103載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0031] 圖5為pIRES-104載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032] 圖6為pIRES-105載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0033] 圖7為pIRES-106載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0034] 圖8為抗CD20抗體在CHO-Kl細(xì)胞中的表達(dá)；
[0035] 圖9為抗CD20抗體在不同載體下的表達(dá)水平及陽性克隆率對比。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成本發(fā)明的任何限制。除所列 舉實(shí)施例外，還可W有其他實(shí)施方式。但是，凡采用等同替換或等效變換獲得的任何技術(shù)方 案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] =順反子表達(dá)載體的構(gòu)建，包括W下步驟：
[0039] 1、pIRES-101載體的構(gòu)建（即在PlRES-Neo載體基礎(chǔ)上，用SV40啟動子替換CMV啟動 子，同時(shí)在MCS插入輕鏈信號膚序列，W及NdeI、化al酶切位點(diǎn)）
[0040] 1)合成SV40啟動子及輕鏈信號膚的融合序列
[0041 ] 根據(jù)報(bào)道的SV40啟動子序列(GenBank登錄號:KM359772.1，第2794~3247位堿基， 如沈Q ID NO: 3所示)及輕鏈信號膚序列(GenBank登錄號:Z69026.1，第1~66位堿基，如SEQ ID N0:4所示)人工合成SV40啟動子及輕鏈信號膚的融合序列（如SEQ ID N0:9所示），具體 交由通用生物基因（安徽）有限公司合成。為便于克隆，在合成融合序列時(shí)，5/端引入AGC ACGCGT序列，其中AGC為保護(hù)堿基，ACGCGT為MluI酶切位點(diǎn)；3/端引入PlRES-Neo載體的部分 序列（GenBank登錄號：U89673.1，第821~926位堿基）、輕鏈信號膚序列（GenBank登錄號 Z69026.1，第1~66位堿基）、NdeI、化al酶切位點(diǎn)及3個(gè)保護(hù)堿基，具體序列如下：
[0042] CTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGT ACCGAGCTCGGATCGATATCTGCGGCCGCATGGACATGAGGGTTCCTGCTCAGCTCCTGGGACTCCTGCTGCTCTGG CTCCCAGGTGCCAGATGTCATATG GTTAAC GAATTC CGA，其中下劃線部分為pIRES-Neo載體的部 分序列，斜體部分為輕鏈信號膚序列，CATATG為NdeI酶切位點(diǎn)，GTTAAC為化al酶切位點(diǎn)， GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)，CGA為保護(hù)堿基。
[0043] 2)構(gòu)建 pIRES-101 載體
[0044] 用MluI/EcoRI雙酶切合成的融合序列片段，同時(shí)用MluI/EcoRI雙酶切PlRES-化0 質(zhì)粒DNA(pIRES-Neo載體結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)。瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結(jié)果，凝膠回收酶切 后的融合序列片段、PlRES-Neo線形質(zhì)粒DNA。
[0045] 融合序列的雙酶切體系為:融合序列10化（Iiig/化），10XH buffer化UhkaRa公 司），MluI/EcoRI酶各1.0化(lOU/化），補(bǔ)足水至30化;酶切條件為:37°C，酶切3min。
[0046] pIRES-Neo質(zhì)粒的雙酶切體系為:pIRES-Neo質(zhì)?？跮(化gA^L)，10XHbuffer化L (TakaRa公司），MluI/EcoRI酶各0.化L(IOUAiL),補(bǔ)足水至20化;酶切條件為：37°C，酶切 3min〇
[0047] 取酶切后的融合序列和91365-化〇線形質(zhì)粒DNA(摩爾比5:1)，使用肥B公司?的連 接試劑盒，25°C連接5min。將連接產(chǎn)物加入到E.coli JM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液中進(jìn)行轉(zhuǎn) 化，取15化L轉(zhuǎn)化菌液接種在含有氨節(jié)青霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜，挑取單菌落繼代 培養(yǎng)，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切(MluI/EcoRI)驗(yàn)證，選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序驗(yàn) 證，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pIRES-101，結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。
