本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2006年4月4日的國(guó)際申請(qǐng)pct/us2006/012443進(jìn)入中國(guó)、申請(qǐng)?zhí)枮?00680019821.3的題為“用于制備抗真菌病原體的植物的多核苷酸和方法”的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。本發(fā)明涉及用于生成或增強(qiáng)植物的病原體抗性的組合物和方法。另外，本發(fā)明涉及已經(jīng)用本發(fā)明的組合物遺傳轉(zhuǎn)化的植物。
背景技術(shù)：
：禾生毛盤孢(colletotrichumgraminicola)(ces.)(cg)更通常地稱作炭疽病，是影響玉蜀黍(zeamays)(l.)的炭疽病葉斑病、炭疽病莖腐爛(asr)和頂梢枯死的病原體，所述玉蜀黍也稱為玉米(maize)或玉米(corn)。它是僅僅已知的也會(huì)造成葉斑病的普通莖腐爛(bergstrom，等，(1999)，plantdisease，83：596-608，white，d.g.(1998)，compendiumofcorndiseases，pp.1-78)。在美國(guó)，已知它從1855年開始發(fā)生，且已經(jīng)在美洲、歐洲、非洲、亞洲和澳大利亞有所報(bào)道(mcgee，d.c.(1988)，maizediseases：areferencesourceforseedtechnologists，apspress，st.paul，mn；white，(1998)同上；white，等，(1979)proc.annu.cornsorghumresconf(34th)，1-15)。只是在美國(guó)，每年感染超過3750萬英畝，全國(guó)范圍內(nèi)的平均產(chǎn)量降低6.6％(參見圖1)。產(chǎn)量降低是由于受感染的植物的低核重量和“倒伏”，也就是說，由于感染造成莖的柔弱，植物倒下(dodd，j.，(1980)，plantdisease，64：533-537)。倒伏植物更難以收割，且易感其它疾病。感染后，通常莖的頂部首先死亡，而莖的下部仍然是綠色的。在外表，通過莖外皮上的斑點(diǎn)樣黑斑，可以識(shí)別感染，同時(shí)在內(nèi)部，髓組織變色或呈現(xiàn)黑色。接種會(huì)以許多形式發(fā)生。根可以生長(zhǎng)穿過莖碎片，且受到感染。這將變成日益嚴(yán)重的問題，因?yàn)椤懊飧?notill)”農(nóng)業(yè)方法由于它們的環(huán)境益處而被更廣泛采用。真菌也可以通過昆蟲損傷和其它傷口感染莖(white(1998)同上)。葉感染可能先于莖感染，從而造成葉斑病，并提供莖感染的接種物。關(guān)于自然界存在的cg不同品種或種族的數(shù)目，技術(shù)文獻(xiàn)中尚有爭(zhēng)論。病原體會(huì)由風(fēng)或受污染的種子批傳播。孢子可以存活最高達(dá)2年(mcgee(1988)同上；nicholson，等，(1980)，phytopathology，70：255-261；warren，h.l.(1977)，phytopathology，67：160-162；warren，等，(1975)，phytopathology，65：620-623)。通過使用殺真菌劑，農(nóng)民可以與玉米真菌病例如炭疽病感染相斗爭(zhēng)，但是它們具有環(huán)境副作用，且需要田地監(jiān)控和診斷技術(shù)來確定哪種真菌造成了感染，從而可使用正確的殺真菌劑。特別對(duì)于大田作物例如玉米，這是困難的。如果可以將負(fù)責(zé)抗性的基因整合入原種、高產(chǎn)種質(zhì)且不減少產(chǎn)量，那么使用攜帶遺傳的或轉(zhuǎn)基因的抗性來源的玉米系是更實(shí)用的。已經(jīng)描述了對(duì)cg的抗性的遺傳來源。已經(jīng)鑒別出攜帶一定水平的cg抗性的幾種玉米系(white，等(1979)同上)。它們包括a556、mp305、h21、sp288、ci88a和fr16。使用a556的相互易位測(cè)交分析表明，控制對(duì)asr的抗性的基因存在于染色體1、4和8的長(zhǎng)臂上以及染色體6的2個(gè)臂上(carson，m.l.(1981)，sourcesofinheritanceofresistancetoanthracnosestalkrotofcorn。ph.d.thesis，universityofillinois，urbana-champaign)。源自這樣的系的抗性的漸滲是復(fù)雜的。報(bào)道了另一個(gè)近交lb31攜帶控制對(duì)asr的抗性的單個(gè)顯性基因，但是表現(xiàn)得不穩(wěn)定，尤其在有歐洲玉米螟感染存在時(shí)(badu-apraku等，(1987)phytopathology77：957-959)。發(fā)現(xiàn)mp305系攜帶2個(gè)顯性的抗性基因，一個(gè)起主要作用，一個(gè)起次要作用(carson(1981)同上)。通過關(guān)國(guó)農(nóng)業(yè)部(departmentofagriculture)管理的國(guó)家植物種質(zhì)系統(tǒng)(nationalplantgermplasmsystem)(grinid：nsl250298)，可以從密西西比大學(xué)(universityofmississippi)得到mp305。參見compilationofnorthamericanmaizebreedinggermplasm，j.t.gerdes等，cropsciencesocietyofamerica，1993。從w.paulwilliams，supervisoryresearchgeneticistusda-ars，cornhostplantresistanceresearchunit，box9555，340dormanhall，mississippistate，ms39762，可以得到mp305的種子。已經(jīng)報(bào)道，在染色體4的長(zhǎng)臂上連鎖有2個(gè)賦予對(duì)cg抗性的基因(toman，等，(1993)，phytopathology，83：981-986；cowen，n等(1991)maizegeneticsconferenceabstracts33)。還已經(jīng)報(bào)道了染色體4上的顯著抗性數(shù)量性狀基因座(qtl)(jung，等，(1994)，theoreticalandappliedgenetics，89：413-418)。jung等(同上)報(bào)道，umc15可以用于選擇mp305中染色體4上的qtl，并提示qtl是在umc15和umc66之間的染色體4的12cm區(qū)域上。實(shí)際上，如下面更詳細(xì)地討論的，在ibm2相鄰4遺傳學(xué)圖上報(bào)道的umc15和umc66之間的區(qū)域是約129cm，且按照jung等(1994，同上)指出的方式選擇qtl，會(huì)最好也只不過選擇具有相當(dāng)大的連鎖拖曳和負(fù)表型作用的大染色體區(qū)間，且在最壞的情況下，在2個(gè)標(biāo)記之間會(huì)發(fā)生雙重組，從而導(dǎo)致rcg1基因座的假陽性選擇。關(guān)于植物的一般疾病抗性機(jī)理已經(jīng)進(jìn)行了大量工作。一些抗性機(jī)理實(shí)際上是非病原體特異性的，或所謂的“非宿主抗性”。它們可能基于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或類似的保護(hù)機(jī)制。但是，盡管植物缺少含有循環(huán)抗體的免疫系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的其它屬性，但它們確實(shí)具有針對(duì)病原體進(jìn)行特異性保護(hù)的其它機(jī)理。其中最重要的和最充分研究的是植物疾病抗性基因，或“r”基因。該抗性機(jī)理和r基因的非常多的綜述之一，可以參見bekhadir等，(2004)，currentopinioninplantbiology7：391-399。存在5類公認(rèn)的r基因：含有核苷酸-結(jié)合位點(diǎn)(nbs)和富亮氨酸重復(fù)(lrr)的細(xì)胞內(nèi)蛋白；含有胞外lrr結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白(tm-lrr)；含有胞質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域的跨膜和胞外lrr(tm-ck-lrr)；含有卷曲螺旋胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的膜信號(hào)錨定蛋白(msap-cc)；和含有n-末端肉豆蔻基化位點(diǎn)的膜相關(guān)激酶(mak-n)(參見，例如：cohn，等，(2001)，immunology，13：55-62；dangl，等(2001)，nature，411：826-833)。本發(fā)明實(shí)施方案的抗性基因編碼與nbs-lrr類型相關(guān)的新r基因。盡管已經(jīng)描述了多個(gè)nbs-lrr基因，但它們對(duì)不同病原體的反應(yīng)和確切作用有很大不同。據(jù)申請(qǐng)人所知，在本公開內(nèi)容中描述的新的r基因是唯一證實(shí)了會(huì)提供對(duì)cg的抗性的基因。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的實(shí)施方案基于對(duì)來自系mp305的負(fù)責(zé)抗性表型的主要部分的基因的精細(xì)作圖、克隆和表征，含有mp305抗性基因座的截短的染色體區(qū)間向具有很少或沒有連鎖拖曳的其它系中的漸滲，該基因作為轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用的證實(shí)，和使用育種技術(shù)、用分子標(biāo)記將基因或轉(zhuǎn)基因移進(jìn)原種系中。實(shí)施方案包括分離的多核苷酸，其包含編碼能賦予對(duì)毛盤孢屬(colletotrichum)的抗性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于needleman-wunsch比對(duì)算法，當(dāng)與seqidno：3或在2006年2月22日保藏在agriculturalresearchservice(ars)culturecollection的專利保藏號(hào)nrrlb-30895的序列相比時(shí)，具有至少50％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％同一性，或該核苷酸序列的互補(bǔ)體，其中所述互補(bǔ)體和核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成，且100％互補(bǔ)。