本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，具體的，涉及到一種人角蛋白基因krt80及其在肺癌中的表達(dá)和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

角蛋白是細(xì)胞骨架蛋白中的中間纖維蛋白，該家族蛋白是細(xì)胞骨架中間絲蛋白家族中最大、最復(fù)雜的一類。其中上皮角蛋白家族分為i型和ii型角蛋白，ii型角蛋白家族包括：k9-k28；ii型角蛋白家族包括20個成員：k1-k8和k71-k80。上皮角蛋白廣泛存在于上皮細(xì)胞，主要功能是參與組成上皮細(xì)胞中間纖維，對維持上皮細(xì)胞及組織穩(wěn)定性和完整性具有重要功能。

研究發(fā)現(xiàn)，一些角蛋白分子與惡性腫瘤密切相關(guān)，其異常表達(dá)可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生。角蛋白k6、k8、k14、k16、k18的表達(dá)與皮膚鱗狀上皮細(xì)胞癌和黑色素瘤相關(guān)，ck18是食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)，k17和k19與口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌有關(guān)，k17低表達(dá)是早期疾病復(fù)發(fā)和疾病相關(guān)死亡的獨立預(yù)后因子。

krt80又被稱為kb20，其基因位于人染色體12q13.13，有k80和k80.1兩個轉(zhuǎn)錄本，分別編碼452和422個氨基酸，分子量約50.5kda。krt80是角蛋白家族的一員，在上皮細(xì)胞中普遍表達(dá)。然而，遺憾的是，目前關(guān)于krt80基因相關(guān)功能的研究還未見報道，關(guān)于其蛋白表達(dá)情況以及在腫瘤等疾病中的作用及機(jī)制尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對krt80基因的研究現(xiàn)狀，闡明其在肺癌中的表達(dá)情況及作用。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

5.檢測krt80蛋白在臨床肺癌中的表達(dá)情況，包括以下步驟：

(1)臨床肺癌組織標(biāo)本的收集及標(biāo)本信息：收集2009年1月至2016年6月于云南省腫瘤醫(yī)院胸外科行肺原發(fā)腫瘤根治性切除術(shù)的176例i-iiia期肺癌患者的癌組織和癌旁肺組織標(biāo)本。其中，男性107例，女性69例；患者平均年齡57歲，年齡范圍27至78歲。

(2)上述標(biāo)本經(jīng)過蘇木素-伊紅(he)染色后，進(jìn)行病理診斷，以區(qū)分癌組織和癌旁組織。

(3)免疫組化檢測krt80蛋白在臨床肺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。

(4)利用spss軟件統(tǒng)計分析krt80蛋白在臨床肺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。

6.研制能特異性抑制krt80基因的sirna，包括以下步驟：

(1)利用ncbi(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)數(shù)據(jù)庫，獲得人krt80基因的轉(zhuǎn)錄本的編碼(cds)區(qū)(99-1457bp)信息，(nm_182507.2)cds區(qū)具體序列如下。

nm_182507.2：

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(2)根據(jù)sirna序列設(shè)計原則，針對人krt80基因的編碼區(qū)，設(shè)計3個能特異性敲減人krt80基因的小干擾rna(sirna)，核苷酸序列從左到右是5’-末端至3’-末端的方向，具體序列如下。

(3)化學(xué)合成該sirna。

7.利用westernblot檢測krt80蛋白的表達(dá)，驗證2中sirna的抑制效率，并篩選出能特異性抑制krt80蛋白的sirna序列，內(nèi)參蛋白為α-tubulin。

8.檢測krt80基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響及具體方法，包括：

(1)細(xì)胞增殖活性檢測(mts法)：將10³個生長狀態(tài)良好細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入150ul培養(yǎng)基，置于5％co237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，每孔加mts溶液(5mg/ml)30ul，繼續(xù)孵育2小時；選擇490nm波長測定各孔的吸光度，連續(xù)檢測4天。

(2)流式細(xì)胞周期檢測：將處于對數(shù)生長期的2×10⁶個細(xì)胞于70％的乙醇中固定、漂洗，離心收集細(xì)胞，0.2m檸檬酸/檸檬酸鈉高滲處理30分鐘，1×pbs洗2次，0.1％triton(pbs配制)洗1次，再用500μg/mlpi和0.1％rnaasea，室溫避光孵育30分鐘，流式細(xì)胞儀檢測分析。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明公開了krt80蛋白在臨床肺癌組織中高表達(dá)。

