滇ⅰ型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的pcr鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種滇Ⅰ型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的PCR鑒別方法。該方法用兩對引物atp6?orf79和LD30組合分別對待檢樣品進行PCR擴增；同一樣品分別用引物atp6?orf79和引物LD30分別擴增出1592bp和788bp單一條帶的，該樣品為滇Ⅰ型細胞質(zhì)雄性不育系；同一樣品分別用引物atp6?orf79和引物LD30分別擴增，均無擴增條帶的，該樣品為保持系。本發(fā)明方法在水稻種子、苗期即可預期所檢材料為可育/敗育，不僅在滇Ⅰ型不育系選育過程中可縮短育種年限，減少工作量，而且在種子提純工作中可提高工作效率，具有操作簡單、準確、快速等優(yōu)點。
【專利說明】
滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的PCR鑒別方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)分子生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及雜交水稻種質(zhì)鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種 能夠準確快速鑒別滇I型雜交粳稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的PCR方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雜交水稻的應(yīng)用是我國保證水稻高產(chǎn)的重要措施。長期廣泛應(yīng)用的三系雜交水稻 技術(shù)的核心是細胞質(zhì)雄性不育系。水稻細胞質(zhì)雄性不育系的純度是保障三系雜交水稻產(chǎn)量 的一個基本因素。在水稻細胞質(zhì)雄性不育系繁殖過程中由于需要同田種植保持系為不育系 提供花粉，收獲的不育系種子中難免混雜有保持系的種子。但是由于不育系和保持系為同 核異質(zhì)系，在營養(yǎng)生長階段兩者的形態(tài)性狀一致，采用現(xiàn)在通用的田間種植方法無法鑒別。 只有待水稻揚花或灌漿期有經(jīng)驗的技術(shù)人員才能根據(jù)花藥和花粉特征或結(jié)實情況進行鑒 另IJ，這種傳統(tǒng)的方法耗時，而且受包括溫度、病蟲害等環(huán)境因素的影響。滇I型雄性不育細胞 質(zhì)由云南農(nóng)業(yè)大學李錚友教授在1965年發(fā)現(xiàn)，繼而在1969年育成第一個細胞質(zhì)雄性不育粳 稻不育系，是我國雜交粳稻上應(yīng)用的兩個重要的雄性不育細胞質(zhì)之一。滇I型雜交粳稻不育 系同樣具有難于避免保持系混雜的問題。因此，很有必要建立一種用于鑒別滇I型不育系和 保持系的快速可靠的方法。
[0003] 近些年對水稻分子生物學的研究和特異性PCR技術(shù)的發(fā)展為準確快速鑒別水稻不 育系和保持系提供了有效的方法。利用PCR技術(shù)鑒定不育系的純度克服了傳統(tǒng)鑒別方法受 花期限制以及環(huán)境影響大等缺點。本發(fā)明基于對水稻細胞質(zhì)雄性不育基因的研究，利用PCR 技術(shù)對滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和保持系進行了準確快速鑒別。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種實驗條件和操作較為簡單、樣品用量少，能準確、快速鑒 別滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的PCR方法，為生產(chǎn)上提供一種鑒別滇I型水稻細 胞質(zhì)雄性不育系和保持系的實用技術(shù)。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 1.鑒別滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的特異引物，所述特異引物由引物 atp6-〇rf 79和引物LD30組成；所述引物atp6-〇rf 79由上游引物atp6-〇rf 79F和下游引物 atp6-〇rf79R組成，所述上游引物atp6-〇rf79F的堿基序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物 atp6-〇rf79R的堿基序列如SEQ ID N0:2所示，目標產(chǎn)物片段長度為1592bp;所述引物LD30 由上游引物LD30F和下游引物LD30R組成，所述上游引物LD30F的堿基序列如SEQ ID N0:3所 示，下游引物LD30R的堿基序列如SEQ ID N0:4所示，目標產(chǎn)物片段長度為788bp。
[0007] 2.滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的PCR鑒定方法，包括以下步驟：
[0008] (1)從水稻材料中提取DNA樣品，每個DNA樣品分為兩份，一份用技術(shù)方案1中所述 的引物atp6-〇rf 79進行PCR反應(yīng)，另一份用技術(shù)方案1中所述的引物LD30進行PCR反應(yīng)；
[0009] (2)PCR 反應(yīng)：