[004引 2、pIRES-102載體的構(gòu)建（即在pIRES-101載體基礎(chǔ)上，插入重鏈信號膚序列、MieI 及化Cl酶切位點(diǎn)）
[0049] 1)合成重鏈信號膚
[0050] 根據(jù)報(bào)道的重鏈信號膚序列（參見專利文獻(xiàn):pHAb-FAST人源抗體表達(dá)載體系統(tǒng)及 其使用方法，【申請?zhí)枴?01510053657.9，如SEQ ID NO: 5所示)人工合成重鏈信號膚序列（如 SEQ ID NO: 10所示），具體交由通用生物基因（安徽)有限公司合成。為便于克隆W及保證序 列的完整性，在合成重鏈信號膚序列時(shí)，5/端引入AGC CCCGGG序列，其中AGC為保護(hù)堿基， CCCGGG為Sma I酶切位點(diǎn)；3 /端引入Nh e I、PaCI酶切位點(diǎn)、PI RE S-NeO載體的部分序列 (GenBank登錄號:U89673.1，第1892~2051位堿基）W及3個(gè)保護(hù)堿基，具體序列如下：
[0051 ] GCTAGC TTMTTM ATAATTCCTGCAGCCAATATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCACGC AGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCG CCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCC CGA，其中GCTAGC為NheI酶切位點(diǎn)，TTAATTAA為化cl酶 切位點(diǎn)，下劃線部分為PlRES-Neo載體的部分序列，CGA為保護(hù)堿基。
[0052] 2)構(gòu)建 pIRES-102 載體
[0化3] 用SmaI/化rl雙酶切合成的重鏈信號膚序列，同時(shí)用SmaI/化rl雙酶切pIRES-101 質(zhì)粒DNA，酶切體系及連接體系基本同步驟1，所用buffer為化tSmad Buffer(購自美國化W England Biolabs LTD,即肥B公司）。
[0054] 重鏈信號膚序列的雙酶切體系為:合成重鏈信號膚序列片段10化（化g/yL)，10X CutSmad Buffer化L，SmaI/化rl酶（lOU/化)各1.0化，補(bǔ)足水至30化，酶切條件為：37°C， 酶切3min。
[0055] pIRES-101 質(zhì)粒的雙酶切體系為：pIRES-101 質(zhì)?？跮(IygAiL) ,IOXCutSmad Buffer化L，Smal/NarI(lOU/化)各O. ，補(bǔ)足水至20化，酶切條件為:37°C，酶切3min。
[0化6] 取酶切后的重鏈信號膚序列片段和pIRES-101線形質(zhì)粒DNA(摩爾比5:1)，使用肥B 公司了^的連接試劑盒，25°C連接5min。將連接產(chǎn)物加入到E.coli JM109菌株感受態(tài)細(xì)胞懸液 中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，取15化L轉(zhuǎn)化菌液接種在含有氨節(jié)青霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單 菌落繼代培養(yǎng)，并進(jìn)行重組質(zhì)粒的雙酶切(SmalAferI)驗(yàn)證，選取酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行 測序驗(yàn)證，構(gòu)建正確的質(zhì)粒命名為pIRES-102,結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。
[0057] 3、pIRES-103載體的構(gòu)建（即在pIRES-102載體基礎(chǔ)上，插入IRESatt序列及SwaI酶 切位點(diǎn)）
[0化引 1)合成IRESatt序列
[0059] 根據(jù)報(bào)道的IRESatt序列(GenBank登錄號:JQ692169.1，第610~1197位堿基)及文 南犬（Ho SC,Bardor M,Li B,Lee JJ,Song Z,Tong YW,Goh LT,Yang Y.Comparison of internal ribosome entry site(IRES)and Furin-2A(F2A)for monoclonal antibody expression level and quality in CHO cells,PLoS One.2013May 21 ;8(5):e63247.)設(shè) 計(jì)IRESatt序列（如SEQ ID N0:2所示），并人工合成IRESatt序列（如沈Q ID NO: 11所示），具 體交由通用生物基因（安徽）有限公司合成。為便于克隆W及保證序列的完整性，在合成 IRESatt序列時(shí)，5^端引入AGC TTAATTAA序列，其中AGC為保護(hù)堿基，TTAATTAA為化Cl酶切位 點(diǎn)；3/端引入SwaI酶切位點(diǎn)、PlRES-Neo載體的部分序列(GenBank登錄號:U89673.1，第1892 ~2051位堿基），具體序列如下：
[0060] ATTTAAAT ATAATTCCTGCAGCCAATATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCT CCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGAC