雄性不育突變體oss125及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物雜交育種方法，包括不育系繁殖和 雜交種子制備，更具體地涉及一個(gè)雄性不育突變體及其在雜交育種中的應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 水稻是我國重要的糧食作物。從上世紀(jì)80年代起，W雄性不育為基礎(chǔ)的雜交水稻 育種技術(shù)極大的提高了水稻的單產(chǎn)，在保障我國糧食安全中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。雜交水稻制 種是用恢復(fù)系作父本和不育系雜交生產(chǎn)雜交種子的過程。利用作物雜種優(yōu)勢(shì)是提高作物產(chǎn) 量的重要途徑，而作物雄性不育是有效利用雜種優(yōu)勢(shì)的前提和基礎(chǔ)。水稻育性是影響水稻 產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，為了提高產(chǎn)量和獲取雜種優(yōu)勢(shì)，在雜交育種過程中，對(duì)雄性不育和雄性可 育的遺傳操作是一個(gè)關(guān)鍵步驟。利用雄性不育系生產(chǎn)雜交種，不僅能節(jié)省大量去雄的人工， 降低種子成本，而且可W減少因去雄不凈所造成的混雜，從而提高種子純度，充分發(fā)揮雜種 優(yōu)勢(shì)的作用。水稻雄性不育的發(fā)現(xiàn)與利用為增加水稻產(chǎn)量，改進(jìn)品質(zhì)，增加抗性和適應(yīng)性提 供優(yōu)異種源，因而在植物育種上具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 植物雄性不育是指在有性繁殖過程中不能產(chǎn)生正常可育雄配子體的遺傳現(xiàn)象，在 廣泛的開花植物中普遍存在。水稻作為模式植物，雄性生殖發(fā)育的顯著特征是形成6枚雄 蕊，任何參與雄蕊發(fā)育、抱原細(xì)胞分化、減數(shù)分裂、小抱子的有絲分裂、花粉分化或開花等過 程基因的突變，均有可能引起花藥發(fā)育異常，最終導(dǎo)致雄性不育（Ma H. Molecular genetic analysis of microsporogenesis and microgametogenesis in flowering plants. Annual Review of Plant Biology. 2005, 56:393-434.)〇
[0004] 雄性不育可W分為細(xì)胞質(zhì)雄性不育(^cytoplasmic male sterility, CM巧和細(xì)胞 核雄性不育（genic male sterility, GM巧。細(xì)胞質(zhì)雄性不育的實(shí)質(zhì)是細(xì)胞質(zhì)基因組與細(xì) 胞核基因組競(jìng)爭(zhēng)傳遞自身遺傳物質(zhì)的結(jié)果。細(xì)胞核雄性不育由核基因突變產(chǎn)生，突變性狀 可通過雌配子或者雄配子遺傳。遺傳分析表明，大多數(shù)雄性育性是由核基因控制的（Sunok M, Ki-Hong J, Do-Eun L, Dong-Yeon L, Jinwon L, Kyungsook An, Hong-Gyu K, Gynheung An. The rice FONlgene controls vegetative and reproductive development by regulating shoot apical meristem size. Molecules and Cells.2006, 21(I):147-152)。
[0005] 近年來，隨著水稻基因組測(cè)序的完成，水稻突變體庫的構(gòu)建W及基因表達(dá)譜分析 等工作的開展，水稻花粉發(fā)育的分子機(jī)理研究起取得了一定的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些控制水稻 花器官數(shù)目基因，如FONl~4^、0sL服1，控制花粉囊細(xì)胞的分開和分化基因MSPUOsTDLlA， 控制雄性減數(shù)分裂基因PAIRl、PAIR2、PAIR3、MELl、MILl、DTMl、0sSG01等，促進(jìn)花粉粒發(fā)育 的關(guān)鍵基因CYP703A3、CYP704B2、WDA1、OsNOP、DPW、U甜2、MTRl等。送些基因涉及多個(gè)方 面，包括小抱子母細(xì)胞的減數(shù)分裂、絨租層發(fā)育及降解，W及花粉細(xì)胞壁形成等方面。根據(jù) 不育基因的功能和調(diào)控時(shí)期的差異，可將水稻隱性核雄性不育基因主要分為3類；1)小抱 子母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期不育基因；2)絨租層發(fā)育時(shí)期不育基因；3)花粉囊和花粉外壁發(fā)育時(shí)期 不育基因。
