創(chuàng)制光溫敏不育系的方法及其在植物育種中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種創(chuàng)制光溫敏不育系的方法及其在 植物育種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于傳統(tǒng)去雄手段耗時(shí)費(fèi)力，雄性不育系在雜交制種，提高農(nóng)業(yè) 產(chǎn)量中有巨大的優(yōu)勢(shì)。雄性不育往往被分為細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CM巧W及細(xì)胞核雄性不育 (GM巧。H系雜交體系的建立依賴于細(xì)胞質(zhì)雄性不育。然而，有幾個(gè)缺點(diǎn)阻礙了H系配套雜 交在實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。首先，細(xì)胞質(zhì)雄性不育植株普遍存在著品質(zhì)較差的的問(wèn)題；其次， H系雜交水稻的組合增產(chǎn)潛力越來(lái)越小。再次，由于野敗類型的雄性不育細(xì)胞質(zhì)單一，一旦 胞質(zhì)不育喪失或某種毀滅性病蟲害發(fā)生，會(huì)造成巨大損失。隨著細(xì)胞核雄性不育中光溫敏 條件性雄性不育的發(fā)現(xiàn)，兩系法雜交水稻應(yīng)運(yùn)而生。相對(duì)于H系雜交法，光溫敏不育系兼有 不育系和保持系兩種狀態(tài)。與H系法相比，兩系法具有不受恢保關(guān)系的限制，既核不育可W 與大量常規(guī)品種雜交，配組自由，因而更容易獲得優(yōu)良性狀的雜交優(yōu)勢(shì)，從根本上解決H系 中雄性不育細(xì)胞質(zhì)單一化的問(wèn)題。近年來(lái)，兩系雜交水稻在中國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用越來(lái)越 廣泛。
[0003] 早在1973年，石明松在中國(guó)湖北省從晚梗品種（Oryza sativa ssp. japonica) 農(nóng)呈58中選育出光敏感不育系并提出了一系兩用的水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用新途徑。隨后，W農(nóng) 呈58S(NK58巧為父本，與釉稻雜交獲得的培矮64S(PA64巧也在兩系雜交中得到廣泛應(yīng)用。 但培矮64S的育性對(duì)于溫度的變化更加敏感。在水稻中，光溫敏不育系受到單基因隱性位 點(diǎn)控制。最近的研究表明，農(nóng)呈58S與培矮64S的不育性狀受到同一個(gè)遺傳位點(diǎn)的控制，而 溫度和光照都會(huì)對(duì)該位點(diǎn)產(chǎn)生影響，送些發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)光溫敏育性轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制更加難 W理解。
[0004] 目前為止，水稻中共有+ S個(gè)光溫敏不育系被發(fā)現(xiàn)；pmsl, pms2, pms3, r pmsl, rpms2, tmsl, tms2, tms3, tms4, tms5, tms6, rtmsl W 及 Ms-h,分另U 定位在第 7, 3, 12, 8, 9, 8, 7, 6, 2, 2, 5, 10和9條染色體上。光溫敏不育在番茄，玉米W及小麥中也有 報(bào)道。最近的研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)突變的小3酷(3111曰111?酷)，〇3曰-31111?5864111,導(dǎo)致911132^及口/ tms2-l (農(nóng)呈58S和培矮64巧突變體的不育表型。然而，光溫敏不育的分子機(jī)理仍然不清 楚，使得人們?nèi)狈τ行У睦碚撝С趾图夹g(shù)手段來(lái)解決兩系育種中實(shí)際問(wèn)題。
[0005] 鑒于擬南芥較小的基因組，快速的生長(zhǎng)周期W及大量的突變體庫(kù)等無(wú)可比擬的優(yōu) 勢(shì)，使其在植物生物學(xué)研究領(lǐng)域成為模式植物。此外，擬南芥能夠在嚴(yán)格控制溫度，光照等 條件的狹小空間中進(jìn)行培養(yǎng)。前人的研究發(fā)現(xiàn)了一些擬南芥條件不育突變體，如PEAMT基 因突變體t365 W及GA^AA生物合成受阻的ms33突變體都表現(xiàn)為溫敏不育表型。
[0006] 然而，目前本領(lǐng)域中尚缺少調(diào)控方式簡(jiǎn)便的植物不育系用于植物育種過(guò)程中，因 此迫切需要調(diào)控方式簡(jiǎn)單方便的植物不育系培育技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種培育植物光溫敏不育系的方法，包括降低花粉發(fā)育相關(guān) 的GD化醋酶表達(dá)或活性來(lái)創(chuàng)制光溫敏植物材料，從而解決目前核不育光溫敏遺傳位點(diǎn)少， 制種純度不高的問(wèn)題。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種培育植物不育系的方法，包括步驟；降低所述植 物植株中花粉發(fā)育相關(guān)的GD化醋酶的表達(dá)或活性。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的GD化醋酶參與所述植物的花粉發(fā)育過(guò)程的脂類代謝。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的GD化醋酶將甘油H醋水解為甘油和脂肪酸。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的"降低"是指將所述植株中在花粉發(fā)育過(guò)程中GD化醋酶 的表達(dá)活性降低滿足W下條件：
[0012] A1/A0的比值《80 %，較佳地《60 %，更佳地《40 %，最佳地為0-30 % ;
[0013] 其中，Al為所述植株中花粉發(fā)育相關(guān)的GD化醋酶的酶活性；AO為野生型同種類型 植物植株中相同GD化醋酶的酶活性。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述GD化醋酶為TMFl或其同源蛋白。
[001引在另一優(yōu)選例中，所述TMFl的野生型氨基酸序列選自下組；SEQ ID NO. : USEQ ID NO. :2、沈Q ID NO. :3、沈Q ID NO. :4、沈Q ID NO. :5 和沈Q ID NO. :6。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述GD化醋酶是選自下組的細(xì)胞、組織或器官中特異性表達(dá) 的：植物花序W及花藥中。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述細(xì)胞或組織包括；絨租層、小抱子母細(xì)胞、或其組合。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述GD化醋酶在花藥發(fā)育期特異性表達(dá)。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的花藥發(fā)育期包括前花藥形成階段（-3天~0天）、花藥形 成階段、后花藥形成階段（花藥形成后1-5天）。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述GD化醋酶在花藥發(fā)育第6期特異表達(dá)。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述GD化醋酶在花粉減數(shù)分裂期達(dá)到表達(dá)最高峰。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述降低植物植株中花粉發(fā)育相關(guān)的GD化醋酶活性的方法包 括：使GD化醋酶編碼基因的表達(dá)水平下降、和/或使GD化醋酶活性下降。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的下降指與野生型GD化醋酶的表達(dá)水平EO相比，所述植 株中花粉發(fā)育相關(guān)的GD化醋酶的表達(dá)水平El為野生型的0-80%，較佳地0-60 %，更佳地 0-40%;和/或與野生型的花粉發(fā)育相關(guān)的GD化醋酶的酶活性AO相比，所述植株中花粉發(fā) 育相關(guān)的GD化醋酶的酶活性Al為野生型的0-80 %，較佳地0-60 %，更佳地0-40 %。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的降低植株中GD化醋酶活性通過(guò)選自下組的方式實(shí)現(xiàn)： 基因突變、基因敲除、基因中斷、RNA干擾技術(shù)、或其組合。
[00巧]在另一優(yōu)選例中，所述GD化醋酶編碼基因?yàn)門MFl基因。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述TMFl基因能夠編碼沈Q ID NO. :1、沈Q ID NO. :2、沈Q ID NO. :3、沈Q ID NO. :4SEQ ID NO. :5 或沈Q ID NO. :6 所示氨基酸序列。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：降低所述植株中TMFl基因的表達(dá)水平、缺 失TMFl基因和/或致TMFl基因突變來(lái)實(shí)現(xiàn)降低植株中GD化醋酶的表達(dá)或活性。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物包括農(nóng)作物、林業(yè)植物、花弁；優(yōu)選地包括禾本科，豆 科W及十字花科植物，更優(yōu)選地包括水稻、玉米、高梁、小麥、大豆或擬南芥。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物選自：十字花科度rassicaceae)植物、鼠耳芥屬 (Ar油idopsis)植物、擬南芥（A. thaliana)。
[0030] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種花粉發(fā)育相關(guān)的GD化醋酶或其編碼基因的用途， 用于培育植物不育系、或用于制備培育植物不育系的試劑或試劑盒。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的編碼基因?yàn)門MFl基因。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述TMFl基因能夠編碼沈Q ID NO. :1、沈Q ID NO. :2、沈Q ID NO. :3、沈Q ID NO. :4、沈Q ID NO. :5或沈Q ID NO. :6所示氨基酸序列。
[0033] 本發(fā)明的第H方面，提供了一種將植物從不育轉(zhuǎn)為可育的方法，包括步驟；降低花 粉細(xì)胞膜合成速度、和/或延緩花粉發(fā)育速度。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的植物是花粉發(fā)育相關(guān)的GD化醋酶的表達(dá)或活性水平下 降的植物。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述植物為根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法培育的植物 不育系。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括；降低花粉細(xì)胞膜合成速度，從而延緩花粉發(fā)育。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括；降低植株代謝水平，從而降低花粉細(xì)胞膜合成速 度。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述降低或延緩是通過(guò)W下方式實(shí)現(xiàn)；降低植株生長(zhǎng)的環(huán)境溫 度、減少植株的光照時(shí)間、或組合。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，降低植株生長(zhǎng)的環(huán)境溫度包括將環(huán)境溫度（平均溫度）控制在 17-22°C，更優(yōu)選地為 17-20°C，如 17°C、18°C、19°C或 20°C。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，降低植株生長(zhǎng)的環(huán)境溫度的時(shí)間包括花藥形成階段，花粉成熟 階段W及開(kāi)花授粉階段，或其前后2周。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，在植株抽臺(tái)或抽穗時(shí)開(kāi)始降低植株的生長(zhǎng)溫度，低溫培育3-10 天后，恢復(fù)正常溫度培育。
[0042] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種植物育種方法，包括維持植株不育的步驟；將植 株由不育轉(zhuǎn)為可育的步驟；和，維持植株可育并育種的步驟；
[0043] 在所述維持植株不育的步驟中，包括，對(duì)根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法培育的植物 不育系進(jìn)行維持；
[0044] 在將植株由不育轉(zhuǎn)為可育的步驟中，包括，利用根據(jù)本發(fā)明第H方面的方法將植 株由不育轉(zhuǎn)為可育。
[0045] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞發(fā)育成的植株中花粉發(fā) 育相關(guān)的GD化醋酶的表達(dá)或活性降低。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述GD化醋酶為TMFl。
[0047] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0048] 圖1顯示低溫能夠恢復(fù)雄性不育tmfl突變體的育性
[0049] a. Ler植株的正常可育表型。
[0050] b.在正常條件下，tmfl突變體的短小果芙不含種子。
[0051] C.低溫條件下tmfl突變體植株完全恢復(fù)育性。
[00閲 d-f.比較野生型，tmfl (24 °C )和tmfl (17 °c )果芙的種子；野生型（d)和 tmfUUC ) (f)是有許多可育果芙，但是tmn(24t： ) (e)的短小果芙中沒(méi)有種子。
[00閲 g-i.野生型和tmfl突變體花藥的亞歷山大染色。野生型（g)和tmfl (17°C ) (i) 花藥中充滿了紫色有活力的花粉，然而，在tmfl (24C)花藥訊中只有綠色的殘余表明花 粉敗育。Bar = IOOum。
[0054] j. 17C不同持續(xù)時(shí)間處理下tmfl突變植株恢復(fù)可育果芙的數(shù)量。
[00巧]k.在不同溫度處理下tmfl突變植株可育表型的變化，24C時(shí)果芙短小不育，在 17C處理時(shí)果芙恢復(fù)育性，將突變體重新置于24C時(shí)突變體又呈現(xiàn)不育表型。
[0056] 1.在不同植物生長(zhǎng)階段的低溫處理，表明只有當(dāng)生殖器官出現(xiàn)時(shí)突變體育性才能 被低溫所恢復(fù)。
[0057] 圖2顯示tmfl突變體育性恢復(fù)的臨界溫度W及恢復(fù)時(shí)間
[0058] a. tmfl育性恢復(fù)的臨界溫度W及在不同溫度下的tmfl可育恢復(fù)率；b.低溫處理 后tmfl育性恢復(fù)的時(shí)間。
[0059] 圖3顯示恢復(fù)突變體花粉發(fā)育階段的半薄切片分析
[0060] 野生型（a)和tmfl (24C )化）W及tmfl (17°c ) (C)花藥的半薄切片。在第7期 花藥中，野生型和tmfl (24C或17C )突變體花藥沒(méi)有可觀察到的區(qū)別。在第8期，野生 型和tmfl (24°C或17°C)突變體藥室中，小抱子成功的從四分體中釋放。在第9期，在 tmfl (24C)中有些小抱子開(kāi)始降解，然而在tmfl (17°C)中的小抱子與野生型的一致。在 第10期，大多數(shù)tmfl (24C)的小抱子細(xì)胞質(zhì)皺縮且降解。然而，tmfl (17°C)中大部分恢 復(fù)的小抱子較為正常。在第11期，大多數(shù)tmfl (24C )的小抱子在藥室中降解，而除了個(gè)別 敗育的小抱子tmfl (17°C)中的花粉粒出現(xiàn)。在第12期，tmfl (17°C)中出現(xiàn)成熟花粉粒， 但是在tmfl (24C)僅有降解的細(xì)