本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記及其應用。

背景技術：

煙草花葉病是由煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus, TMV）引起的，它是第一個被鑒定的單鏈正義病毒（Beijerinck MW, Uebereincontagiumvivumfluidumalsursachederfleckenkrankheit der tabaksblatter.VerhKonAkadWetensch, 1898, 5: 3-21），屬于花葉病毒家族（Dawson WOand Lehto KM, Regulation of tobamovirus gene expression, Adv. Virus.Res., 1990, 8: 307-342），具有傳染活性（Erickson FL,Holzberg S,Calderon-Urrea A,Handley V,Axtell M,Corr C,and Baker B, The helicase domain of the TMV replicase proteins induces the N-mediated defense response in tobacco. Plant J., 1999,18: 67-75）。因其宿主主要為包括煙草在內的茄科作物，嚴重影響煙葉的產量和品質，因此，對煙草產業(yè)造成巨大經濟損失。因此，選育抗病品種、提高煙草本身的抗病性是防治TMV的根本途徑。

N基因起源于煙草野生種粘毛煙草(Nicotianaglutinosa)，是一個顯性單基因（Gerstel DU, Inheritance in Nicotianatabacum.XIX. Identification of the tabacum chromosome replaced by one from N. glutinosa in mosaic-resistant holmessamsoun tobacco, Genetics, 1945, 30: 448-454），屬于TIR-NBS-LRR類抗病基因，介導煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)的抗性，通過轉座子標簽法得到克?。╓hitham S, Dinesh-Kumar S P, Choi D, HehlR,Corr C and Baker B, The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: Similarity to Toll and the Interleukin-1 Receptor, Cell , 1994, 78:1101-1115）。N基因很容易進入育種程序且能夠很快在選育品種中穩(wěn)定下來，僅僅導入N基因就可使煙草具有TMV抗性（Ternovsky M F, Methods of breeding tobacco varieties resistant to tobacco mosaic and powdery mildew, The A.I. Mikoyan pan Soviet Sci. Res. Inst. Tob. & Indian Tob.Ind. Krasnodar Publ, 1945, 143: 126-141），因此，通過選擇具有N基因的育種材料可選出有抗性的基因型(Wernsman EA, Sources of resistance to virus diseases, Coresta Inf. Bull., 1992, 3: 113-119)?；跓煵萜胀ɑㄈ~病抗性基因N的基因組序列，國內外的研究者成功的開發(fā)出多個用于檢測煙草TMV抗性的分子標記（Lewis R S, Milla S R, and Levin J S, Molecular and genetic characterization of Nicotianaglutinosa L. chromosome segments in tobacco mosaic virus resistant tobacco accessions, Crop Sci., 2005, 45(6): 2355-2362；袁清華, 陳俊標, 李淑玲, 馬柱文, 邱道壽, 張振臣,抗TMV煙草種質資源的N基因片段序列研究, 廣東農業(yè)科學, 2011, 1(29): 96-99；陳爽, 樸世領, 金愛蘭,煙草抗TMVN基因及其在分子標記輔助育種中的應用, 延邊大學農學學報, 2012, 34(4): 355-361；張玉, 羅成剛, 殷英, 胡小波, 戴培剛, 張波,煙草N基因及其在烤煙遺傳育種中的應用, 中國農學通報, 2013, 29(19): 89-92），同時建立了相應的檢測體系（劉磊, 郭兆奎, 萬秀清, 顏培強, 喬嬋, 劉丹, N基因標記基因PCR檢測方法的建立及其在遺傳育種中的應用, 分子植物育種, 2010, 8(1): 167-171），并將其中的部分檢測標記及方法申請了專利（CN101892304B；CN102140546B；CN103866038B）。但上述所有基于N基因開發(fā)的分子標記均是顯性標記，其在實際的煙草育種實踐中存在著嚴重的缺陷：1）不能區(qū)分材料中N基因的全部基因型，也即上述顯性標記只能分辨出材料中是否含有抗性基因N，而無法進一步的區(qū)分出純合抗性（NN）和雜合抗性（Nn）；2）無法確保其檢測結果的準確性，即利用上述的顯性標記在進行N基因檢測時，若無特征（目的）條帶出現(xiàn)時，并不能確定檢測材料是感病的，極有可能存在實驗因素造成的PCR擴增失??；3）檢測體系繁瑣，有部分標記是基于N基因的全長cDNA進行設計的，因而在實際檢測中涉及到RNA的提取、cDNA的合成及長片段DNA的PCR擴增等過程。鑒于此，開發(fā)一種能解決上述問題的方法是非常必要的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記；第二目的在于提供所述的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記的應用。

