一種三順反子表達(dá)載體、制備方法及應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明設(shè)及一種=順反子表達(dá)載體，同時(shí)還設(shè)及該表達(dá)載體的制備方法和應(yīng)用，屬于基因工程
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?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]抗體是一種由抗原誘導(dǎo)、淋己細(xì)胞(漿細(xì)胞)合成與分泌的具有特殊氨基酸序列的免疫球蛋白。單克隆抗體(Monoclonalantibodies，mAbs)具有高度的特異性，因而被大量用于各種疾病尤其是癌癥和自身免疫性疾病的治療。自1986年第一個單克隆抗體藥物化thocloneOkt3上市W來，已經(jīng)有35種單克隆抗體藥物相繼批準(zhǔn)上市。目前，單克隆抗體是增長最快的一類生物醫(yī)藥分子，越來越受到學(xué)者及制藥企業(yè)的關(guān)注。大多數(shù)單克隆抗體(免疫球蛋白G)由兩個相同的重鏈化C)和兩個相同的輕鏈化C)多膚通過二硫橋組裝產(chǎn)生。[0003]隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，抗體的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能逐步得到闡明，結(jié)合重組DNA技術(shù)，近年來基因工程重組抗體產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生。單克隆抗體真核表達(dá)載體構(gòu)建主要是將輕鏈和重鏈分別克隆到2個獨(dú)立的表達(dá)載體上，從而表達(dá)出完整的抗體(Guidelinestocellengineeringformonoclon曰Iantibodyproduction.EurJPh曰rmBioph曰rm.2010)〇每個基因在各自的啟動子驅(qū)動下獨(dú)立進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。但是，運(yùn)類載體的缺陷在于重鏈與輕鏈表達(dá)的比例不均衡，而二者的比例影響單克隆抗體的質(zhì)量，如聚合和糖基化（IRES-mediatedTricistronicvectorsforenhancinggenerationofhighmonoclon曰IantibodyexpressingCHOcelllines.JBiotechnol.2012)。雖然有些載體能同時(shí)表達(dá)抗體重鏈與輕鏈(專利申請?zhí)?201110380100.8,一種抗體的高效表達(dá)載體及其制備方法），但是由于其篩選標(biāo)記基因與重鏈、輕鏈基因不在同一編碼框，會導(dǎo)致篩選的某些陽性克隆不表達(dá)目的$白，出現(xiàn){段^曰t生拿田胞克隆（Vectorfr曰邑ment曰tion:characterizingvectorintegrityintransfectedclonesbySouthernblotting.BiotechnoIProg.2010)。[0004]此外，在CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，高水平持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株往往難W得到，運(yùn)是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的隨機(jī)整合，使有些轉(zhuǎn)基因發(fā)生沉默或者表達(dá)水平降低，因此需要從大量細(xì)胞克隆株中分離出穩(wěn)定高效表達(dá)的克隆細(xì)胞株，運(yùn)也給基因工程產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來了很大困擾(Astudyofmonoclonalantibody-producingCHOcelllines:whatmakesastablehighp;roducer?Biotechnol.Bioeng.2009)。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列（matrixattachmentregion,MAR)是限制酶消化后仍附著在核基質(zhì)上的DNA序列，長度為300~SOOObp，富含AT堿基對（>60%)，W及幾個短的"共有序列"，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(門胖1胖門胖1'1')、0難鏈解旋序列（4414141'1'1'或44141'1')、拓?fù)洚悩?gòu)酶11結(jié)合位點(diǎn)(GTNWAYATTNATNNR)等。研究表明，MAR序列能提高CHO表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平，同時(shí)降低轉(zhuǎn)化株轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平差異（Genome-widepredictionofmatrixattachmentregionsthatincreasegeneexpressioninmammaliancells.Nat.Methods.2007；PositionaleffectsofthematrixattachmentregionontransgeneexpressioninstablytransfectedCHOcells.CellBiol.Int.2010)〇【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的是提供一種=順反子表達(dá)載體，該載體能同時(shí)表達(dá)抗體的重鏈、輕鏈W及篩選標(biāo)記基因，提高陽性細(xì)胞克隆篩選率，載體上含有的MAR序列還能克服轉(zhuǎn)基因沉默，提高抗體蛋白表達(dá)水平，并提高后續(xù)單克隆抗體細(xì)胞株篩選的有效性。