2.用本發(fā)明研制的sirna能特異性抑制肺癌細(xì)胞系中內(nèi)源性krt80的表達(dá)。

3.mts法檢測細(xì)胞增殖表明，與轉(zhuǎn)染對照rna相比，轉(zhuǎn)染本發(fā)明研制的兩個sirna能抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力，說明krt80基因能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖。

4.流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌細(xì)胞周期表明，與轉(zhuǎn)染對照rna相比，轉(zhuǎn)染本發(fā)明研制的兩個sirna能抑制肺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，使其阻滯于g1期，說明krt80基因能促進(jìn)肺癌細(xì)胞周期從g1期向s期轉(zhuǎn)化。

5.功能學(xué)結(jié)果提示，本發(fā)明研制的sirna可能對肺癌的靶向治療具有十分重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為krt80蛋白在臨床肺癌組織中高表達(dá)；

圖2為兩種sirna能特異性抑制pc9和a549肺癌細(xì)胞系中內(nèi)源性krt80的表達(dá)；

圖3為兩種sirna對pc9和a549肺癌細(xì)胞增殖能力的抑制情況；

具體實施方式1

檢測krt80蛋白在臨床肺癌中的表達(dá)情況，包括以下步驟：

(1)臨床肺癌組織標(biāo)本的收集及標(biāo)本信息：收集2009年1月至2016年6

月于云南省腫瘤醫(yī)院胸外科行肺原發(fā)腫瘤根治性切除術(shù)的176例i-iiia期肺癌患者的癌組織和癌旁肺組織標(biāo)本。其中，男性107例，女性69例；患者平均年齡57歲，年齡范圍27至78歲。

(2)上述標(biāo)本經(jīng)過蘇木素-伊紅(he)染色后，進(jìn)行病理診斷，以區(qū)分癌組織和癌旁組織。

(3)免疫組化檢測krt80蛋白在臨床肺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。

(4)利用spss軟件統(tǒng)計分析krt80蛋白在臨床肺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異。

如圖1所示，為krt80蛋白在臨床肺癌癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，從圖1可以看出，krt80在75.56％肺癌組織中高表達(dá)，在39.2％癌旁組織中高表達(dá)，說明krt80蛋白在肺癌組織中的表達(dá)較癌旁高。

具體實施方式2

研制能特異性抑制krt80基因的sirna，包括以下步驟：

(1)利用ncbl(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)數(shù)據(jù)庫，獲得人krt80基因的轉(zhuǎn)錄本編碼(cds)區(qū)(99-1457bp)信息，(nm_182507.2)cds區(qū)具體序列如下。

nm_182507.2：atggcctgccgctcctgcgtggttggcttcagcagcctcagcagctgtgaggtgaccccggtgggcagcccccggcctggaacctcaggatgggacagctgcagggcccccgggccgggcttcagctcccgcagcctcacaggctgctggtcggctggcactatctccaaggtgactgtgaaccccggcctgctggtgcccctggatgtcaagttggaccccgctgttcagcagctgaagaaccaggagaaggaggagatgaaggccctcaatgataaatttgcctccctaattggcaaggtgcaagccctggaacagcgcaaccagctgctggagacacgctggagcttcctgcagggccaggactcagccatcttcgacctcgggcatctctatgaggaatatcagggccggctgcaggaggaactgcgcaaagtgagccaggagcgggggcagctggaggccaacctgctgcaggtgctggagaaggttgaggagtttcgaatcaggtatgaggatgagatctccaagcgcacagacatggagttcacctttgttcagctgaagaaggacctggatgcagagtgtcttcatcggactgaactggaaaccaagttaaaaagcctggagagcttcgtggagttgatgaaaaccatctatgagcaggagctgaaggacctggcagcacaggtgaaggatgtgtcggtgaccgtcggcatggacagccgctgccacatcgacctgagcggcatcgtggaggaggtgaaggcccagtatgacgccgtcgcggctcgcagcctggaggaggccgaggcatactctcggagccagctggaggagcaggccgcccgctcggccgagtatgggagcagcctccagagcagccgcagcgagatcgcggatctcaatgtgcgcatccagaagctgcggtcccagatcctctctgtcaagagccattgcctgaaactggaggagaacatcaagacagctgaggagcagggtgagctggccttccaggatgccaagaccaagctggcccagctggaggccgccctgcagcaggccaagcaggacatggcgcggcagctgcgcaagtaccaggagctgatgaacgtcaagctggccctggacatcgagatcgccacctacaggaagctggtggagggcgaggagggcaggatggactcgccctcagccactgtggtcagcgctgtgcagtccaggtgcaaaaccgctgcctccagatcaggcctctccaaggccccctcccgaaagaagaagggcagcaaaggccccgtgatcaaaatcaccgaaatgtcagagaagtacttctcgcaggagtcggaggtctcagagtaa

