用于檢測β球蛋白基因的變異的微陣列及其檢測方法
【專利說明】用于檢測0球蛋白基因的變異的微陣列及其檢測方法
[0001] 本發(fā)明是申請?zhí)枮?013800175584(國際申請?zhí)枮镻CT/JP2013/060261)、申請日 為2013年3月28日、發(fā)明名稱為"用于檢測P球蛋白基因的變異的微陣列及其檢測方法" 的發(fā)明申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于檢測P球蛋白基因的變異的探針組、具有該探針組的微陣列、及 使用其檢測0球蛋白基因的變異的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]人類基因組由約30億個基因密碼（堿基）構(gòu)成，逐漸了解到個體間存在多個基因 密碼（堿基序列）的差異?，F(xiàn)在，這些堿基序列的差異中，特別引人關(guān)注的是單核苷酸多態(tài) 性（SNP)。
[0004]單核苷酸多態(tài)性（SNP)是指在DNA的堿基序列中僅1個堿基不同，是對應(yīng)于是否 能喝酒、藥是否容易發(fā)揮作用等人類個性的最小單位。在人類基因組的30億個堿基對中， 顯示存在約300萬個（每500~1000堿基對中存在1個的比例）~1000萬個單核苷酸多 態(tài)性（SNP)，通過不生成特定的蛋白質(zhì)或形成與他人不同之處，從而帶來個體差異（體質(zhì)）、 人種差異等差別。就人類基因的個體差異的研究而言，可以說對單核苷酸多態(tài)性進行解析、 調(diào)查疾病易感性以及對藥物的響應(yīng)并給與對該人類個體副作用少的藥物即定制醫(yī)療將成 為可能，單核苷酸多態(tài)性（SNP)解析的研究在不斷推進。
[0005]單核苷酸多態(tài)性（SNP)引人關(guān)注的理由在于，隨著核酸解析技術(shù)的改進而能夠進 行多個SNP解析，此外，疾病和SNP之間的相關(guān)性也逐漸明確。在疾病相關(guān)基因、藥物代謝 的個體差異解析及慢性疾病等廣泛領(lǐng)域中，與SNP的相關(guān)性也逐漸明確。期待著今后SNP 與這些的相關(guān)性的進一步明確。
[0006]核酸解析技術(shù)處理非常繁多的試樣、含有數(shù)量龐大的操作，復(fù)雜且費時，通常要求 較高精度。核酸解析技術(shù)中，作為迅速高精度地檢測多個基因變異的手段，已知SNP檢測用 DNA芯片（DNA芯片也稱為DNA微陣列。以下只要沒有特別限定則意義相同。）是有效的。
[0007]DNA芯片是指在載體的各個所設(shè)定的分區(qū)中固定有核酸探針（探針）的芯片，通 常，核酸探針使用具有與待測核酸片段互補的堿基序列的單鏈DNA或寡核苷酸分子。
[0008]SNP檢測用DNA芯片中，固定有與變異核酸的檢查對象位點相當(dāng)?shù)暮怂崞蔚幕?補鏈作為核酸探針。就變異的檢查對象位點而言，通常存在1個正常型和多個變異型，與這 些中的任意者匹配的核酸探針排列在分區(qū)（polt)內(nèi)。待測試樣使用如下待測物液體，所述 待測物液通過以PCR法為代表的核酸擴增法僅擴增出與發(fā)生變異的檢查對象位點相當(dāng)?shù)?核酸片段。
[0009] 使該待測物液與SNP檢測用DNA芯片的固定有核酸探針的面接觸，使待測物核酸 片段和對應(yīng)的核酸探針間發(fā)生雜交。然后，檢測該雜交所形成的鍵作為光學(xué)或電化學(xué)信號 形式，從而可以鑒定和定量與核酸探針發(fā)生結(jié)合的待測物核酸片段。
[0010] 在此，當(dāng)核酸探針和待測物的組合為野生型探針和野生型待測物、或變異型探針 和與其對應(yīng)的變異型待測物這樣的完全匹配時，雜交完全，形成強鍵。而另一方面，核酸探 針和待測物的組合為野生型探針和變異型待測物、或變異型探針和野生型待測物這樣的錯 配時，必然伴有不能形成氫鍵的位點，因此雜交不完全，形成弱鍵。
[0011] 通常，為了維持高特異性，在通過溫度、鹽、洗滌劑、溶劑、離液劑及變性劑的各種 組合所實現(xiàn)的最為嚴(yán)格的條件下進行雜交，對完全匹配和錯配之間的雜交結(jié)合力差異所引 起的信號強度差異進行檢測，從而能夠識別、確定待測物中的基因型。
[0012] 但是，血紅蛋白為將氧由肺向細胞、且將二氧化碳從細胞向肺輸送的含鐵變構(gòu)復(fù) 合蛋白。血紅蛋白A為主要的成熟血紅蛋白，含有4條多肽鏈（2條a-球蛋白鏈及2條P 球蛋白鏈）。