本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，所述的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記的編號為TM508-007和TM508-118，其擴增產物核苷酸序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，所述的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記在檢測煙草基因組DNA中是否存在煙草抗TMV病基因N中的應用。

為了簡便、高效選擇抗TMV病煙草品種，有針對性的、特異性的選擇含N基因的后代材料，本發(fā)明提供一種用于檢測煙草抗TMV病基因N的分子標記TM508-007和TM508-118，該分子標記采用分離群體分組分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，篩選獲得與煙草普通花葉病（TMV）N基因連鎖的共顯性SSR標記，可以用于煙草TMV抗性基因N的輔助選擇，以提高分子標記輔助選擇的效率及抗病品種選育的效率。

本發(fā)明利用Coker176（抗病親本，其TMV抗性由N基因控制）和Y3（綜合性狀優(yōu)良但易感TMV）構建回交一代（BC1F1）作圖群體，采用分離群體分組分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，篩選與煙草普通花葉?。═MV）N基因連鎖的共顯性SSR標記，加速分子標記輔助選擇（Marker Assistant Selection， MAS）在煙草TMV抗性品種選育中的利用。

本發(fā)明所述的共顯性SSR標記具有穩(wěn)定、可靠、簡便、快捷和低成本的特點，因此該分子標記可以作為煙草TMV病抗病育種中N基因分子標記輔助選擇的應用。

附圖說明

圖1 是與煙草TMV抗性基因N連鎖的共顯性SSR標記在5份材料中的PCR擴增產物凝膠電泳圖；

其中，A，共顯性SSR標記TM508-007；B，共顯性SSR標記TM508-007；RB，抗病池；SB，感病池；RP，抗病親本（Coker176）；SP，感病親本（Y3）；F1，兩親本間的雜交子一代；M，500bp DNA ladder，長度片段分別為：100bp，150bp，200bp，300bp，400bp，500bp；

圖2 是共顯性SSR標記TM508-007在123個BC1F1單株中的PCR擴增產物凝膠電泳圖；

其中，編號70（帶黑色星星）為單交換單株；1-123為BC1F1單株編號；編號1-66，感病單株編號；編號67-123，抗病單株編號；RP，抗病親本Coker176；SP，感病親本Y3；F1，雜交子一代；

圖3是共顯性SSR標記TM508-118在123個BC1F1單株中的PCR擴增產物凝膠電泳圖；

其中，編號69（帶黑色星星）為單交換單株；1-123為BC1F1單株編號；編號1-66，感病單株編號；編號67-123，抗病單株編號；RP，抗病親本Coker176；SP，感病親本Y3；F1，雜交子一代；

圖4是共顯性SSR標記T508-007和TM508-118分別與煙草TMV抗性基因N的連鎖關系；

其中，左側為標記（基因）名稱；右側為標記與N基因間的遺傳距離（單位為：cM）。

具體實施方式

下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明所述的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記的編號為TM508-007和TM508-118，其擴增產物核苷酸序列分別為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

所述的分子標記所對應的2個位點的引物序列分別為：

TM508-007序列為TM508-007F：5’- CACCATGGTTTGGCTTTCAT -3’，

TM508-007R：5’- GCAAAATGCAAAAAGGCAAT -3’；

TM508-118序列為TM508-118F：5’- ACCAACATGGCCAAACCTTA -3’，TM508-118R：5’- GCGAGGAAAAGCCAGTAAAA -3’。

本發(fā)明所述的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記的應用為所述的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記在檢測煙草基因組DNA中是否存在煙草抗TMV病基因N中的應用。

