本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種有機(jī)污染物的定量分析方法，具體地說(shuō)，是一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，通過(guò)計(jì)算其比例并折算成為三乙膦酸鋁含量的定量方法。

背景技術(shù)：

三乙膦酸鋁(fosetyl-aluminium)是一種有機(jī)磷類高效、廣譜、內(nèi)吸性低毒殺菌劑。它在植物體內(nèi)可以上、下雙向傳導(dǎo)，對(duì)單軸霉菌屬、霜霉屬、疫霉屬引起的病害有良好的防治效果，是目前國(guó)內(nèi)外防治水稻稻瘟病、果樹(shù)、蔬菜霜霉病、疫病應(yīng)用較多的藥劑。

三乙膦酸鋁由乙基磷酸離子和鋁離子以化學(xué)鍵的形式構(gòu)成，其在基質(zhì)中通常解離后以化學(xué)離子乙基磷酸和亞磷酸離子的形式存在。傳統(tǒng)的分析方法以絡(luò)合滴定測(cè)定三乙膦酸鋁含量[化工技術(shù)與開(kāi)發(fā),2007,36(1):39-41,35]，但是該方法操作復(fù)雜，在做痕量分析時(shí)，誤差較大。近年來(lái)，隨著色譜技術(shù)的普及，各類基于色譜分離后的分析技術(shù)也被應(yīng)用于三乙膦酸鋁的測(cè)定當(dāng)中。常規(guī)方法使用三甲基硅重氮甲烷在恒溫下進(jìn)行衍生化[農(nóng)藥,2009,48(10):747-748,759]，或?qū)⑷异⑺徜X在密閉的反應(yīng)瓶中完全堿解后生成乙醇[色譜,1993,11(5):285-287]，通過(guò)氣相色譜法測(cè)定衍生化或堿解后的產(chǎn)物對(duì)三乙膦酸鋁進(jìn)行定量，但是這些方法前處理較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)條件較難掌控?？紤]到三乙膦酸鋁以離子的形式存在，有文獻(xiàn)報(bào)道使用離子色譜分析樣品離子的含量[Microchemical Journal,1995,52(1):68-76]，并使用乙基膦酸離子的含量進(jìn)行定量，但是該方法容易受到復(fù)雜基質(zhì)的干擾，影響測(cè)定結(jié)果。此外，液相色譜技術(shù)也被應(yīng)用于三乙膦酸鋁的定量分析當(dāng)中，有文獻(xiàn)報(bào)道使用離子對(duì)反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定三乙膦酸鋁的含量[色譜,2009,27(6):849-851]，但是該方法的檢出限較高，不能滿足三乙膦酸鋁殘留分析的需求。

我國(guó)的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763-2014)中規(guī)定三乙膦酸鋁的殘留定義為乙基磷酸和亞磷酸及其鹽之和，以乙基磷酸表示?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)中僅測(cè)定乙基磷酸的含量[Journal of AOAC International,2003,86(4):832-838]，不能滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于三乙膦酸鋁殘留定義的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)三乙膦酸鋁的方法，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，同時(shí)通過(guò)計(jì)算其比例并折算成為三乙膦酸鋁含量，用于三乙膦酸鋁殘留量的準(zhǔn)確、快速分析。

本發(fā)明所采用的技術(shù)原理：

低毒殺菌劑--三乙膦酸鋁在溶液中以乙基磷酸和亞磷酸兩種形式存在，對(duì)兩種酸進(jìn)行離子化裂解，然后利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定乙基磷酸和亞磷酸兩種離子的含量。根據(jù)不同溶液中兩種離子的存在比例基本為40：60的規(guī)律，將測(cè)定的離子含量經(jīng)計(jì)算、折算即可得到待測(cè)物中三乙膦酸鋁的含量。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：

