水稻品種培育，有利于水稻的穩(wěn)產(chǎn)和高產(chǎn)。

本發(fā)明提供了一個水稻耐鹽基因位點，并提供該基因位點的分子標(biāo)記，該標(biāo)記可以預(yù)測水稻耐鹽性，從而為水稻耐鹽分子標(biāo)記輔助選擇育種提供基礎(chǔ)。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

以下實施例中的水稻材料均已經(jīng)在參考文獻(xiàn)：3K RGP.The 3,000rice genomes project[J].Gigascience，2014，3：7.中公開記載。

實施例1、水稻耐鹽基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記

1、從己測序(平均深度14×)的全球水稻核心種質(zhì)資源(3K RGP.The 3,000rice genomes project[J].Gigascience，2014，3：7.)中選取來自49個國家的478份水稻品種作為實驗材料；針對478份水稻品種進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在第12染色體定位到水稻耐鹽性相關(guān)的新基因qST14.2，進(jìn)一步發(fā)掘了與qST14.2基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記，將其命名為rs12_14215505SNP。

rs12_14215505SNP位于水稻日本晴參考基因組第12染色體的14215505bp，rs12_14215505SNP及其附近的核苷酸如序列表的序列1所示，其中第12位核苷酸為rs12_14215505SNP，為C/T多態(tài)。

2、針對步驟1的SNP位點設(shè)計引物，如表1所示。

表1引物信息

3、檢測水稻rs12_14215505SNP位點基因型的方法：提取水稻的基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用步驟2中的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，檢測rs12_14215505SNP位點的基因型為CC還是TT。

實施例2、水稻耐鹽性鑒定實驗

1、采用36份水稻材料作為實驗材料，每份材料選出120粒飽滿的種子，在溫度為50℃的烘箱中烘3天。將每份種子分成4份(鹽處理組和對照組，每組設(shè)置兩個重復(fù)，每個重復(fù)30粒種子)。

2、將步驟1的種子用體積百分比為15％的次氯酸鈉水溶液浸泡20min，用蒸餾水清洗3次。

3、在直徑9cm的培養(yǎng)皿中放置雙層濾紙，將30粒種子均勻分布于濾紙上，然后加入處理液(每天更換新配制的處理液，每次的加入量為10ml；鹽處理組的處理液為60mM鹽水，對照組的處理液為蒸餾水)，將培養(yǎng)皿放置在30℃，相對濕度為80％的恒溫箱中處理10天(12h光照/12h黑暗)。從第3天起，每天記錄種子發(fā)芽數(shù)目并統(tǒng)計芽長，當(dāng)芽長為種子長度一半，同時根長大于種子本身長度時作為種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)統(tǒng)計的數(shù)據(jù)計算種子活力指數(shù)(VI)：VI＝GL×SL，其中GL表示發(fā)芽指數(shù)(GL＝∑(Ni/30)/i，Ni為第i天種子總發(fā)芽數(shù)，30為實驗種子總數(shù)，i為實驗進(jìn)行到第i天)，SL表示第10天的平均芽長。VI_R＝鹽處理組的VI/對照組的VI。VI_R≥0.3為耐鹽品種，VI_R＜0.3為感鹽品種。

結(jié)果見表2。36份水稻材料中，30份為耐鹽材料，6份為感鹽材料。

表2水稻耐鹽性統(tǒng)計

實施例3、水稻耐鹽基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記在鑒定水稻耐鹽性中的應(yīng)用

待測樣本為：實施例2表2中水稻。

提取待測水稻的基因組DNA，按照實施例1步驟3的方法檢測待測水稻基因組DNA中rs12_14215505SNP位點基因型。表2中編號1-36的水稻材料基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序均為1035bp-1055bp(上游末端19個核苷酸如序列表的序列2所示，下游末端18個核苷酸與序列表的序列3反向互補)，其中均含有序列1所示的41bp堿基(第12位堿基為rs12_14215505SNP位點)。

測序結(jié)果表明，30個耐鹽品種的水稻rs12_14215505SNP位點的基因型為TT，6個感鹽的水稻rs12_14215505SNP位點的基因型為CC。通過用該功能標(biāo)記對36份具不同耐鹽性的水稻品種進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記能夠明確的鑒定出耐鹽品種和感鹽品種，實驗證明開發(fā)的分子標(biāo)記是有效和準(zhǔn)確的，可用于水稻耐鹽種質(zhì)資源的篩選和分子標(biāo)記輔助選擇育種。

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳生物育種創(chuàng)新研究院

<120> 水稻耐鹽基因及其緊密連鎖分子標(biāo)記的育種應(yīng)用

<130> GNCYXMN161814

<160> 3

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> y is c or t

<400> 1

cattccaccc cyagacggac ggccaaacgg aggcggctaa t 41

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gatgattccg caacaccac 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tatctccagg gcgacagc 18