所述的與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記的應用是分別以TM508-007序列的引物和TM508-118序列的引物分別擴增待檢測煙草基因組DNA，檢測PCR擴增產物，如果PCR擴增產物中分別含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列即為含有煙草抗TMV病的純和基因NN；如果PCR擴增產物中分別含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即為不含有煙草抗TMV病的純和基因NN，而含有其感病的純合等位基因nn；如果PCR擴增產物中含有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列，同時含有如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列即為含有煙草抗TMV病的雜合基因Nn。

以TM508-007序列的引物進行PCR擴增的反應體系為： 20uL，其中包含2.0 μL 的1× buffer （10 mM Tris-Cl, PH=8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂），200 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China），0.5 μM 的上下游引物（Takara），1.0 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH₂O補齊20uL，反應條件為：95℃預變性5分鐘，30個循環(huán)（95℃變性30秒，復性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分鐘，4℃保存。

以TM508-118序列的引物進行PCR擴增的反應體系為： 20uL，其中包含2.0 μL 的1×buffer （10 mM Tris-Cl, PH=8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂），200 μM 的 dNTPs（Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China），0.5 μM 的上下游引物（Takara），1.0 U 的 rTaq 聚合酶（Takara），20-50ng模板DNA，最后用ddH₂O補齊20uL，反應條件為：95℃預變性5分鐘，30個循環(huán)（95℃變性30秒，復性30s，72℃延伸30s），72℃延伸5分鐘，4℃保存。

下面以具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明：

實施例1

利用分離群體分組分析（Bulked Segregation Analysis, BSA）法，篩選與煙草抗TMV基因N連鎖的共顯性SSR標記

一、實驗材料

以綜合性狀優(yōu)良但易感TMV的烤煙Y3為母本，以抗TMV烤煙材料Coker176（其抗性由N基因控制）為父本。2014年種植抗、感TMV親本材料，經雜交，獲得F1。2015年種植F1和兩親本，以Y3為輪回親本，雜交獲得回交一代（BC1F1）群體。2016年種植兩親本、F1和BC1F1世代材料。

二、親本及BC1F1分離群體TMV抗性鑒定

試驗材料成苗后移栽至大田，行株距為100cm × 50cm；移栽3周后進行人工接種。接種時將帶TMV的病葉片磨碎后用水稀釋至1%，采用高壓噴槍接種病毒稀釋液，噴射壓力為1.5-2kg/cm²。

現(xiàn)蕾前開始調查病情，7天調查1次發(fā)病情況，取最后一次的調查數(shù)據(jù)進行以下分析，根據(jù)“TMV病害分級標準”進行分級。

0級：全株無??；

1級：心葉脈明或輕微花葉，植株無明顯矮化；

3級：上部少于1/3葉片花葉但不變形，或植株矮化為正常株高的3/4以上；

5級：1/3-1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，植株矮化為正常株高的2/3-3/4；

7級：1/2-2/3葉片花葉，或變形或主脈壞死，或植株矮化為正常株高的1/2-2/3；

9級：全株葉片花葉，嚴重變形或壞死，病株矮化為正常株高的1/3-1/2。

把0-1級定為抗病植株，3-9級定為感病植株。

三、SSR標記分析

在煙草幼苗長到4片葉左右時，采用改良的CTAB法（Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotianatabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco. Plant Breeding, 2012, 131: 674-680）提取所有參試材料的全基因組DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計測定提取后的DNA濃度和純度。