[0013] 多種人類疾病被認(rèn)為有起因于對編碼血紅蛋白多肽鏈的1個以上基因產(chǎn)生影響 的基因變異。這類疾病含有鐮狀紅細胞貧血，其是由于血紅蛋白0鏈中的點突變而發(fā)生 的。此外，P地中海貧血癥是由于球蛋白鏈的1種型的不充分合成從而表型上成為顯著 的、由基因變異而發(fā)生的血液相關(guān)疾病，產(chǎn)生其它型球蛋白鏈的過度合成（例如，參照非專 利文獻1)。
[0014] 另一方面，最新開發(fā)的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)σ鹛囟ǖ娜思膊顟B(tài)及癥狀 或與之相關(guān)的基因異常進行研究。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)及其多種變形的方法成為用于疾病 狀態(tài)及癥狀中的基因異常研究的極其有用的工具（例如，參照非專利文獻2及3)。
[0015] 使用PCR法容易對特定的目的DNA或該DNA的部分進行擴增，并對擴增出的部分 進一步附加特征。該進一步附加特征包括用于確定大小的凝膠電泳、核苷酸序列確定、使用 特定探針的雜交研究等（例如，參照非專利文獻4)。
[0016] 近年，進行了很多關(guān)于SNPs(單核苷酸多態(tài)性）等基因型（即基因多態(tài)性）和疾 病等的因果關(guān)系的研究，正在對基因異常是否存在于特定個體的基因組進行確定。
[0017] 作為對SNPs等一個堿基變異或2個以上堿基數(shù)的基因變異進行判定（檢測）的 方法，首先有PCR-SSP法。該方法由于對發(fā)生變異的基因的堿基序列合成特異性引物、實 施PCR，因此為了判斷數(shù)十個基因變異，需要數(shù)十對引物。
[0018] 該方法的分析時間短，為簡便的方法，但合成上述引物時得小心翼翼，還需要知識 和時間，因此在大量待測物的分析中存在限制。除此之外，欲對變異進行檢測的位置越多則 PCR-SSP的次數(shù)也越多，因此具有難以一次處理多個待測物的缺點。
[0019] 作為第2方法可以被認(rèn)為是從以往一直進行的限制酶片段長度多態(tài)性法（PCR-RFLP法）。對共通序列位點設(shè)定引物，使其內(nèi)側(cè)、S卩PCR產(chǎn)物內(nèi)具有多態(tài)性并對其進行擴增。 擴增后，利用各種限制酶將擴增產(chǎn)物切斷，通過其DNA片段的尺寸將基因序列的變異分類。
[0020] 該方法雖然結(jié)果的判定容易、方法也簡單，但在限制酶所能夠識別的位點被限定 時變得難以判別，此外，待測物的分離中必須使用聚丙烯酰胺凝膠，因此難以對大量的待測 物、數(shù)十個變異同時進行分類。進而有報道指出，通常在對全血待測物直接進行PCR擴增 后、用限制酶進行片段化時，擴增待測物中殘存來自于全血的蛋白質(zhì)，利用限制酶進行的切 斷并不完全。即，由于結(jié)合于DNA的蛋白質(zhì)沒有從DNA中分離，限制酶無法與DNA結(jié)合，切 斷反應(yīng)未正常進行，需要進行DNA的提取操作。
[0021] 作為第3方法，有PCR-SSCP法。該方法為如下方法，S卩，在添加甲酰胺等變性劑使 PCR產(chǎn)物變性為單鏈DNA(ssDNA)后，在非變性聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳中，ssDNA具有基于其堿基序列的特殊結(jié)構(gòu)，電泳中顯示固有的移動速度，分別形成不同類型的條帶。
[0022] 該方法為利用基于堿基序列而顯示固有的移動速度這一性質(zhì)對堿基序列中的變 異進行分類的方法，需要復(fù)雜且難度高的技術(shù)，其結(jié)果的解析也需要經(jīng)驗和知識。
[0023]作為第 4 方法可以認(rèn)為是PCR-SSO(sequencespecificoligonucleotide)法。 PCR-SSO為如下方法，S卩，使針對正常位點和變異位點的合成探針與點樣在過濾器的（有時 也使用微孔板）PCR產(chǎn)物雜交，來檢測有無變異。此外，相反地、也有將探針點樣、使PCR產(chǎn) 物雜交的反向點雜交法（Reversedotblotmethod)。如果比喻成抗原抗體反應(yīng)有如下方 法，即，DNA作為抗原，與針對變異位點的特異性抗體和針對正常位點的特異性抗體進行作 用，觀察與哪種抗體發(fā)生結(jié)合。一直以來，該方法的檢測中使用放射性同位素，由于所使用 的設(shè)施的制約等，逐漸變成通過化學(xué)發(fā)光、顯色等進行檢測。
[0024] 該方法雖然簡便，但需要確保樣品量為相當(dāng)大量、否則反而需要引入提高靈敏度 的方法（例如，參照非專利文獻5及6、專利文獻1)。