[0010] A.引物atp6-〇rf79對每個DNA樣品的PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25yL，其中Taq PCR Master Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物atp6-〇rf79F 0.25yL，20pmol/L下游引物 atp6-〇rf79R 0.25yL，模板DNA lyL，無菌雙蒸水IlyL;完成PCR反應(yīng)后，放入Eppendorf PCR 儀中，設(shè)置引物atp6-〇rf79的PCR擴增程序為:94°C預變性4min，循環(huán)內(nèi)94°C變性30s，55°C 退火30s，72°C復性2min，30個循環(huán)后72°C延伸lOmin;
[0011] B.引物LD30對每個DNA樣品的PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25yL，其中Taq PCR Master Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物LD30F 0.25yL，20pmol/L LD30R 0.25yL，模板DNA lyL，無菌雙蒸水1 lyL;完成PCR反應(yīng)后，放入Eppendorf PCR儀中，設(shè)置引物LD30的PCR擴增 程序為:94°C預變性4min，循環(huán)內(nèi)94°C變性30s，55°C退火30s，72°C復性2min，30個循環(huán)后72 °C 延伸 lOmin;
[0012] (3)各取5yL PCR擴增產(chǎn)物，分別采用2%的瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色，在電 壓120V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照；
[0013] (4)鑒別：同一樣品分別用引物atp6-〇rf79和引物LD30分別擴增出1592bp和788bp 單一條帶的，該樣品為滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系；同一樣品分別用引物atp6-〇rf79和引 物LD30分別擴增，均無擴增條帶的，該樣品為保持系。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的創(chuàng)新點和有益效果是：
[0015] 本發(fā)明采用兩對特異引物組合進行PCR，提高了鑒別的精確性。在滇I型水稻不育 系的繁種工作以及不育系種子保存工作中，采用本發(fā)明方法在水稻種子、苗期即可預期所 檢材料為可育/敗育，不需等到水稻抽穗開花時期，不僅在滇I型水稻不育系選育過程中可 縮短育種年限，減少工作量，而且在種子提純工作中可提高工作效率，本發(fā)明方法具有操作 簡單、準確、快速等優(yōu)點。
[0016] 序列表中SEQ ID N0:1所示的是引物atp6-〇rf79的上游引物atp6-〇rf79F的堿基 序列。
[0017] 序列表中SEQ ID N0:2所示的是引物atp6-〇rf79的下游引物atp6-〇rf79R的堿基 序列。
[0018] 序列表中SEQ ID從):3所示的是引物0)30的上游引物0)30?的堿基序列。
[0019] 序列表中SEQ ID N0:4所示的是引物LD30的下游引物LD30R的堿基序列。
【附圖說明】
[0020] 圖1:滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系PCR鑒別結(jié)果。圖中泳道1、2、3、4為滇I 型水稻細胞質(zhì)雄性不育系，分別為滇I型細胞質(zhì)雄性不育系合系42A、滇I型細胞質(zhì)雄性不育 系合系42A/(CT9993/稱桿香糯）、滇I型細胞質(zhì)雄性不育系榆密15A、滇I型細胞質(zhì)雄性不育 系H479A。泳道上的各7符號分別代表相鄰左側(cè)泳道材料相應(yīng)的保持系，即泳道上各7符號從 左至右分別為:保持系合系42、保持系CT9993/稱桿香糯、保持系榆密15、保持系H479。圖1中 a為特異引物atp6-〇rf 79擴增情況，圖1中b為特異引物LD30的擴增情況，圖1中右側(cè)標示為 PCR擴增片段的分子量大小，Μ為DNA分子量標準。
【具體實施方式】
[0021] 以下實施例無特殊說明為常規(guī)方法。
[0022] 1、材料
[0023] 鑒定滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和保持系所用材料如表1所示。
[0024] 表1樣品來源表
[0027]表1所示材料已在如下非專利文獻中公開，本專利
【申請人】云南農(nóng)業(yè)大學均有保存，
【申請人】保證從本專利申請日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放，云南農(nóng)業(yè)大學地址：云南省昆明市盤 龍區(qū)黑龍?zhí)逗诮鹇?5號，郵編:650201。
[0028] 1、滇I型細胞質(zhì)雄性不育系合系42A相關(guān)文獻:程賢宇等，滇I型不育系合系42A高 產(chǎn)繁殖技術(shù)，種子，2012,31(2):122。
[0029] 2、滇I型細胞質(zhì)雄性不育系榆密15A相關(guān)文獻:黃大軍等，滇I型粳不育系榆密15A 的選育與應(yīng)用研究，西南農(nóng)業(yè)學報，2004，17(4): 535-537。
[0030] 3、滇I型細胞質(zhì)雄性不育系H479A相關(guān)文獻:程賢宇等，高原優(yōu)質(zhì)滇型雜交粳稻滇 禾優(yōu)34高產(chǎn)制種技術(shù)，種子，2013,32(12):112-113。