(2)根據(jù)sirna序列設(shè)計原則，針對人krt80基因的編碼區(qū)，設(shè)計3個能特異性敲減人krt80基因的sirna序列，核苷酸序列從左到右是5’-末端至3’-末端的方向，具體序列如下。

(3)化學(xué)合成該sirna序列。

具體實施方式3

驗證sirna對pc9和a549肺癌細(xì)胞中krt80的干擾效率，具體步驟如下：1.復(fù)蘇a549和pc-9人肺癌細(xì)胞，用含10％的胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基于37℃、5％co2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。

2.將處于對數(shù)生長期的a549和pc-9細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中(2×10⁵個/孔)，8小時后轉(zhuǎn)染sirna。

3.棄2中孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入1.5ml含10％的胎牛血清的rpml-1640培養(yǎng)基。

4.取1.5mlep管，分別向管中加入250ulopti-men無血清培養(yǎng)基、5ullip2000脂質(zhì)體、10ulsirna工作液(20um)，輕柔混勻，室溫靜置20min。

5.將4中的混合液加入3的孔內(nèi)，輕柔搖勻，于37℃、5％c02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10小時后更換新鮮培養(yǎng)基。

6.轉(zhuǎn)染72小時后，用ripa細(xì)胞裂解液(按100∶1加入蛋白酶抑制劑)裂解處于對數(shù)生長期的細(xì)胞提取總蛋白，用bca法測蛋白濃度并于95℃水浴10min變性蛋白。

7.利用westernblot驗證krt80蛋白的表達(dá)，內(nèi)參蛋白為α-tubulin。

如圖2所示，為westernblot驗證sirna對pc9和a549肺癌細(xì)胞中krt80的抑制情況，從圖2可以看出，與陰性對照組sirna比較，本發(fā)明設(shè)計的3個sirna中有2個能使pc9和a549肺癌細(xì)胞中krt80蛋白表達(dá)降低，說明本發(fā)明設(shè)計的2個靶序列能明顯抑制人krt80基因的表達(dá)，可用于后續(xù)研究。

具體實施方式4

檢測本發(fā)明中的sirna抑制krt80基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響，具體步驟如下：

1.按照具體實施方式3中的方法，用對krt80基因有抑制作用的2個sirna轉(zhuǎn)染pc9和a549肺癌細(xì)胞。

2.轉(zhuǎn)染48小時后用mts法檢測細(xì)胞增殖活性，具體方法為：將10³個生長狀態(tài)良好細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入150ul培養(yǎng)基，置于5％co237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，每孔加mts溶液(5mg/ml)30ul，繼續(xù)孵育2小時；選擇490nm波長測定各孔的吸光度，連續(xù)檢測4天。

如圖3所示，為用sirna干擾人krt80基因后肺癌細(xì)胞增殖能力的變化，從圖3可以看出，與陰性對照組細(xì)胞比較，干擾krt80基因后，a549和pc-9肺癌細(xì)胞增殖能力明顯減慢，說明本發(fā)明設(shè)計的兩個sirna，抑制brcc3基因后，均能抑制肺癌細(xì)胞的增殖能力。

以上所述實施例，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

第一個序列表：人krt80基因的轉(zhuǎn)錄本（cds區(qū)為99-1457）

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第二個序列表：能特異性敲減人krt80基因的小干擾rna（sirna#1）

guugaggaguuucgaaucadtdt

ugauucgaaacuccucaacdtdt

第三個序列表：能特異性敲減人krt80基因的小干擾rna（sirna#2）

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第四個序列表：能特異性敲減人krt80基因的小干擾rna（sirna#3）

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uccaacuugacauccagggdtdt