[0025] 作為第5方法，已知有直接堿基序列確定法。直接堿基序列確定法是以PCR擴增 獲得的DNA鏈為模板直接確定堿基序列而無需進行亞克隆等到載體的方法。
[0026] 該方法中，對PCR擴增獲得的DNA鏈進行被稱為非對稱PCR的二次PCR，對單鏈DNA 進行擴增，通常使用雙脫氧法來確定堿基序列。該二次PCR是通過對一組引物中的一者限 量（通常為1:10~1 :1〇〇)進行PCR，從而對單鏈DNA進行擴增。最近應(yīng)用循環(huán)測序法，能 夠更簡單地進行測序反應(yīng)。但是試劑盒價格非常昂貴，還需要昂貴的裝置，實驗過程也復(fù) 雜，因此用于大量待測物的解析時成本上升。
[0027] 專利文獻1:日本特開平5-184398號公報
[0028]非專利文獻I:Weatherall等，TheThalassaemiaSyndromes，第 3 版，Oxford， BlackwellScientific,1981
[0029]非專利文獻 2:Erlich等，CurrentCommunicationsinMolecularBiology： PolymeraseChainReaction，ColdSpringHarbor：ColdSpringHarborPress(1989)
[0030]非專利文獻 3:Innis等，PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications. San Diego ：Academic Press (1990)
[0031]非專利文獻 4:Sambrook等，MolecularCloning-ALaboratoryManual，第 2 版， ColdSpringHarbor：ColdSpringHarborPress(1989)
[0032]非專利文獻 5:Am.J.Hum.Genet. 43 :095-100,1988
[0033]非專利文獻 6:Blood，Vol81，NoUJanuaryI). 1993:pp239-242

【發(fā)明內(nèi)容】

[0034] 如上所述，為了對基因的變異進行分析?檢測而使用了各種檢測方法，但這些方法 的共通缺點在于，為了同時檢測多個變異，需要極長時間和海量的勞動，尤其是對大量待測 物進行分析則困難更大。
[0035] 因此，本發(fā)明的主要目的在于，提供能夠簡便且短時間地檢測多個變異（待測物） 的、用于檢測P球蛋白基因的變異的微陣列。
[0036] 本發(fā)明人等鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的問題反復(fù)進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過使用 多種具有特定序列的探針可以實現(xiàn)上述目的，直至完成了本發(fā)明。
[0037] 即、本發(fā)明涉及一種含有序列號3、4、7、8、11、12、17、18和序列號25~66所不的 基因的用于檢測P球蛋白基因的變異的探針組、固定化有該探針組的微陣列、使用該微陣 列的變異檢測方法及試劑盒。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明，PCR產(chǎn)物可以不精制就與雜交溶液混合并直接與微陣列接觸、反應(yīng)， 因此即使使用大量待測物的情況下也能夠在短時間內(nèi)進行處理。進而，可以一次性檢測P 球蛋白基因的25個位置的變異，因此實用性、有用性優(yōu)異。
【附圖說明】
[0039] 圖1是示出本發(fā)明的校正方法的圖。
[0040] 圖2是示出本發(fā)明的校正方法的圖。
[0041] 圖3是示出本發(fā)明的校正方法的圖。
[0042] 圖4是示出本發(fā)明的校正方法的圖。
[0043]圖5示出在表示第1、第2多態(tài)性檢測用探針的信號強度的熒光坐標(biāo)系中，標(biāo)繪將 第1對照核酸多次雜交的結(jié)果、以及獲得的代表性直線。
[0044] 圖6示出在圖5的基礎(chǔ)上標(biāo)繪將第2對照核酸多次雜交的結(jié)果、以及獲得的代表 性直線。
[0045]圖7是校正值C、C2的圖。
[0046] 圖8是使用校正值C、C2、誤差角度進行校正前、校正后的探針性能數(shù)據(jù)。
[0047] 圖9是由來自于質(zhì)粒的25種樣品獲得的數(shù)據(jù)的校正前、校正后。
[0048] 圖10是將表9的數(shù)據(jù)疊加在圖9的校正后的圖中的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0049] 以下詳細說明本發(fā)明。以下的實施方式是用于說明本發(fā)明的例示，本發(fā)明并非