本發(fā)明的其它實(shí)施方案包括載體，其包含本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸，例如seqidno：3，或保藏為專利保藏號(hào)nrrl-30895的質(zhì)粒的序列，以及包含可操作地連接到至少一個(gè)調(diào)節(jié)序列上的本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸的重組dna構(gòu)建體。本發(fā)明也包括植物細(xì)胞、以及植物，它們各自包含本發(fā)明實(shí)施方案的重組dna構(gòu)建體，和包含該重組dna構(gòu)建體的種子。本發(fā)明包括的方法包括1)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、包括植物細(xì)胞的方法，其包含用本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，2)生產(chǎn)植物的方法，其包含用本發(fā)明實(shí)施方案的重組dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生植物，和3)賦予或增強(qiáng)對(duì)毛盤孢屬和/或莖腐爛的抗性的方法，其包含用本發(fā)明實(shí)施方案的重組dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，從而賦予和/或增強(qiáng)對(duì)毛盤孢屬或莖腐爛的抗性。其它實(shí)施方案包括，測(cè)定玉米植物中存在或不存在本發(fā)明實(shí)施方案的多核苷酸或rcg1基因座的方法，其包含下述的至少一個(gè)：(a)從玉米植物分離核酸分子，并通過擴(kuò)增與多核苷酸同源的序列，測(cè)定是否存在rcg1基因，(b)從玉米植物分離核酸分子，并進(jìn)行dna印跡雜交，(c)從玉米植物分離蛋白，并使用rcg1蛋白的抗體進(jìn)行蛋白印跡，(d)從玉米植物分離蛋白，并使用rcg1蛋白的抗體進(jìn)行elisa測(cè)定，或(e)證實(shí)存在源自rcg1mrna轉(zhuǎn)錄物且rcg1特有的mrna序列，從而確定玉米植物中存在多核苷酸或rcg1基因座。本發(fā)明也包括改變植物或植物細(xì)胞中能賦予對(duì)毛盤孢屬或莖腐爛的抗性的蛋白表達(dá)水平的方法，其包含(a)用本發(fā)明實(shí)施方案的重組dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，和(b)在適合表達(dá)重組dna構(gòu)建體的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中重組dna構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化的宿主中生產(chǎn)改變水平的能賦予對(duì)毛盤孢屬或莖腐爛的抗性的蛋白。本發(fā)明包括的另一種方法是，賦予或增強(qiáng)玉米植物中對(duì)毛盤孢屬和/或莖腐爛的抗性的方法，其包含(a)使缺少rcg1基因座的第一種玉米植物與含有rcg1基因座的第二種玉米植物雜交，以生成分離群體，(b)篩選分離群體中含有rcg1基因座的成員，所述rcg1基因座具有能與連接到或位于rcg1基因座內(nèi)的第二種核酸雜交的第一種核酸，不包括umc15a或umc66，和(c)選擇所述成員，用于進(jìn)一步雜交和選擇。本發(fā)明也包括增強(qiáng)對(duì)毛盤孢屬和/或莖腐爛的抗性、或?qū)⒚P孢屬和/或莖腐爛抗性漸滲入玉米植物的方法，其包含用核酸標(biāo)記進(jìn)行玉米植物的標(biāo)記輔助選擇，其中所述核酸標(biāo)記特異性地與具有第一種核酸序列的核酸分子雜交，所述第一種核酸序列連接在位于mp305的rcg1基因座上的第二種核酸序列上，并基于標(biāo)記輔助選擇來選擇玉米植物。本文公開的特異性的flp、mza和rcg1特異性的snp標(biāo)記是本發(fā)明的其它方面。其它實(shí)施方案是用于將對(duì)毛盤孢屬或莖腐爛的抗性漸滲進(jìn)玉米植物或增強(qiáng)該抗性的種質(zhì)的改良的供體來源，所述種質(zhì)包含de811asr(bc5)和源自它們的后代。所述后代可以進(jìn)一步表征為含有本文公開的de811asr(bc5)rcg1序列、在rcg1內(nèi)或與之遺傳連鎖的分子標(biāo)記、對(duì)毛盤孢屬的抗性或增強(qiáng)的抗性，或其任意組合。其它實(shí)施方案包括，通過檢測(cè)玉米植物中至少2個(gè)標(biāo)記的等位基因，鑒別表現(xiàn)出新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中至少一個(gè)標(biāo)記是在umc2041下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，且至少一個(gè)標(biāo)記是在rcg1基因下邊、且在umc2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部。該方法包含的類似實(shí)施方案包括，至少一個(gè)標(biāo)記是在umc1086下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，在umc2285下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，且至少一個(gè)標(biāo)記是在rcg1基因下邊、且在umc2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部，在rcg1基因下邊、且在umc2187上邊的區(qū)間上或內(nèi)部，或在rcg1基因下邊、且在umc15a上邊的區(qū)間上或內(nèi)部。涉及相同的方法的其它實(shí)施方案包括這樣的實(shí)施方案，其中至少一個(gè)標(biāo)記能檢測(cè)位于與seqidno：137的核苷酸7230和7535、seqidno：173的核苷酸11293和12553、seqidno：137的核苷酸25412和29086或seqidno：137的核苷酸43017和50330相對(duì)應(yīng)的位置的多態(tài)性。其它實(shí)施方案包括，通過檢測(cè)玉米植物中至少2個(gè)標(biāo)記的等位基因，鑒別表現(xiàn)出新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中在umc2041下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部的至少一個(gè)標(biāo)記選自表16列出的標(biāo)記，且在rcg1基因下邊、且在umc2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部的至少一個(gè)標(biāo)記也選自表16列出的標(biāo)記。實(shí)施方案包括，通過選擇至少4個(gè)標(biāo)記或至少6個(gè)，鑒別表現(xiàn)出新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中至少2個(gè)或3個(gè)標(biāo)記是在umc2041下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，且至少2個(gè)或3個(gè)標(biāo)記是在rcg1基因下邊、且在umc2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部。當(dāng)在umc2041下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部的2或3個(gè)標(biāo)記，以及在rcg1基因下邊、且在umc2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部的2或3個(gè)標(biāo)記選自表16列出的那些時(shí)，其它實(shí)施方案包括該相同方法。該方法的另一個(gè)實(shí)施方案包括，檢測(cè)在mza1112處的等位基因7，檢測(cè)在mza2591處的等位基因2，或檢測(cè)在mza3434處的等位基因8。通過所包括的方法生產(chǎn)的玉米植物和種子也是本發(fā)明的實(shí)施方案，包括不包含在表16所示的基因座處在umc2041處或其上面、或在umc2200處或其下面的與mp305相同的等位基因的那些玉米植物。其它實(shí)施方案包括，通過檢測(cè)玉米植物中至少2個(gè)標(biāo)記的等位基因，鑒別表現(xiàn)出新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬抗性的玉米植物的方法，其中至少一個(gè)標(biāo)記是在umc2041下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，且至少一個(gè)標(biāo)記是在rcg1基因下邊、且在umc2200上邊的區(qū)間上或內(nèi)部，且其中該方法檢測(cè)位于rcg1基因內(nèi)的至少一個(gè)標(biāo)記的存在或不存在。另一個(gè)這樣的實(shí)施方案包括該方法的修飾，其中選擇4個(gè)標(biāo)記，其中2個(gè)標(biāo)記是在umc2285下邊、且在rcg1基因上邊的染色體區(qū)間內(nèi)部，且至少2個(gè)標(biāo)記是在rcg1基因下邊、且在umc15a上邊的區(qū)間內(nèi)部。該方法的其它實(shí)施方案包括rcg1基因，該rcg1基因已經(jīng)從供體玉米植物，包括mp305或de811asr(bc5)，漸滲進(jìn)受體玉米植物，以生產(chǎn)漸滲的玉米植物。該方法也包括這樣的情形，其中選擇漸滲的玉米植物在rcg1基因下邊和umc15a上邊的重組事件，從而使得漸滲的玉米植物保持第一個(gè)mp305衍生的在rcg1基因下邊、且在umc15a上邊的染色體區(qū)間，且不保持第二個(gè)mp305衍生的在umc15a處和下邊的染色體區(qū)間。