華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟：他莫昔芬抑制劑配備、他莫昔芬注射液的配制、注射處理母本、冷休克+靜水壓處理、雌激素抑制劑溶液的配制、獲得華鯪魚雄性四倍體純系。通過此方法，可獲得100%的華鯪魚雄性四倍體純系，有效提高了四倍體的育成率及出苗率，相比雜交而言，能獲得純度更高、后代更為穩(wěn)定的雄性四倍體魚系，為不育三倍體華鯪魚的育成奠定了堅實的基礎(chǔ)。
【專利說明】
華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及華鯪魚的多倍體繁育方法，具體涉及華鯪魚雄性四倍體純系高效育成 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 華鯪屬鯉形目，鯉科，野鯪亞科，華鯪屬。俗稱:青龍棒，桃花棒，野鯪魚，青衣子。體 長，略呈棒狀，尾柄高而寬厚。吻鈍圓而突出，口下位，橫裂。上唇前部光滑，為游離的吻皮所 遮蓋，兩側(cè)則有細小的乳突；下唇游離部分的內(nèi)緣有許多小乳狀突，下唇與下頌分離，其間 有一深溝相隔，上頌為上唇所包。體背及體側(cè)青黑色，鱗片紫綠色夾有紅色，并具金屬光澤； 腹部微黃，各鰭灰黑色。三倍體華鯪魚的不育特征，使其在生長速度、抗逆性、抗病性以及肉 質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中，要獲得三倍體不育華鯪魚，最快捷有效的方 法是通過四倍體華鯪魚與二倍體華鯪魚倍間雜交獲得，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極 高的四倍體純系。但在華鯪魚的遺傳育種中，到目前為止還未見四倍體全雄華鯪魚高效育 成的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定、種群純度高 達1 〇〇%的華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法。
[0004] 為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50~100mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到400~500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用;催產(chǎn) 劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用〇. 9%生理鹽水稀釋配制，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素 的劑量為5-12 IU/g; (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為65~125yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1~〇°C的冷水中， 靜水壓壓力為220~280Kg/cm 2,持續(xù)時間為3~5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為80~160mg/l，睪酮 的濃度為20~50mg/l; (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%華鯪魚雄性四倍體純系。
[0005] 本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA復(fù)制和促雄性的 雙重作用的同時，推延了受精卵第一次卵裂的時間（3-5min)、提高了所有受精卵第一次卵 裂的同步程度(可達99%)，為操作下一步提供時間保障和奠定了染色體加倍的基礎(chǔ);2、在受 精卵一次卵裂采用冷休克與較低的靜水壓(低于常用的350kg/cm 2)，以及較短的處理時間 (低于5min)，不僅有效減少對受精卵的不良影響，提高受精卵的成活率，而且進一步強化四 倍體的轉(zhuǎn)化率;3、雌激素抑制劑溶液浸泡，再一次強化與保證雄性轉(zhuǎn)化率。因而通過此方 法，可獲得100%的華鯪魚雄性四倍體純系，有效提高了四倍體的育成率及出苗率，相比雜交 而言，能獲得純度更高、后代更為穩(wěn)定的雄性四倍體魚系，為不育三倍體華鯪魚的育成奠定 了堅實的基礎(chǔ)。
【具體實施方式】
[0006] 現(xiàn)結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。以下實施例僅為本發(fā)明優(yōu)選的實施 方式，而并非限制本發(fā)明的保護范圍，任何與本發(fā)明相同或相似的方案均視為本發(fā)明的保 護內(nèi)容。
[0007] 實施例一 華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到400ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的濃度約為〇. 125mg/ml，待用； (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為105yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為〇°C的冷水中，靜水 壓壓力為280Kg/cm 2,持續(xù)時間為5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為120mg/l，睪酮的濃度為 40mg/l； (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%華鯪魚雄性四倍體純系。
[0008] 實施例二 華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為l〇〇mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫 昔芬的濃度為〇. 2mg/ml，待用； (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為125yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1°C的冷水中，靜水 壓壓力為220Kg/cm 2,持續(xù)時間為3min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配 制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為160mg/l，睪酮的濃度為 50mg/l； (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡l〇s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%華鯪魚雄性四倍體純系。
[0009] 上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護范圍，任 意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式 及結(jié)果統(tǒng)計。
[0010] 附:華鯪魚雄性四倍體育成結(jié)果統(tǒng)計
注:上述結(jié)果是在注射液中他莫昔芬的濃度為〇.2mg/ml的條件下常溫浸泡10S，靜水壓 處理3分鐘所取得的結(jié)果。
【主權(quán)項】
1.華鯪魚雄性四倍體純系高效育成方法，包括如下步驟： (1) 他莫昔芬抑制劑配備:取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進行 溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為50~100mg/ml，待用； (2) 他莫昔芬注射液的配制:取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例 為lml他莫昔芬母液加入到400~500ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用;催產(chǎn) 劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用〇. 9%生理鹽水稀釋配制，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素 的劑量為5-12 IU/g; (3) 注射處理母本:在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進行人工注射他莫 昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為65~125yg/kg; (4) 冷休克+靜水壓處理:在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注 射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1~〇°C的冷水中， 靜水壓壓力為220~280Kg/cm 2,持續(xù)時間為3~5min; (5) 雌激素抑制劑溶液的配制:將氯米芬和睪酮一起溶于80%~90%的乙醇中，再加蒸餾 水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為80~160mg/l，睪酮 的濃度為20~50mg/l; (6) 取步驟(4)處理后的受精卵放入按步驟(5)所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸 泡10~30s，然后取出放于孵化器中正常孵化;從而獲得100%華鯪魚雄性四倍體純系。
【文檔編號】A01K61/00GK106069939SQ201610496055
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】楊品紅, 劉飛, 夏虎
【申請人】湖南文理學院