[0006] 目前水稻突變體基因克隆最常用的技術(shù)有圖位克隆、同源克隆、轉(zhuǎn)座子或T-DNA 標(biāo)記法、表達(dá)序列標(biāo)簽法、差異表達(dá)基因克隆等技術(shù)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，2012 年，日本科學(xué)家提出了基于重測(cè)序方法的Mutmap基因克隆技術(shù)（Abe A, Kosugi S,化shida K,Natsume S,Takagi H, Kan-zaki H, Matsumura H, Yoshida K,Mistsuoka C, Muluneh T,Innan H, Cano L, Kamoun S,Teraushi R.Genome sequencing reveals agronomicalIy important loci in rice using MutMap. Nature Biotechnology. 2012, 30(2):174-178)， 該技術(shù)將突變體與野生型親本進(jìn)行雜交，產(chǎn)生Fz代分離群體，隨機(jī)取20-30個(gè)突變個(gè)體，分 別提取基因組DNA，等量混合后，利用二代測(cè)序技術(shù)，結(jié)合分子生物學(xué)與生物信息學(xué)分析測(cè) 序數(shù)據(jù)，找出候選突變基因，大大縮短了基因克隆時(shí)間，降低了基因克隆成本。
[0007] 到目前為止，涉及水稻花藥發(fā)育和花粉形成的一些關(guān)鍵基因已被鑒定和研究，送 些基因的突變導(dǎo)致雄性不育的表型。但對(duì)水稻雄配子體發(fā)育過程和調(diào)控機(jī)制并未完全探 明，水稻雄性不育基因的定位與克隆有助于更全面地了解雄配子體發(fā)育的分子機(jī)制，加快 利用雄性不育株系進(jìn)行育種的進(jìn)程。
[0008] 本研究通過EMS誘變水稻品種黃華占，篩選得到一個(gè)由單個(gè)隱性核基因控制的雄 性不育突變體，命名為OSS125,對(duì)其進(jìn)行初步的表型鑒定、遺傳分析及遺傳背景鑒定，并利 用改進(jìn)的MutMap方法（陳竹鋒，嚴(yán)維，王娜，張文輝，謝剛，盧嘉威，簡(jiǎn)智華，劉東風(fēng)， 唐曉艷.利用改進(jìn)的MutMap方法克隆水稻雄性不育基因.遺傳 .2014, 36(1) :85-93)，結(jié) 合HRM及基因序列分析，成功定位并克隆了該雄性不育基因。本發(fā)明還闡述了所述雄性不 育基因的應(yīng)用范圍和應(yīng)用方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過引用并入本文。
[0010] 除非有相反指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通 技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術(shù)是本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加W限制。
[0011] 本發(fā)明包括一種育性相關(guān)基因及其核巧酸和蛋白序列，還包括通過操作該基因在 調(diào)控植株雄性生育力中的應(yīng)用。非限制性地舉例而言，下文描述的任何方法都可與本發(fā)明 所提供的相應(yīng)核巧酸序列一起使用，例如，將所述育性基因的突變體序列引入植株W導(dǎo)致 植株雄性不育、使植株內(nèi)源序列突變、向植株中引入該序列的反義序列、使用發(fā)卡形式、或 將其與其它核巧酸序列連接起來調(diào)控植株的表型，或者是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的可用于影 響植株的雄性生育力的多種方法中的任一方法。
[0012] 本發(fā)明利用改進(jìn)的Mutmap方法克隆得到了一個(gè)雄性不育突變基因（0sS125)， 該基因與0sRPAla(L0C_0s02g53680)是等位基因。OsRPAla是一個(gè)復(fù)制蛋白 A巧巧Iication protein A，RPA)，是真核生物中高度保守的單鏈DNA結(jié)合蛋白，由H個(gè)亞 基 RPAl, RPA2 和 RPA3 組成的一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合體（Wold M S. Replication protein A:a heterotrimeric, single-str曰nded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA met油olism. Annual Review of Biochemistry. 1997, 66:61-92)。在酵母和人中，RPA為DNA 代謝的多個(gè)過程所必需，如DM復(fù)制，DM修復(fù)W及同源重組等。大部分真核生物包括真菌、 昆蟲和脊椎動(dòng)物等編碼RPA各亞基的RPA基因都只有一個(gè)，而在擬南芥和水稻中含有多個(gè) RPA基因。水稻中含有3個(gè)RPA的旁系同源基因，包括RPAl，RPA2和RPA3。前人研究已經(jīng) 在體內(nèi)和體外證明它們?cè)谏缴峡蒞互作，但它們確切的功能并不清楚。通過T-DNA 插入突變體研究發(fā)現(xiàn)，OS巧ala突變體在營養(yǎng)生長期中表型正常但在生殖生長期中不育。細(xì) 胞學(xué)分析表明該突變體雌性母細(xì)胞中沒有形成胚囊，同時(shí)雄性母細(xì)胞在減數(shù)分裂后期I出 現(xiàn)異常的染色體片段，植株表現(xiàn)為雄性半不育和雌性完全不育。該結(jié)果說明OsRPAla在水 稻雄配子和雌配子發(fā)育過程中都起著重要作用，由于T-DNA插入對(duì)OsRPAla蛋白功能有不 同層度的影響，說明OsRPAla蛋白可能有兩個(gè)功能區(qū)，分別控制雄性和雌性發(fā)育。本發(fā)明中 獲得的OSS125突變體的不育性狀是由于OsRPAla基因外顯子上有一個(gè)氨基酸的置換，該突 變可能僅影響了 OsRPAla蛋白對(duì)雄性器官發(fā)育調(diào)控，而對(duì)雌性器官發(fā)育沒有明顯影響，提 示該基因在雄性器官和雌性器官中發(fā)揮作用的方式或位點(diǎn)