通過這些方法生產(chǎn)的玉米植物和種子也是本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明包括的漸滲的玉米植物包括作為ph705、ph5w4、ph51k或ph87p的rcg1基因座轉(zhuǎn)變的那些，或其后代。本發(fā)明的其它實(shí)施方案是鑒別表現(xiàn)出增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物的方法，其通過檢測(cè)玉米植物在rcg1基因座處存在或不存在至少一個(gè)標(biāo)記，和選擇其中存在至少一個(gè)標(biāo)記的玉米植物來實(shí)現(xiàn)。實(shí)施方案包括，當(dāng)至少一個(gè)標(biāo)記是在seqidno：137上或內(nèi)部時(shí)，以及當(dāng)至少一個(gè)標(biāo)記能檢測(cè)位于seqidno：137中與核苷酸1至536、核苷酸7230至7535、核苷酸11293至12553、核苷酸25412至29086和核苷酸43017至50330的位置相對(duì)應(yīng)的位置處的多態(tài)性時(shí)，以及當(dāng)至少1個(gè)標(biāo)記是在rcg1編碼序列上或內(nèi)部，或位于seqidno：1所述多核苷酸上或內(nèi)部時(shí)。另一個(gè)實(shí)施方案包括，當(dāng)該方法檢測(cè)seqidno：1中與位置413、958、971、1099、1154、1235、1250、1308、1607、2001、2598和3342的一個(gè)或多個(gè)相對(duì)應(yīng)的位置處的單核苷酸多態(tài)性時(shí)。這些實(shí)施方案中的方法包括的標(biāo)記包含，snp標(biāo)記c00060-01和c00060-02，用于檢測(cè)源自rcg1mrna轉(zhuǎn)錄物且rcg1特有的mrna序列的標(biāo)記，和由在該公開內(nèi)容中所述的引物對(duì)產(chǎn)生的擴(kuò)增子上的flp標(biāo)記，例如seqidno：35-42中的那些和它們的互補(bǔ)體。另一個(gè)實(shí)施方案包括，當(dāng)該方法檢測(cè)在rcg1基因座內(nèi)存在或不存在至少2個(gè)標(biāo)記時(shí)，包括c00060-01和c00060-02。通過所述方法生產(chǎn)的玉米植物和種子也是本發(fā)明的實(shí)施方案。本發(fā)明包括的漸滲的玉米植物包含，作為ph705、ph5w4、ph51k或ph87p的rcg1基因座轉(zhuǎn)變的那些，或其后代。這樣的實(shí)施方案包括玉米種子，其包含第一個(gè)mp305衍生的由bnlg2162和umc1051定義的染色體區(qū)間，且不包含第二個(gè)mp305衍生的在umc2041上邊或在umc1051下邊的染色體區(qū)間，且當(dāng)該玉米種子包含rcg1基因，且當(dāng)生長(zhǎng)時(shí)生成表現(xiàn)出對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物。該實(shí)施方案的種子也包括下述玉米種子，其包含第一個(gè)mp305衍生的在umc2285和umc15a之間但是不包括該二者的染色體區(qū)間，且不包含第二個(gè)mp305衍生的在umc2285處或上邊、或在umc15a處或下邊的染色體區(qū)間，而且這樣的包含rcg1基因的玉米種子在生長(zhǎng)時(shí)，生成表現(xiàn)出對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物。由該種子生產(chǎn)的玉米植物和植物細(xì)胞也包含在本發(fā)明的實(shí)施方案中。其它實(shí)施方案包括命名為de811asr(bc5)的玉米品種的種子，或保藏為atcc登記號(hào)pta-7434的玉米種子，或源自該品種的后代種子，其包含rcg1基因，在生長(zhǎng)時(shí)生成表現(xiàn)出增強(qiáng)的或新賦予的對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的植物。從該種子生長(zhǎng)的植物和植物細(xì)胞也是實(shí)施方案，以及包含第一個(gè)mp305或de811asr(bc5)衍生的在umc2285和umc15a之內(nèi)但是不包括該二者的染色體區(qū)間的后代種子，和不包含第二個(gè)mp305衍生的在umc2285處或上邊、或在umc15a處或下邊的染色體區(qū)間的后代種子。也包含上述種子的植物和植物細(xì)胞作為實(shí)施方案。本發(fā)明也包括作為ph705、ph5w4、ph51k或ph87p的rcg1基因座轉(zhuǎn)變的后代種子，或其后代，以及包含在mza11123處的等位基因7、在mza2591處的等位基因2或在mza3434處的等位基因8中的至少2個(gè)或更多個(gè)的后代種子。其它實(shí)施方案包括，包含在mza2591.32處的胞嘧啶核苷酸、在mza2591.35處的胸腺嘧啶核苷酸和在mza3434.17處的胞嘧啶核苷酸的后代種子。其它實(shí)施方案包括用于鑒別表現(xiàn)出新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含一種或多種玉米植物的緊密連鎖到rcg1基因座或在rcg1基因座內(nèi)的4個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記基因座的等位基因評(píng)分信息，和檢查所述數(shù)據(jù)庫來確定由4個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記基因座定義的染色體區(qū)間或其部分的遺傳、并計(jì)算一種或多種玉米植物是否包含rcg1基因的指令。其它實(shí)施方案包括用于鑒別表現(xiàn)出新賦予的或增強(qiáng)的對(duì)毛盤孢屬感染的抗性的玉米植物的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，其包含數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含一種或多種玉米植物的在rcg1基因座內(nèi)的1個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因座的等位基因評(píng)分信息，和檢查所述數(shù)據(jù)庫來確定rcg1基因座的遺傳的指令。這樣的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一種或多種玉米植物的等位基因評(píng)分信息可以另外包含2、3或更多個(gè)在rcg1基因座內(nèi)的標(biāo)記基因座。實(shí)施方案也包括分別在seqidno：140-146上或內(nèi)部的mza3434、mza2591、mza11123、mza15842、mza1851、mza8761和mza11455的遺傳標(biāo)記。其它實(shí)施方案包括位于rcg1基因座或rcg1基因上或內(nèi)的遺傳標(biāo)記，包括位于seqidno：137上的那些，例如位于與1至536、7230至7535、11293至12553、25412至29086的核苷酸相對(duì)應(yīng)的區(qū)域和核苷酸43017至50330的區(qū)域上的那些。包含的標(biāo)記也包括位于seqidno：1上的那些，例如位于seqidno：1的核苷酸位置550-658上或內(nèi)部的那些，或位于seqidno：1的核苷酸位置1562-1767上或內(nèi)部的那些。實(shí)施方案的標(biāo)記包括在由位于下述引物對(duì)產(chǎn)生的擴(kuò)增子上的標(biāo)記上的那些，其中第一個(gè)引物是seqidno：23-41的奇數(shù)序列，而其中第二個(gè)引物是seqidno：24-42的偶數(shù)序列。其它實(shí)施方案包括可通過包含下述步驟的方法得到的玉米植物：使作為第一種親本植物的mp305或de811asr(bc5)[保藏號(hào)pto-7434]與作為第二種親本植物的缺少rcg1基因座的不同植物雜交，從而得到包含第一種親本的rcg1基因座的后代；且任選地另外包含1個(gè)或多個(gè)其它育種步驟，以得到包含第一種親本的rcg1基因座的一個(gè)或多個(gè)進(jìn)一步世代的后代。這樣實(shí)現(xiàn)的玉米植物包括近交和雜種植物。本發(fā)明包括這樣的植物的種子，包括對(duì)于rcg1基因座純合和雜合的那些種子，和通過加工那些種子來得到玉米產(chǎn)品的方法。在食物或飼料或玉米產(chǎn)品(例如玉米面粉、玉米粗粉和玉米油)的生產(chǎn)中使用這樣的種子，也是本發(fā)明的實(shí)施方案。附圖說明圖1是顯示各縣在2002年炭疽病莖腐爛感染嚴(yán)重性的美國(guó)地圖。圖2(a、b、c)是將它與其它已知nbs-lrr多肽相對(duì)比的實(shí)施方案多肽序列(seqidno：3)的比對(duì)。圖3是用windowsqtlcartographer軟件生成的圖，它顯示了負(fù)責(zé)cg抗性表型的基因座位于flp標(biāo)記定義的染色體上的特定位置(x軸)處的機(jī)會(huì)(y軸)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。圖4是rt-pcr反應(yīng)物的等分試樣的電泳凝膠印跡，它揭示了260bp帶的存在，該260bp帶存在于源自受感染的和未受感染的抗性植物的樣品中，但是在易感樣品中不存在。從來自de811和de811asr莖組織的12.5ng總rna中，得到了rt-pcr片段。使用rcg1特異性的引物和18srrna引物作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，擴(kuò)增通過反轉(zhuǎn)錄得到的cdna。圖5是用于驗(yàn)證rcg1基因的mu-標(biāo)記策略的示意圖。圖6是rcg1的基因結(jié)構(gòu)，它顯示了4種不同增變基因插入位點(diǎn)的位置。圖7(a-b)是一系列遺傳學(xué)圖圖像，以遞增的分辨率顯示了鄰近rcg1基因的區(qū)域的圖。7(a)中標(biāo)有“a”的圖的圖距按cm計(jì)，且與ibm2相鄰4遺傳學(xué)圖有關(guān)。使用來自bc7群體的184個(gè)個(gè)體，形成7(b)中標(biāo)有“b”的圖的圖距，且使用來自bc7群體的1060個(gè)個(gè)體，形成7(b)中標(biāo)有“c”的圖的圖距。