SSR-PCR的體系配制、產物擴增及擴增產物的6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（6%-non-PAGE）檢測，參照童治軍等（童治軍等.普通煙草及其祖先種基因組SSR位點分析.中國農業(yè)科學, 2015, 48(11): 2108-2117）提供的方法進行。SSR標記（引物）由兩部分構成，共18764對，其中，PT系列引物5119對（Bindler, et al. A high density genetic map of tobacco (NicotianatabacumL.) obtained from large scale microsatellite marker development.Theor. Appl. Genet., 2011, 123(2): 219-230），TM系列引物13645對（Tong ZJ, et al. Large-scale development of microsatellite markers in Nicotianatabacum and construction of a genetic map of flue-cured tobacco. Plant Breeding, 2012, 131: 674-680；Tong ZJ, et al. Large-scale development of SSR markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-cured tobacco. Breeding Science, 2016, 66: 381-390）。

四、 抗、感病基因組池的構建

采用分離群體分組分析法（Bulked Segregation Analysis, BSA），選取BC1F1分離群體中的極端抗?。?級抗病）單株和極端感?。?級感病）單株各15株的基因組DNA，等量混合構建抗、感池，用于引物多態(tài)性篩選和標記連鎖分析。

在苗期按實施例1所述方法，利用18764對SSR引物對抗病親本Coker176、感病親本Y3、兩親本間雜交子一代（F1）、抗病池和感病池共5份材料進行PCR擴增，篩選與煙草抗TMV基因N連鎖的共顯性SSR標記。篩選的結果如圖1所示：共顯性SSR標記TM508-007和TM508-118分別與煙草TMV抗性基因N連鎖，標記TM508-007和TM508-118在感病池與感病親本中的帶型完全一致，僅出現(xiàn)一條220bp（序列如SEQ ID NO.3）和230bp（序列如SEQ ID NO.4）的特異性條帶；在抗病池與F1中的帶型完全一致，呈現(xiàn)出共顯性的兩條特異性條帶（同時具有抗、感親本的特異性條帶，也即，同時呈現(xiàn)如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示序列及如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列）。其中，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列長度分別為228bp和190bp，分別是共顯性SSR標記TM508-007和TM508-118在含有N基因的抗TMV品種中的特異性PCR擴增條帶。

以上結果表明，標記TM508-007和TM508-118分別與煙草抗TMV基因N連鎖，且該標記為共顯性標記。PCR擴增產物中分別含有如ID NO.1（220bp）和SEQ ID NO.2（190bp）所示序列即為含有煙草抗TMV病的純合基因NN；PCR擴增產物中分別含有如ID NO.3（220bp）和SEQ ID NO.4（230bp）所示序列即含有其感病的純合等位基因nn；PCR擴增產物中同時含有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3或同時含有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示序列即含有煙草抗TMV病的雜合基因Nn。

實施例2

共顯性連鎖標記的圖距及其在BC1F1群體單株中的驗證

一、數(shù)據(jù)分析

首先，按實施例1所述方法進行煙草基因組DNA提取、純化，BC1F1群體單株TMV抗性鑒定和SSR標記分析。其次，利用通過BSA法篩選獲得的標記TM508-007和TM508-118對BC1F1群體中的123個單株進行基因型分析。最后，對各個單株的帶型進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，抗病雜合條帶標記做“H”，感病條帶標記做“A”，條帶不清晰或者無擴增條帶的記做“U”。

二、共顯性連鎖標記遺傳距離的計算

利用JoinMap 4.0軟件并結合BC1F1群體單株的TMV抗性鑒定數(shù)據(jù)，對共顯性SSR標記在BC1F1分離群體中的基因型數(shù)據(jù)進行遺傳連鎖分析，計算出其連鎖距離并繪制連鎖圖。

BC1F1群體單株TMV抗性鑒定的結果為：123個單株中，感病單株有66個，抗病單株有57個，其中，感病單株編號為1-66，抗病單株編號為67-123。

以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6為引物，對123株BC1F1單株基因組DNA進行PCR擴增，擴增結果如圖2所示：前66個單株（編號為1-66）僅含有長度為220bp的條帶，其序列如SEQ ID NO.3所示，即該66個單株感TMV病，且基因型為nn；后57個單株（編號為67-123）中除一個單株（編號為70）外，其余56個單株中同時含有228bp和220bp兩條帶，其序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示，即該56個單株中因含有如SEQ ID NO.1所示的序列（228bp）而抗TMV病，且基因型為Nn。

