與植物抗逆性相關(guān)的蛋白BhDNAJC2及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種與植物抗逆性相關(guān)的蛋白BhDNAJC2及其編 碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全球水資源的缺乏和極端氣候事件的增長，逆境對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)的影響 日趨顯著。因此，通過分子操作技術(shù)提高作物的抗逆性日顯重要。
[0003] 生物體受到干旱脅迫或其它不良環(huán)境因素后，會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，其中熱 激蛋白（heat shock protein, HSP) -方面能促使新生蛋白折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白重新正 確折疊，另一方面還能使變性聚集蛋白降解，同時(shí)維持一系列酶和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。進(jìn)一步 研究發(fā)現(xiàn)，HSPs的含量與生物體耐脅迫性呈正相關(guān)，且能夠提高生物體的應(yīng)激能力和在逆 境中的存活率。
[0004] 復(fù)蘇植物可以忍受極度干旱的條件，待水份充足時(shí)又能很快恢復(fù)正常生命活動(dòng)。 已知被子植物中的復(fù)蘇植物很少，且主要分布在南非、南美和澳大利亞。旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)是在我國分布的一種苦苣苔科復(fù)蘇植物，該植物在以石灰?guī)r為主的喀 :斯特 高鹽重堿地區(qū)生長旺盛，其葉片具有很強(qiáng)的耐旱復(fù)蘇能力，在室溫、相對空氣濕度為0的條 件下生長72小時(shí)后，葉片相對含水量降為3%左右，葉片面積皺縮至原葉片面積的1/3以 下，光合作用基本停止。只要重新給水，葉片就可以吸水伸展，并恢復(fù)成未處理前的葉片表 觀狀態(tài)和生理狀態(tài)（包括光合作用的恢復(fù)）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與植物抗逆性相關(guān)的蛋白BhDNAJC2及其編碼基因與應(yīng) 用。
[0006] 本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱為BhDNAJC2,來源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica),是如下（a)或（b):
[0007] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] (b)將（a)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加，且與植物抗逆性相關(guān)的蛋白質(zhì)。
[0009] 為了便于BhDNAJC2蛋白的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。
[0010] 表：標(biāo)簽的序列
[0011] 標(biāo)簽殘基序列
[0012]

[0013] 上述（b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述（b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變。
[0014] 編碼所述BhDNAJC2蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以 是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述核酸分子具體為編碼所述BhDNAJC2蛋白的基因 (命名為BhDNAJC2);所述BhDNAJC2基因可為如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0017] 1)編碼序列為序列表中序列2的第193-696位所TK的DNA分子；
[0018] 2)序列表中序列2的第181-721位所示的DNA分子；
[0019] 3)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0020] 4)在嚴(yán)格條件下與1) -3)中任一限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分 子；
[0021] 5)與1)-4)中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA 分子。
[0022] 上述嚴(yán)格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0· 1 % SDS 和 I X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0023] 其中，序列2由913個(gè)核苷酸組成，第193-696位為0RF，編碼序列表中序列1所示 的BhDNAJC2蛋白。
[0024] 含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0025] 所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。
[0026] 所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元 農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 ?81121、？8丨1119、？041^142301、？041^141301-1]1^~或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá) 載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加 工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端。使 用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、 組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動(dòng)子、泛素基因 Ubiquitin 啟動(dòng)子（PUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子rd29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合 使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或 轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與 編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的 來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié) 構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用重組表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性 的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境 篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0027] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述BhDNAJC2基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng) 子具體為PA35S啟動(dòng)子；終止所述BhDNAJC2基因轉(zhuǎn)錄的終止子具體為pA35S終止子。
[0028] 更為具體的，所述重組表達(dá)載體為在pLeela載體的重組位點(diǎn)attRl和attR2之間 插入所述BhDNAJC2基因得到的重組質(zhì)粒。
[0029] 所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述BhDNAJC2基因表達(dá)的啟動(dòng)子，所述BhDNAJC2基因，以 及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。
[0030] 所述BhDNAJC2蛋白，或所述核酸分子，或所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在 如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0031] (al)調(diào)控植物抗逆性；
[0032] (a2)選育抗逆性提高的植物品種。
[0033] 在本發(fā)明中，所述調(diào)控植物抗逆性體現(xiàn)在：在所述植物體內(nèi)，若所述BhDNAJC2基 因的表達(dá)量越高，則所述植物的抗逆性越強(qiáng)。
[0034] 在本發(fā)明中，所述選育抗逆性提高的植物品種的方法，具體可包括將所述 BhDNAJC2基因表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交的步驟。
[0035] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0036] 本發(fā)明所提供的培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟：
[0037] a)向目的植物中導(dǎo)入所述BhDNAJC2蛋白的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的 轉(zhuǎn)基因植物；
[0038] b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因 植物。
[0039] 所述BhDNAJC2蛋白在所述轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)量高于所述目的植物。編碼所述 BhDNAJC2蛋白的基因（即所述BhDNAJC2基因）具體可為如下1)至5)中任一所述的DNA 分子：
[0040] 1)編碼序列為序列表中序列2的第193-696位所示的DNA分子；
[0041] 2)序列表中序列2的第181-721位所示的DNA分子；
[0042] 3)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0043] 4)在嚴(yán)格條件下與1) -3)中任一限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分 子；
[0044] 5)與1)-4)中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA 分子。
[0045] 上述嚴(yán)格條件可為用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2 X SSC， 0· 1 % SDS 和 I X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0046] 所述BhDNAJC2基因具體可通過上述任一所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物 中，得到所述轉(zhuǎn)基因植物。具體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、 顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞 或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)等生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組 織中。
[0047] 在上述應(yīng)用或方法中，所述抗逆性均具體可為如下中的至少一種：抗旱性、抗鹽 性、抗堿性。
[0048] 在上述應(yīng)用或方法中，所述植物既可以為雙子葉植物，也可為單子葉植物