與公開的圖相比時(shí)，bc7群體的遺傳作圖使圖分辨率增加超過10-倍。顯示在每個(gè)圖右邊的標(biāo)記的位置是基于它們?cè)谖锢韴D上的定位的外推。圖8(a-b)的遺傳學(xué)圖圖像顯示了de811asr(bc3)中含有rcg1基因的染色體區(qū)間，在de811asr(bc5)中得到的含有rcg1基因的染色體區(qū)間的減小的大小，和最初使用de811asr(bc5)作為供體來源得到的近交中染色體區(qū)間的進(jìn)一步減小的大小。關(guān)于所有標(biāo)記，在maizegdb上可公開得到的ibm2相鄰圖上報(bào)道顯示的圖距，除了mza15842、flp27和flp56之外，使用相對(duì)于圖7(b)中圖b和c的高分辨率圖的回歸分析，外推它們的圖位置，其中使用兩種圖共有的umc2285、phi093和csu166a位置。圖9(a-b)。圖9(a)顯示了來自de811asr(bc5)的非同線性區(qū)域相對(duì)于b73和mo17的比對(duì)。圖9(a)中的bac大小是估計(jì)值。圖9(b)顯示了其上存在rcg1的seqidno：137所述的非同線性區(qū)域的部分，包括其中的重復(fù)區(qū)域以及rcg1外顯子1和2。圖10(a-b)顯示了分別在de811asr(bc5)和de811系中接種cg后15天時(shí)不同單個(gè)植物中平均葉子損傷大小的分布。圖11顯示了接種后7和15天時(shí)感染了cg的de811和de811asr(bc5)植物上的平均葉子損傷大小的對(duì)比。圖12顯示了使de811asr(bc5)和de811與指示的系雜交產(chǎn)生的雜種的莖在接種cg后4-5周時(shí)疾病的平均嚴(yán)重性。圖13顯示了與使de811與指示的系雜交產(chǎn)生的雜種的產(chǎn)量相比，使de811asr(bc5)與指示的系雜交產(chǎn)生的雜種在接種cg后成熟時(shí)產(chǎn)量的提高。圖14顯示了接種后4-5周從de811asr(bc5)或mp305衍生的近交系的莖中由cg造成的5個(gè)不同位置處的疾病嚴(yán)重性。rcg1基因陽性和陰性的系之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，p值小于0.05。圖15顯示了來自rcg1陽性和陰性的近交ph705系的代表性莖的疾病進(jìn)展。圖16顯示了來自rcg1陽性和陰性的近交ph87p系的代表性莖的疾病進(jìn)展。圖17顯示了通過使de811asr(bc5)與指定系雜交衍生的雜種的莖的在5個(gè)不同位置處接種4-5周后由cg造成的疾病嚴(yán)重性。rcg1基因陽性和陰性的系之間的差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的，p值小于0.05，例外是位置5。圖18顯示了從rcg1陽性和陰性的ph4cv和ph705系生成的雜種的代表性莖的疾病進(jìn)展。圖19顯示了從rcg1陽性和陰性的ph705和ph87p系生成的雜種的代表性莖的疾病進(jìn)展。圖20顯示了給玉米莖的疾病嚴(yán)重性評(píng)分的方法。給莖評(píng)出指定為antgr75的評(píng)分，它代表著超過75％變色的節(jié)間的數(shù)目(最高達(dá)5，包括接種的節(jié)間)。這產(chǎn)生范圍為0-5的評(píng)分，0表示在接種的節(jié)間小于75％變色，且5表示前5個(gè)節(jié)間(包括接種的節(jié)間)的75％或更多變色。圖21顯示了與插入了含有de811asr(bc5)的rcg1非同線性區(qū)域的區(qū)域同源的b73物理圖上的毗連群，這證實(shí)了在可以得到序列信息的目標(biāo)區(qū)域中可得到許多b73衍生的細(xì)菌人工染色體(bac)。圖22顯示了含有mza和公開標(biāo)記的遺傳學(xué)圖與mo17和b73的物理圖的比對(duì)。使用來自bc7作圖群體的1060個(gè)體，顯示遺傳學(xué)圖距離。mo17bac文庫的分析也表明rcg1基因座與mo17的對(duì)應(yīng)區(qū)域是非同線性的。從mo17物理圖定位外推出虛線顯示的標(biāo)記在b73圖中的定位。從b73物理圖定位外推出虛線顯示的標(biāo)記在mo17圖中的定位。圖23顯示了為使用invadertm反應(yīng)而設(shè)計(jì)的rcg1雜交標(biāo)記的寡核苷酸。圖24顯示了為使用反應(yīng)而設(shè)計(jì)的rcg1雜交標(biāo)記的寡核苷酸。圖25顯示了從接種后0、3、6、9和13天(dpi)的抗性的和易感的植物分離的約1.5mg聚腺苷酸-富集的rna得到的rna印跡的結(jié)果。用隨機(jī)引物標(biāo)記的420bprcg1片段探測(cè)膜?？剐越M織來自de811asr(bc5)，且易感組織來自de811。圖26表明，使用rcg1特異性的引物對(duì)的pcr擴(kuò)增僅僅擴(kuò)增抗性系de811asr(bc5)和供體親本mp305，但是在易感系de811中卻不能，例外是flp110f-r，它擴(kuò)增高度保守的卷曲螺旋-核苷酸結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，并從而擴(kuò)增de811系的基因組中非rcg1的其它區(qū)域。100bp梯用于片段定大小。具體實(shí)施方式本發(fā)明實(shí)施方案提供了涉及誘導(dǎo)植物的病原體抗性、尤其是真菌抗性的組合物和方法(或工藝)。該組合物是賦予或增強(qiáng)對(duì)植物真菌病原體的抗性的新的核苷酸和氨基酸序列。具體地，某些實(shí)施方案提供了具有seqidno：3所述氨基酸序列的多肽，和其變體和片段。另外提供了分離的核酸分子，和其變體和片段，它們包含編碼seqidno：3所示氨基酸序列的核苷酸序列。在seqidno：1和4中，描述了編碼seqidno：3的多肽的核苷酸序列。在本文中也公開了包含編碼實(shí)施方案的多肽的核苷酸序列的植物、植物細(xì)胞、種子和微生物。在布達(dá)佩斯條約規(guī)定下，2006年2月22日將rcg1核酸分子保藏在位于國(guó)家農(nóng)業(yè)利用研究中心(nationalcenterforagriculturalutilizationresearch(ncaur))的微生物基因座和生物工藝研究單位(microbialgenomicsandbioprocessingresearchunit)的農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(agriculturalresearchservice(ars)culturecollection)。為保藏物給出下面的登記號(hào)：nrrlb-30895。ncaur的地址是1815n.universitystreet，peoria，il，61604。在國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款下，維持該保藏。該保藏僅僅為了本領(lǐng)域技術(shù)人員的方便而作出的，且不是對(duì)在35u.s.c.§112下需要的保藏物的承認(rèn)。保藏將是不可撤回的，且在專利授權(quán)后對(duì)公眾的獲取沒有限制或條件。但是，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的可獲得并不構(gòu)成對(duì)破壞由政府行為授予的專利權(quán)的實(shí)施主題發(fā)明的許可。在2006年3月13日，將2500粒de811asr(bc5)種子的樣品保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection(atcc))，10801universityblvd.，manassas，va20110-2209，usa，分配的保藏號(hào)是pto-7434。在本申請(qǐng)未決期間，專利和商標(biāo)官員(commissionerofpatentsandtrademarks)、在請(qǐng)求后獲得授權(quán)的由官員確定的人員和在提交本專利申請(qǐng)的外國(guó)專利局的相應(yīng)官員可以獲得該保藏物。在國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款下，維持該保藏物。保藏將是不可撤回的，且在專利授權(quán)后對(duì)公眾的獲取沒有限制或條件。但是，應(yīng)當(dāng)理解，保藏物的可獲得并不構(gòu)成對(duì)破壞專利權(quán)的實(shí)施主題發(fā)明或方法的許可。實(shí)施方案的全長(zhǎng)多肽(seqidno：3)與nbs-lrr家族的已知多肽具有不同程度的同源性。具體地，實(shí)施方案的新多肽與從稻(oryzasativa)(登記號(hào)np_910480(seqidno：14)、np_910482(seqidno：16)、np_921091(seqidno：17)和np_910483(seqidno：15))和大麥(hordeumvulgare)(登記號(hào)aag37354(seqidno：18)；zhou等，(2001)plantcell13：337-350)分離的nbs-lrr蛋白具有同源性。圖1提供了seqidno：3所述的氨基酸序列與稻和大麥抗真菌蛋白(seqidno：14-18)的比對(duì)。使用gap程序的氨基酸比對(duì)表明，seqidno：3與稻抗真菌蛋白np_910480(seqidno：14)共有約42.3％序列相似性，與稻蛋白np_910482(seqidno：16)共有41.7％序列相似性，與稻蛋白np_921091(seqidno：17)共有56.9％相似性，且與稻蛋白np_910483(seqidno：15)共有42.1％序列相似性。此外，seqidno：3與大麥蛋白aag37354(seqidno：18)共有約42.8％序列相似性。nbs-lrr組的r-基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大類r-基因。在鼠耳芥(arbidopsisthaliana)中，預(yù)期該基因組中存在超過150個(gè)(meyers，等，(2003)，plantcell，15：809-834；monosi，等，(2004)，theoreticalandappliedgenetics，109：1434-1447)，而在稻中，已經(jīng)預(yù)測(cè)了約500個(gè)nbs-lrr基因(monosi，(2004)同上)。nbs-lrr類的r基因包含2個(gè)亞類。