一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)三乙膦酸鋁的方法，其步驟如下：

1、準(zhǔn)確稱取樣品后加入乙腈進(jìn)行預(yù)處理，然后以乙腈為標(biāo)準(zhǔn)按質(zhì)量體積比為1：10～15(g/mL)的比例加入氯化鈉，劇烈震蕩1～3min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心4～6min，取上層乙腈溶液；在乙腈溶液中按體積質(zhì)量比為1：0.02～0.025(mL/g)的比例分別加入無(wú)水硫酸鎂和PSA吸附劑，劇烈震蕩1～3min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5～7min，取上清液作為提取液，待測(cè)。所述樣品是果蔬樣品、土壤樣品或水樣品。所述預(yù)處理過(guò)程是：在果蔬樣品中按質(zhì)量體積比為1：2～3(g/mL)的比例加入乙腈，然后高速勻漿2～5min；在土壤樣品中按質(zhì)量體積比為1：2～3(g/mL)的比例加入乙腈，然后振蕩13～18min；在水樣品中按體積比為1：2～3(mL/mL)的比例加入乙腈，然后振蕩13～18min。

2、使用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的含量，其中乙基磷酸的母離子和定量離子對(duì)分別為109和81/63，亞磷酸的母離子和定量離子對(duì)分別為81和79/63。

3、色譜工作條件：UPLC色譜柱為ACQUITYBEH HILIC(1.7μm，2.1mm×50mm)，柱溫：35℃，流速：0.25mL/min，進(jìn)樣量：2μL；流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.05％甲酸水(10/90，v/v)，其梯度洗脫條件為：0～0.5min，流動(dòng)相A保持10％；0.5～3.0min，流動(dòng)相A從10％變?yōu)?0％；3.0～3.5min，流動(dòng)相A從90％變?yōu)?0％；3.5～5.0min，流動(dòng)相A保持10％；5.0min停止。

4、質(zhì)譜工作條件：掃描方式：電噴霧負(fù)離子(ESI-)掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；霧化氣：379.225kPa；噴霧電壓：4500kV。

5、根據(jù)提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例為40：60，利用如下公式計(jì)算提取液中三乙膦酸鋁含量：

三乙膦酸鋁含量＝乙基磷酸離子含量×0.4+亞磷酸含量離子×0.6。

本發(fā)明測(cè)定的對(duì)象為不同樣品中三乙膦酸鋁的含量，具體的樣品可為蘋果、香蕉、黃瓜、甘藍(lán)等不同果蔬及水、土壤等。

本發(fā)明根據(jù)不同溶液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例基本為40：60的規(guī)律，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，經(jīng)計(jì)算、折算得到待測(cè)物中三乙膦酸鋁的含量，在10-500μg/L濃度范圍內(nèi)，乙基磷酸和亞磷酸離子的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，所得結(jié)果更能體現(xiàn)三乙膦酸鋁的含量，且誤差在合理范圍內(nèi)，符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中的規(guī)定，而且測(cè)定三乙膦酸鋁的定量限為0.52μg/kg，適用于三乙膦酸鋁殘留量的準(zhǔn)確、快速分析。

附圖說(shuō)明

圖1是在不同溶液中乙基磷酸和亞磷酸離子的比例。

圖2是乙基磷酸和亞磷酸離子的裂解途徑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明建立一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定乙基磷酸和亞磷酸離子的含量，通過(guò)計(jì)算其比例并折算成為三乙膦酸鋁含量。三乙膦酸鋁在溶液中以乙基磷酸和亞磷酸兩種形式存在，兩種酸在溶液中的存在比例對(duì)三乙膦酸鋁的定量存在影響。

實(shí)施例一

研究不同溶液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例，分別配制0.5μg/mL的三乙膦酸鋁溶液，其中一組為乙腈與水的比例分別為4:1、2:1、1:1、1:2和1:4，另一組為甲醇與水的比例分別為4:1、2:1、1:1、1:2和1:4。使用乙基磷酸和亞磷酸兩種酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)三乙膦酸鋁溶液中的兩種酸進(jìn)行定量，并計(jì)算其與酸總量的比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，可以看出，乙基磷酸和亞磷酸兩種離子的比例均約為40％和60％。

實(shí)施例二

三乙膦酸鋁在溶液中以乙基磷酸和亞磷酸兩種形式存在，兩種酸在離子化的裂解規(guī)律是其準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵。本發(fā)明首先選擇負(fù)離子模式進(jìn)行激發(fā)，使用直接進(jìn)樣的方式優(yōu)化質(zhì)譜分析乙基磷酸和亞磷酸的條件。乙基磷酸和亞磷酸分子在質(zhì)譜中的裂解碎片如圖2所示，在一級(jí)質(zhì)譜中，乙基磷酸和亞磷酸分別產(chǎn)生穩(wěn)定的[M－H]－離子，其作為母離子的m/z分別為109和81。在確定其母離子后，在SIM模式下，對(duì)化合物的碎裂電壓(DP)進(jìn)行優(yōu)化，乙基磷酸和亞磷酸的最優(yōu)DP均為-81V。母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜，發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的離子碎片，其中，乙基磷酸的子離子分別為亞磷酸(定量離子，m/z＝81)和偏亞磷酸(定性離子，m/z＝63)，亞磷酸的子離子分別為偏磷酸(定量離子，m/z＝79)和偏亞磷酸(定性離子，m/z＝63)。

實(shí)施例三

對(duì)質(zhì)譜分析，基質(zhì)中化合物對(duì)目標(biāo)化合物的離子化存在一定的干擾，為了提高樣品中三乙膦酸鋁的定量準(zhǔn)確度，實(shí)驗(yàn)以甘藍(lán)為例，研究了甘藍(lán)基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物定量的基質(zhì)效應(yīng)。以甘藍(lán)空白樣品乙腈提取液作為空白基質(zhì)溶液，以純乙腈溶液作為純?nèi)軇┤芤?，分別配制0.1μg/mL的三乙膦酸鋁溶液，上機(jī)測(cè)定兩種溶液的響應(yīng)值，并采用相對(duì)響應(yīng)值法(基質(zhì)效應(yīng)＝空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值×100％)計(jì)算甘藍(lán)對(duì)三乙膦酸鋁的基質(zhì)效應(yīng)。用上述兩種不同溶液測(cè)定乙基磷酸和亞磷酸的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1，甘藍(lán)基質(zhì)對(duì)乙基磷酸和亞磷酸的基質(zhì)效應(yīng)分別為80％和103％，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)對(duì)樣品定量存在一定影響。因此，為了降低樣品基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)物離子化帶來(lái)的干擾，在樣品分析時(shí)需要使用對(duì)應(yīng)基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)品。

表1不同樣品中三乙膦酸鋁的添加回收率

實(shí)施例四

準(zhǔn)確稱取樣品(其中蘋果、香蕉、黃瓜、甘藍(lán)、土壤樣品取10g，水樣取10mL)，分別添加0.01、0.10和0.50mg/kg的三乙膦酸鋁標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)試樣加入20mL乙腈。果蔬樣品高速勻漿2min，土壤和水樣振蕩15min。分別加入1.5g氯化鈉，劇烈震蕩1min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，分取5mL上層乙腈溶液，加入100mg無(wú)水硫酸鎂和100mg PSA吸附劑，劇烈震蕩1min后，以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，取上清液2mL作為提取液。

使用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的含量，其中乙基磷酸的母離子和定量離子對(duì)分別為109和81/63，亞磷酸的母離子和定量離子對(duì)分別為81和79/63。

根據(jù)提取液中乙基磷酸離子和亞磷酸離子的存在比例為40：60，利用如下公式計(jì)算提取液中三乙膦酸鋁含量：

三乙膦酸鋁含量＝乙基磷酸離子含量×0.4+亞磷酸含量離子×0.6。用常規(guī)分析

方法測(cè)定回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2不同樣品中三乙膦酸鋁的添加回收率

以上所述僅是本發(fā)明的一般實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。