[0031] 4、保持系合系42相關(guān)文獻:劉吉新等，中日合作高原粳稻新品種的選育與推廣，云 南農(nóng)業(yè)科技，1998，（2):6-9。
[0032] 5、滇I型細胞質(zhì)雄性不育系合系42A/(CT9993/稱桿香糯）、保持系CT9993/稱桿香 糯和保持系H479相關(guān)文獻:蘇家秀等，同核異質(zhì)滇I型粳稻不育系及其保持系的光合特性， 作物學報，2011，37 (11): 2075-2084。
[0033] 6、保持系榆密15相關(guān)文獻：陶光喜等，滇型雜交粳稻新組合滇雜33的選育與應(yīng)用， 雜交水稻，2005,20(4)，16-17。
[0034] 2、DNA 提取
[0035] 米用改良的CTAB法（Rogers and Bendich,Extraction of DNA from milligram amounts of fresh,herbarium and mummified plant tissues,Plant Mol Biol,1985,5 (2) :69-76)提取水稻總DNA，4個滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和4個相應(yīng)保持系各取約0.5g水稻 新鮮葉片分別放入到已編號（編號同表1樣品來源表）的8個1.5mL離心管中，每個樣品的均 按以下操作進行：
[0036] (1)在放入水稻新鮮葉片的1.5mL離心管中加入液氮并快速研磨成粉末狀，待液氮 揮發(fā)完畢后加入2 X CTAB緩沖液700yL，放入65 °C水浴鍋中l(wèi)h，每隔20min混勻一次。
[0037] (2)取出離心管，10000 Xg，離心10min。取上清液至已編號的（編號同表1樣品來源 表)1.5mL新離心管。
[0038] (3)在上清液中加入700yL氯仿異戊醇混合液，氯仿異戊醇混合液為三氯甲烷:異 戊醇(V/V) = 24:1，顛倒混勾至分層明顯。10000 Xg，離心10min，取600μ1上清液移至已編號 (編號同表1樣品來源表)的1.5mL新離心管。
[0039] (4)重復步驟(3)。
[0040] (5)在上清液中加入等體積預冷的異丙醇，將離心管輕輕顛倒混勻約lmin后，-20 °c冰箱中沉降lh。
[0041 ] (6)取出后，lOOOOXg，離心10min。棄上清液，白色沉淀用70%乙醇洗滌后再用 95%乙醇洗滌。
[0042] (7)風干后，加100yL已滅菌的雙蒸水，現(xiàn)用或-20 °C冰箱保存。
[0043] 提DNA過程大約需3h。
[0044] 3、PCR 擴增
[0045] (1)引物序列來源及設(shè)計
[0046] 從已發(fā)表的文獻中選取引物。atp6-〇rf 79和LD30來自文獻：Luan et al .， Mitochondrial DNA genetic polymorphism in thirteen rice cytoplasmic male sterile lines，Plant Cell R印，2013,32(4) :545-554。全部引物由華大基因（BGI)合成。
[0047] (2)PCR 反應(yīng)：
[0048] 將滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和相應(yīng)保持系材料8個樣品，每個樣品分成兩份，其中 一份用引物atp6-〇rf 79進行PCR擴增，另一份用引物LD30進行PCR擴增，詳見如下操作：
[0049] A.引物atp6-〇rf79分別對滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和相應(yīng)保持系材料共8個樣品 進行PCR反應(yīng)，每個樣品PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25yL，其中Taq PCR Master Mix 12.5yL (購自北京博邁德公司），20pmo 1 /1上游引物atp6-〇rf 79F 0 · 25yL，20pmo 1 /L下游引物&七？6-orf79R 0.25yL，模板DNA lyL，無菌雙蒸水IlyL。所述上游引物atp6-〇rf79F的堿基序列如 SEQ ID N0:1所示，下游引物atp6-〇rf79R的堿基序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，目標產(chǎn) 物片段長度為1592bp。
[0050] 按照上述配制完成8個樣品atp6-〇rf79的PCR反應(yīng)后，將PCR管放入Eppendorf PCR 儀中，設(shè)置引物atp6-〇rf 79的PCR反應(yīng)程序進行如下反應(yīng):94 °C預變性4min，循環(huán)內(nèi)94 °C變 性30s，55°C退火30s，72°C復性2min，30個循環(huán)后72°C延伸10min，耗時104min(每次可同時 檢測96個樣品）。
[0051 ] B.引物LD30分別對滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和相應(yīng)保持系材料共8個樣品進行PCR 反應(yīng)，每個樣品PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25yL，其中Taq PCR MasterMix 12.5yL(購自北 京博邁德公司），20pmol/L上游引物LD30F 0.25yL，20pmol/L下游引物LD30R 0.25yL，模板 DNA lyL，無菌雙蒸水IlyL;所述上游引物LD30F的堿基序列如SEQ ID N0:3所示，下游引物 LD30R的堿基序列如SEQ ID N0:4所示，目標產(chǎn)物片段長度為788bp。
[0052] 按照上述配制完成8個樣品LD30的PCR反應(yīng)后，將PCR管放入Eppendorf PCR儀中， 設(shè)置引物atp6-〇rf 79的PCR反應(yīng)程序進行如下反應(yīng):94°C預變性4min，循環(huán)內(nèi)94°C變性30 s， 55°C退火30s，72°C復性2min，30個循環(huán)后72°C延伸10min，耗時104min(每次可同時檢測96 個樣品）。
[0053 ] (3)待滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和相應(yīng)保持系材料共8個樣品的2個引物的PCR反應(yīng) 完成后，各取5yLPCR擴增產(chǎn)物，分別采用2%的瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠(EB)染色，在電壓 120V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。
[0054] (4)特異引物在4個滇I型細胞質(zhì)雄性不育系和4個相應(yīng)保持系的電泳結(jié)果如圖1， 結(jié)果可見，4個滇I型不育系中，特異引物atp6-〇rf79和LD30分別擴增出1592bp和788bp的單 一條帶。4個保持系中，特異引物atp6-〇rf79和LD30均無擴增帶。表明本發(fā)明方法能將滇I型 水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系快速、準確的鑒別出來。
[0055]由于兩個引物的PCR反應(yīng)條件相同，整個鑒別過程可在同一臺PCR儀上同時進行 (可同時鑒別48個樣品），其檢測速度快，耗時約7h。
【主權(quán)項】
1. 鑒別滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的特異引物，其特征在于:所述特異引物 由引物atp6-〇rf 79和引物LD30組成;所述引物atp6-〇rf 79由上游引物atp6-〇rf 79F和下游 引物atp6-〇rf79R組成，所述上游引物atp6-〇rf79F的堿基序列如SEQ ID N0:1所示，下游引 物atp6-〇rf79R的堿基序列如SEQ ID N0:2所示，目標產(chǎn)物片段長度為1592bp;所述引物 LD30由上游引物LD30F和下游引物LD30R組成，所述上游引物LD30F的堿基序列如SEQ ID N0:3所示，下游引物LD30R的堿基序列如SEQ ID N0:4所示，目標產(chǎn)物片段長度為788bp。2. 滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系和保持系的PCR鑒別方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 從水稻材料中提取DNA樣品，每個DNA樣品分為兩份，一份用權(quán)利要求1中所述的引 物atp6-〇rf 79進行PCR反應(yīng)，另一份用權(quán)利要求1中所述的引物LD30進行PCR反應(yīng)； (2) PCR 反應(yīng)： A. 引物atp6-〇rf79對每個DNA樣品的PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25yL，其中Taq PCRMaster Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物atp6-〇rf79F 0.25yL，20pmol/L下游引物&七口6-orf79R 0.25yL，模板DNA lyL，無菌雙蒸水1 lyL;完成PCR反應(yīng)后，放入EppendorfPCR儀中， 設(shè)置引物atp6-〇rf 79的PCR擴增程序為：94°C預變性4min，循環(huán)內(nèi)94°C變性30s，55 °C退火 30s，72°C 復性 2min，30 個循環(huán)后 72°C 延伸 lOmin; B. 引物LD30對每個DNA樣品的PCR擴增反應(yīng)體系總體積為25yL，其中Taq PCRMaster Mix 12.5yL，20pmol/L上游引物LD30F 0.25yL，20pmol/L LD30R 0.25yL，模板DNA lyL，無 菌雙蒸水1 lyL;完成PCR反應(yīng)后，放入EppendorfPCR儀中，設(shè)置引物LD30的PCR擴增程序為： 94°C預變性4min，循環(huán)內(nèi)94°C變性30s，55°C退火30s，72°C復性2min，30個循環(huán)后72°C延伸 lOmin； (3) 各取5yL PCR擴增產(chǎn)物，分別采用2%的瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色，在電壓 120V下電泳30分鐘，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照； (4) 鑒別：同一樣品分別用引物atp6-〇rf79和引物LD30分別擴增出1592bp和788bp單一 條帶的，該樣品為滇I型水稻細胞質(zhì)雄性不育系；同一樣品分別用引物atp6-〇rf79和引物 LD30分別擴增，均無擴增條帶的，該樣品為保持系。
【文檔編號】C12N15/11GK105969886SQ201610479316
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】朱高倩, 譚學林, 陳麗娟, 譚亞玲, 徐津, 李娟 , 金壽林, 黃大軍, 字秋艷, 鄭玉珍, 閆誠強, 柳展, 姜珍珍
【申請人】云南農(nóng)業(yè)大學