第一類nbs-lrr基因含有在它們的n’末端的tir-toll/白細(xì)胞介素-1樣結(jié)構(gòu)域；迄今為止僅在雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)它們(meyers，(2003)同上；monosi，(2004)同上)。第二類nbs-lrr含有在它們n末端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域或(nt)結(jié)構(gòu)域(bai，等(2002)genomeresearch，12：1871-1884；monosi，(2004)同上；pan，等，(2000)，journalofmolecularevolution，50：203-213)。已經(jīng)在雙子葉植物和單子葉植物物種中發(fā)現(xiàn)了第二類nbs-lrr。(bai，(2002)同上；meyers，(2003)同上；monosi，(2()()4)同上；pan，(2000)同上)?；虻膎bs結(jié)構(gòu)域似乎在植物防御機(jī)制的信號(hào)傳導(dǎo)中起作用(vanderbiezen，等，(1998)，currentbiology：cb，8：r226-r227)。lrr區(qū)域似乎是與病原體avr產(chǎn)物相互作用的區(qū)域(michelmore，等，(1998)，genomeres.，8：1113-1130；meyers，(2003)同上)。與nbs結(jié)構(gòu)域相比，該lrr區(qū)域處于大得多的多樣性選擇壓力下(michelmore，(1998)同上；meyers，(2003)同上：palomino，等，(2002)，genomeresearch，12：1305-1315)。lrr結(jié)構(gòu)域也見于其它背景下；這些20-29-殘基基序以串聯(lián)陣列存在于具有不同功能的許多蛋白中，所述功能例如激素-受體相互作用、酶抑制、細(xì)胞粘附和細(xì)胞運(yùn)輸。許多最近的研究揭示，lrr蛋白參與早期哺乳動(dòng)物發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞極化、基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。實(shí)施方案的基因顯然與第2類家族的nbs-lrr相關(guān)，但是不會(huì)完全擬合經(jīng)典模型。氨基端與所謂的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nbs)具有同源性。也存在富亮氨酸的區(qū)域，如預(yù)期的，位于nbs的下游。但是，與以前研究的nbs-lrr蛋白不同，富亮氨酸的區(qū)域缺少在更經(jīng)典的lrr結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng)性重復(fù)性質(zhì)，在一般lxx重復(fù)模式后一致性更低，且尤其不具有wang等((1999)plantj.19：55-64；尤其參見，圖5)或bryan等((2000)，plantcell12：2033-2045；尤其參見，圖3)所述的共有序列的實(shí)例。由于lrr區(qū)域是nbs-lrr的受體部分，所以當(dāng)發(fā)現(xiàn)新的lrr時(shí)，例如本發(fā)明公開的那些，從該序列不能立即明顯得出它的活性范圍，即它會(huì)起反應(yīng)的病原體的范圍。在cg抗性表型的基礎(chǔ)上，分離了實(shí)施方案的基因，且因此新的lrr對(duì)cg反應(yīng)。但是，不排除它對(duì)在此前進(jìn)行的工作中沒有測(cè)試的其它病原體反應(yīng)。實(shí)施方案的核酸和多肽可以用于賦予或增強(qiáng)植物的真菌抗性的方法中。因此，本文公開的組合物和方法可以用于保護(hù)植物免受真菌病原體?！安≡w抗性”、“真菌抗性”和“疾病抗性”意指該植物避免疾病癥狀，所述癥狀是植物-病原體相互作用的結(jié)果。也就是說，預(yù)防病原體造成植物疾病和相關(guān)的疾病癥狀，或者，使病原體造成的疾病癥狀最小化或減輕，例如，減少應(yīng)激和相關(guān)的產(chǎn)量損失。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，本文公開的組合物和方法可以與本領(lǐng)域用于保護(hù)植物免受病原體攻擊的其它組合物和方法一起使用。因此，實(shí)施方案的方法可以用于保護(hù)植物免受疾病，尤其由植物真菌病原體造成的那些疾病。本文使用的“真菌抗性”指，與野生型植物相比，增強(qiáng)的對(duì)真菌病原體的抗性或耐受性。作用可以從對(duì)真菌病原體作用耐受性的輕微增加(例如，部分抑制)至完全抗性，從而使植物不受真菌病原體存在的影響。增加水平的對(duì)特定真菌病原體或?qū)Ω鼜V譜真菌病原體的抗性，構(gòu)成“增強(qiáng)的”或提高的真菌抗性。本發(fā)明實(shí)施方案也將增強(qiáng)或提高真菌植物病原體抗性，從而使植物對(duì)真菌病原體或病原體的抗性增加。術(shù)語“增強(qiáng)”指提高、增加、擴(kuò)增、倍增、升高、增高等。在本文中，將本發(fā)明的植物描述成抗cg感染，或?qū)g感染具有′增強(qiáng)的抗性′，這是本發(fā)明的rcg1基因座的結(jié)果。因此，與因?yàn)槿鄙賠cg1基因座而對(duì)cg感染易感的等價(jià)植物相比，它們通常表現(xiàn)出增加的對(duì)疾病的抗性。例如，使用實(shí)施例11(也參見圖20)所述的評(píng)分系統(tǒng)，與因?yàn)槿鄙賠cg1基因座而對(duì)cg感染易感的等價(jià)植物相比時(shí)，它們的感染評(píng)分通常表現(xiàn)出1點(diǎn)、2點(diǎn)、或3點(diǎn)或更多的降低，甚至評(píng)分減少至1或0。在具體方面，賦予或增強(qiáng)植物的真菌抗性的方法包含，向植物中導(dǎo)入至少一個(gè)表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含編碼實(shí)施方案的抗真菌多肽的核苷酸序列，其可操作地連接到驅(qū)動(dòng)在植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子上。植物表達(dá)該多肽，從而賦予植物真菌抗性，或提高植物的固有抗性水平。在具體實(shí)施方案中，該基因賦予對(duì)真菌病原體cg的抗性。實(shí)施方案的抗真菌多肽的表達(dá)，可以靶向其中病原體抗性是特別重要的特定植物組織，例如，葉子、根、莖或維管組織。這樣的組織-優(yōu)選的表達(dá)可以通過根-優(yōu)選的、葉子-優(yōu)選的、維管組織-優(yōu)選的、莖-優(yōu)選的、或種子-優(yōu)選的啟動(dòng)子來實(shí)現(xiàn)。本文使用的“核酸”包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限制，包括具有天然核苷酸的基本性質(zhì)、表現(xiàn)為它們以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交的已知類似物(例如，肽核酸)。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互換地用于指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語適用于氨基酸聚合物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是對(duì)應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物，也適用于天然存在的氨基酸聚合物。實(shí)施方案的多肽可以從本文公開的核酸生產(chǎn)，或通過使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)。例如，實(shí)施方案的截短的蛋白可以通過在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)實(shí)施方案的重組核酸來生產(chǎn)，或者通過先體外后體內(nèi)方法的組合，例如蛋白酶消化和純化來生產(chǎn)。當(dāng)在指定的核酸的上下文中使用時(shí)，本文使用的術(shù)語“編碼”或“編碼的”指，該核酸包含指導(dǎo)核苷酸序列翻譯成指定蛋白的必需信息。通過使用密碼子，指定編碼蛋白的信息。編碼蛋白的核酸可以包含在核酸的翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)，或可以缺少這樣的間插非翻譯序列(例如，象在cdna中那樣)。本發(fā)明實(shí)施方案包括分離的或基本上純化的多核苷酸或蛋白組合物?！胺蛛x的”或“純化的”多核苷酸或蛋白、或其生物活性部分，是相當(dāng)大地或基本上不含有在它天然存在的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的正常伴隨該多核苷酸或蛋白或與其相互作用的組分。因而，分離的或純化的多核苷酸或蛋白基本上不含有其它細(xì)胞材料，或當(dāng)通過重組技術(shù)(例如pcr擴(kuò)增)生產(chǎn)時(shí)的培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含有化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。最佳地，“分離的”多核苷酸不含有在該多核苷酸所來源的生物的基因組dna中天然側(cè)接該多核苷酸的序列(即，位于多核苷酸的5′和3′末端的序列)(例如，蛋白編碼序列)。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的多核苷酸可以含有小于約5kb、約4kb、約3kb、約2kb、約1kb、約0.5kb、或約0.1kb的在該多核苷酸所來源的細(xì)胞的基因組dna中天然側(cè)接該多核苷酸的核苷酸序列?；旧喜缓屑?xì)胞材料的蛋白包括含有小于約30％、約20％、約10％、約5％、或約1％(按干重計(jì))的污染蛋白的蛋白制劑。當(dāng)重組生產(chǎn)實(shí)施方案的蛋白、或其生物活性部分時(shí)，培養(yǎng)基最佳地代表小于約30％、約20％、約10％、約5％、或約1％(按干重計(jì))的化學(xué)前體或非目標(biāo)蛋白化學(xué)藥品。實(shí)施方案也包括公開的核苷酸序列和其編碼的蛋白的片段和變體?！捌巍币庠谥负塑账嵝蛄械牟糠只虬被嵝蛄械牟糠郑陀纱司幋a的蛋白。