[0006]同時(shí)，本發(fā)明還提供一種=順反子表達(dá)載體的制備方法。[0007]最后，本發(fā)明再提供一種=順反子表達(dá)載體的應(yīng)用。[0008]為了實(shí)現(xiàn)W上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：[0009]一種=順反子表達(dá)載體，包括在啟動子上游和化IyA下游引入的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列，W及由IRESwtJRESatt序列連接而成的；順反子序列，S順反子序列的結(jié)構(gòu)為：啟動子-輕鏈信號膚SPL-IRESwt-重鏈信號膚S扣-IRESatt-篩選標(biāo)記-PolyA。[0010]所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列優(yōu)選為0-珠蛋白MAR序列（GenBank登錄號：L22754.1，第840~2998位堿基）。[0011]所述啟動子選自5￥40、〔1￥、6。-1〇、〔46等中的任一種。優(yōu)選為5￥40啟動子，核巧酸序列如沈QIDNO:3所示。[0012]所述輕鏈信號膚SPl的核巧酸序列如SEQIDNO:4所示。[0013]所述IRESwt為腦屯、肌炎病毒化ncephalomyocaralitiSvirus，EMCV)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internalribosomalentrysite,IREs),其核巧酸序列如沈QIDNO:1所示。[0014]所述重鏈信號膚S扣的核巧酸序列如SEQIDNO:5所示。[0015]所述IRESatt為突變的腦屯、肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，其核巧酸序列如SEQIDNO:2所示。[0016]所述篩選標(biāo)記選自新霉素憐酸轉(zhuǎn)移酶（neomycinphosphohansferase，NPT)、博來霉素（zeocin/zeomycin)抗性基因等中的任一種。優(yōu)選為NPT抗性弱化基因，核巧酸序列如沈QIDNO:6所示。[0017]上述=順反子表達(dá)載體可采用常規(guī)方法構(gòu)建。具體的，包括W下步驟：[001引1)分別采用MluI和EcoRI酶雙酶切SEQIDN0:9所示序列和pIRES-化O載體，回收酶切片段，連接、轉(zhuǎn)化后鑒定，得到pIRES-101載體；[0019]2)分別采用SmaI和化rl酶雙酶切沈QID^:10所示序列和91365-101載體，回收酶切片段，連接、轉(zhuǎn)化后鑒定，得到pIRES-102載體；[0020]3)分別采用化Cl和化rl酶雙酶切沈QID^:11所示序列和91365-102載體，回收酶切片段，連接、轉(zhuǎn)化后鑒定，得到pIRES-103載體；[0021]4)分別采用SwaI和XbaI酶雙酶切沈QIDNO:12所示序列和pIRES-103載體，回收酶切片段，連接、轉(zhuǎn)化后鑒定，得到PIRES-104載體；[0022]5)分別在pIRES-104載體的SV40啟動子的化uI、MluI酶切位點(diǎn)之間W及polyA下游的化OI、BstZ171酶切位點(diǎn)之間插入0-珠蛋白MAR序列，即得。[0023]上述=順反子表達(dá)載體的應(yīng)用，具體為將單克隆抗體的重鏈可變區(qū)基因序列插入輕鏈信號膚SPl與IRESwt之間，輕鏈可變區(qū)基因序列插入重鏈信號膚S扣與IRESatt之間，構(gòu)建重組載體;將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，隨宿主細(xì)胞復(fù)制表達(dá)目的蛋白。[0024]所述單克隆抗體如為抗CD20單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDNO:7所示，輕鏈可變區(qū)基因序列如SEQIDN0:8所示。[00巧]本發(fā)明的有益效果：[0026]本發(fā)明中=順反子表達(dá)載體包括核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列W及由兩個內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列連接而成的S順反子序列，S順反子序列的結(jié)構(gòu)為：啟動子-輕鏈信號膚SPl-IRESwt-重鏈信號膚SPH-IRESatt-篩選標(biāo)記-PolyA。該載體能同時(shí)表達(dá)抗體的輕鏈、重鏈W及篩選標(biāo)記基因，克服傳統(tǒng)載體重鏈、輕鏈及篩選標(biāo)記基因表達(dá)不均衡的問題，提高抗體質(zhì)量及陽性細(xì)胞克隆篩選率，同時(shí)載體上含有的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列還能克服轉(zhuǎn)基因沉默，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因在宿主細(xì)胞中的高效、長期表達(dá)，一方面提高抗體蛋白表達(dá)水平，另一方面提高后續(xù)單克隆抗體細(xì)胞株篩選的有效性?！靖綀D說明】[0027]圖1為pIRES-Neo載體的結(jié)構(gòu)示意圖；[0028]圖2為pIRES-101載體的結(jié)構(gòu)示意圖；[0029]圖3為pIRES-102載體的結(jié)構(gòu)示意圖；[0030]圖4為pIRES-當(dāng)前第1頁1 2 3 4