以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8為引物，對123株BC1F1單株基因組DNA進行PCR擴增，擴增結果如圖3所示：前66個單株（編號為1-66）僅含有長度為230bp的條帶，其序列如SEQ ID NO.4所示，即該66個單株感TMV病，且基因型為nn；后57個單株（編號為67-123）中除一個單株（編號為69）外，其余56個單株中同時含有190bp和230bp兩條帶，其序列分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示，即該56個單株中因含有如SEQ ID NO.2所示的序列（190bp）而抗TMV病，且基因型為Nn。

由上述兩個共顯性連鎖標記對123個BC1F1單株的基因型分析可知：兩個標記中均有1個單株（編號分別為70和69）則呈現(xiàn)出單交換，即抗性鑒定的結果為抗性單株，而基因型分析的結果卻為感病（僅出現(xiàn)感病基因型的特異條帶）。因此，利用Joinmap 4.0 作圖軟件計算可知，該兩個共顯性標記TM508-007和TM508-118與煙草TMV抗性基因N的緊密且位于N基因的兩側，其各自與N基因間的遺傳距離均約為0.41 cM，如圖4所示。

結論：利用上述兩個共顯性標記既可簡便、快捷、穩(wěn)定地檢測煙草TMV抗性基因N存在，又可清晰地鑒定出抗TMV純合基因型NN、抗TMV雜合基因型Nn及感TMV純合基因型nn，也可有針對性的、特異性的選擇含N基因的后代材料并大大提高選擇抗TMV病煙草品種的效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省煙草農業(yè)科學研究院

<120> 一種與煙草TMV抗性基因N緊密連鎖的共顯性SSR標記及其應用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 228

<212> DNA

<213> TM508-007-1

<400> 1

caccatggtt tggctttcat atcctttgat ataaatgaca ccgaacgata gaagggtaaa 60

aacagaaatt acaaaacata tatatatata tatatatata tatatatatg aaatactaac 120

ataaatggtt tttacttctg gaagttctag aaagtgaaaa ttagttcaaa aaagaattgt 180

ttatactgca taagacagga tcagcgacat tgcctttttg cattttgc 228

<210> 2

<211> 190

<212> DNA

<213> TM508-118-1

<400> 2

accaacatgg ccaaacctta cttttcattg tttacataag aaatgtatat aaatatggaa 60

aaaagatcaa atttatcata aataaataaa taacgtctac tttagtaaat tatccacgtt 120

tatccctaat tctactatcg gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc 180

ttttcctcgc 190

<210> 3

<211> 220

<212> DNA

<213> TM508-007-2

<400> 3

caccatggtt tggctttcat atcctttgat ataaatgaca ccgaacgata gaagggtaaa 60

aacagaaatt acaaaacata tatatatata tatatatata tgaaatacta acataaatgg 120

tttttacttc tggaagttct agaaagtgaa aattagttca aaaaagaatt gtttatactg 180

cataagacag gatcagcgac attgcctttt tgcattttgc 220

<210> 4

<211> 230

<212> DNA

<213> TM508-118-2

<400> 4

accaacatgg ccaaacctta cttttcattg tttacataag aaatgtatat aaatatggaa 60

aaaagatcaa atttatcata aataaataaa taaataaata aataaataaa taaataaata 120

aataaataaa taacgtctac tttagtaaat tatccacgtt tatccctaat tctactatcg 180

gaccaaaacg tctctagcgt caagaaagta ttttactggc ttttcctcgc 230

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-007F

<400> 5

caccatggtt tggctttcat 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-007R

<400> 6

gcaaaatgca aaaaggcaat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-118F

<400> 7

accaacatgg ccaaacctta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> TM508-118R

<400> 8

gcgaggaaaa gccagtaaaa 20