核苷酸序列片段可以編碼保持天然蛋白的生物活性的蛋白片段，并因此具有賦予植物真菌抗性的能力?；蛘?，用作雜交探針的核苷酸序列片段不一定編碼保持生物活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列片段可以是至少約15個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸，且最高達(dá)編碼實(shí)施方案多肽的全長(zhǎng)核苷酸序列。編碼實(shí)施方案多肽的生物活性部分的核苷酸序列片段將編碼至少約15、約25、約30、約40、或約50個(gè)鄰接氨基酸，或最高達(dá)實(shí)施方案全長(zhǎng)多肽中存在的氨基酸總數(shù)(例如，seqidno：1編碼的肽的980個(gè)氨基酸)。用作雜交探針或pcr引物的核苷酸序列片段通常不需要編碼蛋白的生物活性部分。當(dāng)提及指定的多核苷酸時(shí)，本文使用的“全長(zhǎng)序列”指天然序列的整個(gè)核酸序列?！疤烊恍蛄小币庠谥竷?nèi)源序列，即見于生物基因組中的非工程改造的序列。因而，實(shí)施方案核苷酸序列的片段可以編碼多肽的生物活性部分，或它可以是用作使用下述方法的雜交探針或pcr引物的片段。通過分離實(shí)施方案核苷酸序列之一的部分，表達(dá)編碼的蛋白部分，和評(píng)價(jià)編碼的蛋白部分賦予或增強(qiáng)植物的真菌抗性的能力，可以制備抗病原體多肽的生物活性部分。作為實(shí)施方案的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約15、約20、約50、約75、約100、或約150個(gè)核苷酸，或最高達(dá)本文公開的全長(zhǎng)核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目(例如，對(duì)于seqidno：1，4212個(gè)核苷酸)?！白凅w”意在指基本上類似的序列。對(duì)于多核苷酸，變體包含在天然多核苷酸內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處缺失和/或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，和/或在天然多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)置換一個(gè)或多個(gè)核苷酸。本文使用的“天然”多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以構(gòu)建實(shí)施方案核酸的變體，從而維持可讀框。關(guān)于多核苷酸，保守變體包括這樣的序列，其因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，編碼實(shí)施方案多肽之一的氨基酸序列。天然存在的等位基因變體，例如使用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)(例如，下述的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)和雜交技術(shù))可以鑒別出的那些。變體多核苷酸也包括合成地衍生的多核苷酸，例如使用例如定點(diǎn)誘變產(chǎn)生、但是仍然編碼實(shí)施方案蛋白的那些。通常，如通過本文別處所述的序列比對(duì)程序和參數(shù)測(cè)得的，實(shí)施方案的特定多核苷酸的變體與該特定多核苷酸將具有至少約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高序列同一性。通過對(duì)比變體多核苷酸編碼的多肽和參照多核苷酸編碼的多肽之間的百分比序列同一性，也可以評(píng)價(jià)實(shí)施方案的特定多核苷酸(即，參照多核苷酸)的變體。因而，例如，公開了編碼與seqidno：3的多肽具有給定百分比序列同一性的多肽的分離的多核苷酸。使用本文別處所述的序列比對(duì)程序和參數(shù)，可以計(jì)算任意2個(gè)多肽之間的百分比序列同一性。當(dāng)通過對(duì)比它們編碼的2個(gè)多肽共有的百分比序列同一性來評(píng)價(jià)任意一對(duì)給定的實(shí)施方案多核苷酸時(shí)，2個(gè)編碼的多肽之間的百分比序列同一性是至少約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高序列同一性?！白凅w”蛋白意在指，通過在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部位點(diǎn)處缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，和/或在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，從天然蛋白衍生出的蛋白。實(shí)施方案包括的變體蛋白是生物活性的，也就是說，它們繼續(xù)具有需要的天然蛋白的生物活性，即本文所述的賦予或增強(qiáng)植物真菌病原體抗性的能力。這樣的變體可以源自例如基因多態(tài)性或人工操作。如通過本文別處所述的序列比對(duì)程序和參數(shù)測(cè)得的，實(shí)施方案天然蛋白的生物活性變體與天然蛋白的氨基酸序列將具有至少約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或更高的序列同一性。實(shí)施方案蛋白的生物活性變體可以與該蛋白相差少至約1-15個(gè)氨基酸殘基，少至約1-10個(gè)、例如約6-10個(gè)、少至約5個(gè)、少至4、3、2或甚至1個(gè)氨基酸殘基?？梢砸愿鞣N方式改變實(shí)施方案的蛋白，包括氨基酸置換、缺失、截短和插入。這樣的操作的方法是本領(lǐng)域普遍已知的。例如，通過dna突變，可以制備出抗病原體蛋白的氨基酸序列變體和片段。誘變和多核苷酸改變的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，kunkel(1985)proc.natl.acad.sci.usa82：488-492；kunkel等(1987)methodsinenzymol.154：367-382；美國(guó)專利號(hào)4,873,192；walker和gaastra，編.(1983)techniquesinmolecularbiology(macmillanpublishingcompany，newyork)和其中引用的參考文獻(xiàn)。關(guān)于不影響目標(biāo)蛋白的生物活性的適當(dāng)氨基酸置換的指南，可以參見本文引作參考的dayhoff等(1978)atlasofproteinsequenceandstructure(natl.biomed.res.found.，washington，d.c.)的模型。保守置換可能是最佳的，例如將一個(gè)氨基酸替換為具有類似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸。因而，實(shí)施方案的基因和多核苷酸包括天然存在的序列以及突變體形式。類似地，實(shí)施方案的蛋白包括天然存在的蛋白及其變體和修飾形式。這樣的變體將繼續(xù)具有需要的賦予或增強(qiáng)植物真菌病原體抗性的能力。顯然，將在編碼變體的dna中產(chǎn)生的突變必須不能將該序列置于讀框之外，且最佳地將不產(chǎn)生互補(bǔ)區(qū)，后者會(huì)產(chǎn)生二級(jí)mrna結(jié)構(gòu)。參見，歐洲專利號(hào)0075444。預(yù)期本文包含的蛋白序列的缺失、插入和置換不產(chǎn)生蛋白特征的根本變化。但是，當(dāng)事先難以預(yù)測(cè)置換、缺失或插入的確切作用時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，將通過篩選已經(jīng)用變體蛋白轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物，以確定對(duì)植物的抗真菌病原體攻擊能力的作用，來評(píng)價(jià)該作用。變體多核苷酸和蛋白也包括源自誘變或重組操作的序列和蛋白，包括且不限于諸如dna改組的操作。本領(lǐng)域技術(shù)人員能預(yù)見到會(huì)改變蛋白響應(yīng)的病原體范圍的修飾。利用這樣的操作，可以操縱一個(gè)或多個(gè)不同的蛋白編碼序列，以生成具有所需的性質(zhì)的新蛋白。以此方式，從包含具有相當(dāng)大序列同一性、且可以體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)域的相關(guān)序列多核苷酸群體生成重組多核苷酸文庫。例如，使用該方案，可以使編碼目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的序列基序在實(shí)施方案的蛋白基因和其它已知蛋白基因之間改組，以得到編碼具有提高的目標(biāo)性質(zhì)的蛋白的新基因，例如提高的賦予或增強(qiáng)植物真菌病原體抗性的能力。這樣的dna改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，stemmer(1994)proc.natl.acad.sci.usa91：10747-10751；stemmer(1994)nature370：389-391；crameri等(1997)naturebiotech.15：436-438；moore等(1997)j.mol.biol.272：336-347；zhang等(1997)proc.natl.acad.sci.usa94：4504-4509；crameri等(1998)nature391：288-291；和美國(guó)專利號(hào)5,605,793和5,837,458。實(shí)施方案的多核苷酸可以用于從其它生物、尤其其它植物分離對(duì)應(yīng)的序列。以此方式，諸如pcr、雜交等的方法等可以用于鑒別這樣的序列，這基于它們與本文所述序列的序列同源性。實(shí)施方案包括，基于它們與本文所述整個(gè)序列或其變體和片段的序列同一性而分離的序列。這樣的序列包括作為公開序列的直向同源物的序列?！爸毕蛲次铩币庠谥冈醋怨餐嫦然蚯矣捎谖锓N形成而見于不同物種中的基因。當(dāng)它們的核苷酸序列和/或它們編碼的蛋白序列共有至少約60％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、或更大的序列同一性時(shí)，認(rèn)為在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因是直向同源物。直向同源物的功能經(jīng)常在物種間是高度保守的。因而，實(shí)施方案包括分離的多核苷酸，其編碼賦予或增強(qiáng)真菌植物病原體抗性的蛋白，且在嚴(yán)格條件下與本文公開的序列或其變體或片段雜交。在pcr方案中，可以設(shè)計(jì)寡核苷酸引物用于pcr反應(yīng)中，以從提取自任意目標(biāo)生物的cdna或基因組dna擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的dna序列。設(shè)計(jì)pcr引物和pcr克隆的方法，是本領(lǐng)域普遍已知的，且公開在sambrook等(1989)molecularcloning：alaboratorymanual(2ded.，coldspringharborlaboratorypress，plainview，newyork)。也參見innis等，編.(1990)pcrprotocols：aguidetomethodsandapplications(academicpress，newyork)；innis和gelfand，編.(1995)pcrstrategies(academicpress，newyork)；和innis和gelfand，編.(1999)pcrmethodsmanual(academicpress，newyork)。已知的pcr方法包括、且不限于，使用配對(duì)引物、嵌套引物、單特異性引物、簡(jiǎn)并引物、基因-特異性引物、載體-特異性引物、部分地錯(cuò)配的引物等的方法。在雜交技術(shù)中，使用全部或部分已知的多核苷酸作為探針，該探針選擇性地與存在于從選定的生物克隆的基因組dna片段或cdna片段群體(即，基因組或cdna文庫)中的其它對(duì)應(yīng)多核苷酸雜交。雜交探針可以是基因組dna片段、cdna片段、rna片段或其它寡核苷酸，且可以用可檢測(cè)基團(tuán)(例如32p)或任意其它可檢測(cè)標(biāo)記作出標(biāo)記。因而，例如，通過標(biāo)記基于實(shí)施方案多核苷酸的合成寡核苷酸，可以制作雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cdna和基因組文庫的方法，是本領(lǐng)域普遍已知的，且公開在sambrook等(1989)同上。例如，本文公開的整個(gè)多核苷酸、或其一個(gè)或多個(gè)部分，可以用作能特異性與對(duì)應(yīng)多核苷酸和信使rna雜交的探針。為了實(shí)現(xiàn)在許多條件下的特異性雜交，這樣的探針包括獨(dú)特的、且最佳為至少約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)、至少約15個(gè)核苷酸長(zhǎng)或至少約20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的序列。這樣的探針可以用于通過pcr從選定的生物擴(kuò)增對(duì)應(yīng)多核苷酸。該技術(shù)可以用于從所需生物分離其它編碼序列，或作為確定生物中存在編碼序列的診斷測(cè)定。雜交技術(shù)包括鋪平板的dna文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；參見，例如，sambrook等(1989)同上)。這樣的序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行?！皣?yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指這樣的條件，在該條件下，探針將與它的靶序列的雜交程度在檢測(cè)上大于與其它序列的雜交程度(例如，為背景的至少2-倍)。嚴(yán)格條件是序列-依賴性的，且在不同情況下將是不同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒別出與探針100％互補(bǔ)的靶序列(同源探測(cè))?；蛘撸梢哉{(diào)節(jié)嚴(yán)格性條件，以允許序列中的有些錯(cuò)配，從而檢測(cè)更低程度的相似性(異源探測(cè))。通常，探針的長(zhǎng)度小于約1000個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)度小于500個(gè)核苷酸。一般地，嚴(yán)格條件是這樣的，其中鹽濃度小于約1.5mna離子，通常約0.01-1.0mna離子濃度(或其它鹽)，ph7.0-8.3，且對(duì)于短探針(例如，10-50個(gè)核苷酸)，溫度是至少約30℃，而對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)，溫度是至少約60℃。通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺，也可以達(dá)到嚴(yán)格條件。示例性的低嚴(yán)格性條件包括，在37℃用30-35％甲酰胺、1mnacl、1％sds(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液雜交，及在50-55℃在1x-2xssc(20xssc＝3.0mnacl/0.3m檸檬酸三鈉)中洗滌。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括，在37℃、在40-45％甲酰胺、1.0mnacl、1％sds中雜交，和在55-60℃、在0.5x-1xssc中洗滌。示例性的高嚴(yán)格性條件包括，在37℃、在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中雜交，最后在60-65℃、在0.1xssc中洗滌至少30分鐘。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0.1％-約1％sds。雜交持續(xù)時(shí)間通常小于約24小時(shí)，經(jīng)常約4-約12小時(shí)。洗滌持續(xù)時(shí)間將至少是足以達(dá)到平衡的時(shí)間長(zhǎng)度。特異性通常隨雜交后的洗滌而變化，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強(qiáng)度和溫度。對(duì)于dna-dna雜交體，可以從meinkoth和wahl(1984)anal.biochem.138：267-284的方程估計(jì)出熱解鏈溫度(tm)：tm＝81.5℃+16.6(logm)+0.41(％gc)-0.61(％form)-500/l；其中m是單價(jià)陽離子的體積摩爾濃度，％gc是dna中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，且l是按堿基對(duì)計(jì)算的雜交體長(zhǎng)度。tm是50％的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和ph下)。對(duì)于每1％的錯(cuò)配，tm降低約1℃；因而，可以調(diào)節(jié)tm、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序列雜交。例如，如果要得到具有≥90％同一性的序列，則可以使tm降低10℃。通常，將嚴(yán)格性條件選擇在，在確定的離子強(qiáng)度和ph處，比特定序列序列和它的互補(bǔ)體的tm低約5℃。但是，非常嚴(yán)格的條件可以使用比tm低1、2、3或4℃的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格性條件可以使用比tm低6、7、8、9或10℃的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格性條件可以使用比tm低11、12、13、14、15或20℃的雜交和/或洗滌。使用該方程、雜交和洗滌組合物和所需的tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，內(nèi)在地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性的變化。如果所需的錯(cuò)配程度產(chǎn)生小于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的tm，則最佳地增加ssc濃度，從而可以使用更高的溫度。關(guān)于核酸雜交的廣泛指南，參見tijssen(1993)laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes，parti，chapter2(elsevier，newyork)；和ausubel等，編.(1995)currentprotocolsinmolecularbiology，chapter2(greenepublishingandwiley-interscience，newyork)。參見sambrook等(1989)同上。各種方法可以用于檢查存在或不存在dna、rna、或蛋白的特定序列。它們包括，例如，dna印跡、rna印跡、蛋白印跡和elisa分析。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且存在許多參考文獻(xiàn)，它們提供了詳細(xì)方案。這樣的參考文獻(xiàn)包括sambrook等(1989)同上，和crowther，j.r.(2001)，theelisaguidebook，humanapress，totowa，nj，usa。下面的術(shù)語用于描述2個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系：(a)“參照序列，”(b)“對(duì)比窗，”(c)“序列同一性，”和，(d)“序列同一性百分比”。(a)本文使用的“參照序列”是用作序列對(duì)比的基礎(chǔ)的確定序列。參照序列可以是指定序列的子集或整體；例如，作為全長(zhǎng)cdna或基因序列的片段，或整個(gè)cdna或基因序列。(b)本文使用的“對(duì)比窗”指多核苷酸序列的鄰接的和指定的片段，其中與用于2個(gè)多核苷酸的最佳比對(duì)的參照序列(不包含添加或缺失)相比，對(duì)比窗中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，缺口)。通常，對(duì)比窗的長(zhǎng)度是至少約20個(gè)鄰接核苷酸，且任選地可以是約30、約40、約50、約100、或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而與參照序列的高相似性，通常導(dǎo)入缺口罰分，并從匹配數(shù)目中減去。比對(duì)對(duì)比序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。因而，使用數(shù)學(xué)算法，可以確定任意2個(gè)序列之間的序列同一性百分比。這樣的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是myers和miller(1988)cabios4：11-17的算法；smith等(1981)adv.appl.math.2：482的局部比對(duì)算法；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48：443-453的全局比對(duì)算法；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.85：2444-2448的局部搜索比對(duì)方法；karlin和altschul(1990)proc.natl.acad.sci.usa872264的算法，如在karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：5873-5877中所改進(jìn)的。這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)，可以用于對(duì)比序列，以確定序列同一性。這樣的實(shí)現(xiàn)包括，且不限于：pc/gene程序中的clustal(可從intelligenetics，mountainview，california得到)；align程序(2.0)和gcgwisconsingenetics軟件包10版(可從accelrysinc.，9685scrantonroad，sandiego，california，usa得到)中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。使用默認(rèn)參數(shù)，可以執(zhí)行使用這些程序的比對(duì)。clustal程序詳細(xì)記載在higgins等(1988)gene73：237-244(1988)；higgins等(1989)cabios5：151-153；corpet等(1988)nucleicacidres.16：10881-90；huang等(1992)cabios8：155-65；和pearson等(1994)meth.mol.biol.24：307-331。align程序是基于上面myers和miller(1988)的算法。當(dāng)對(duì)比氨基酸序列時(shí)，可以在align程序中使用pam120加權(quán)殘基表，缺口長(zhǎng)度罰分為12，缺口罰分為4。altschul等(1990)j.mol.biol.215：403的blast程序是基于上面karlin和altschul(1990)的算法?？梢杂胋lastn程序進(jìn)行blast核苷酸搜索，評(píng)分＝100，字長(zhǎng)＝12，以得到與編碼實(shí)施方案蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列?？梢杂胋lastx程序進(jìn)行blast蛋白搜索，評(píng)分＝50，字長(zhǎng)＝3，以得到與實(shí)施方案蛋白或多肽同源的氨基酸序列。為了得到用于對(duì)比目的的有缺口的比對(duì)，可以如altschul等(1997)nucleicacidres.25：3389所述使用有缺口的blast(在blast2.0中)?；蛘?，psi-blast(在blast2.0中)可以用于進(jìn)行重復(fù)搜索，其檢測(cè)分子之間的距離關(guān)系。參見altschul等(1997)同上。當(dāng)使用blast、有缺口的blast、psi-blast時(shí)，可以使用各程序的默認(rèn)參數(shù)(例如，對(duì)于核苷酸序列的blastn，對(duì)于蛋白的blastx)。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以通過目檢，手工地進(jìn)行比對(duì)。除非另有說明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用gap10版、使用下述參數(shù)得到的值：使用50的缺口權(quán)重和3的長(zhǎng)度權(quán)重和nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣，核苷酸序列的％同一性和％相似性；使用8的缺口權(quán)重和2的長(zhǎng)度權(quán)重和blosum62評(píng)分矩陣，氨基酸序列的％同一性和％相似性；或其任意等價(jià)程序?！暗葍r(jià)程序”是指，當(dāng)與gap10版生成的對(duì)應(yīng)比對(duì)相對(duì)比時(shí)，對(duì)于任意2個(gè)正被討論的序列，產(chǎn)生具有相同核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同百分比序列同一性的比對(duì)的任意序列對(duì)比程序。gap使用needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48：443-453的算法，以發(fā)現(xiàn)使匹配數(shù)最大化且使缺口數(shù)最小化的2個(gè)完整序列的比對(duì)。gap考慮所有可能的比對(duì)和缺口位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少缺口的比對(duì)。它允許提供以匹配堿基為單位的缺口產(chǎn)生罰分和缺口延伸罰分。對(duì)于插入的每個(gè)缺口，gap必須利用缺口產(chǎn)生罰分匹配數(shù)。如果選擇大于0的缺口延伸罰分，則gap對(duì)于每個(gè)插入的缺口必須另外利用缺口長(zhǎng)度乘以缺口延伸罰分。在gcgwisconsingenetics軟件包10版中，蛋白序列的默認(rèn)缺口生成罰分值和缺口延伸罰分值分別是8和2。對(duì)于核苷酸序列，默認(rèn)缺口生成罰分是50，而默認(rèn)缺口延伸罰分是3。缺口生成和缺口延伸罰分可以表達(dá)為選自0-200的整數(shù)。因而，例如，缺口生成和缺口延伸罰分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。gap代表最佳比對(duì)家族的一個(gè)成員。該家族可以存在許多成員，且其它成員沒有更好的品質(zhì)。gap表現(xiàn)出4個(gè)比對(duì)品質(zhì)因數(shù)：品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是計(jì)量最大化的，以比對(duì)序列。比率是品質(zhì)除以更短片段中的堿基數(shù)。百分比同一性是實(shí)際上匹配的符號(hào)的百分比。百分比相似性是相似的符號(hào)的百分比。忽略在缺口對(duì)面的符號(hào)。當(dāng)一對(duì)符號(hào)的評(píng)分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，評(píng)為相似性。在gcgwisconsingenetics軟件包10版中使用的評(píng)分矩陣是blosum62(參見henikoff和henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa89：10915)。(c)在2個(gè)多核苷酸或多肽序列的上下文中，本文使用的“序列同一性”或“同一性”指，當(dāng)比對(duì)指定對(duì)比窗中的最大一致性時(shí)，2個(gè)序列中相同的殘基。當(dāng)序列同一性百分比用于指蛋白時(shí)，公認(rèn)的是，不同的殘基位置的差異經(jīng)常在于保守氨基酸置換，其中氨基酸殘基被置換為具有類似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的其它氨基酸殘基，且因此不改變?cè)摲肿拥墓δ苄再|(zhì)。當(dāng)序列差異在于保守置換時(shí)，可以向上調(diào)節(jié)百分比序列同一性，以改正置換的保守性質(zhì)。據(jù)稱差異在于這樣的保守置換的序列具有“序列相似性”或“相似性”。進(jìn)行該調(diào)節(jié)的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。一般地，這包含將保守置換評(píng)分為部分的、而不是完全的錯(cuò)配，從而增加百分比序列同一性。因而，例如，當(dāng)相同氨基酸評(píng)分為1、且非保守置換評(píng)分為0時(shí)，保守置換評(píng)分是在0-1之間。計(jì)算保守置換的評(píng)分，例如，如在程序pc/gene(intelligenetics，mountainview，california)中所實(shí)現(xiàn)的。(d)本文使用的“序列同一性百分比”指，通過在對(duì)比窗中對(duì)比2個(gè)最佳比對(duì)的序列測(cè)得的值，其中與用于2個(gè)序列的最佳比對(duì)的參照序列(不包含添加或缺失)相比，對(duì)比窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即，缺口)。如下計(jì)算百分比：確定2個(gè)序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)目，以得到匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以對(duì)比窗中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100，以得到序列同一性百分比。術(shù)語“多核苷酸”的應(yīng)用，無意將實(shí)施方案限制為包含dna的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。這樣的脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的類似物。實(shí)施方案的多核苷酸也包括序列的所有形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式等。實(shí)施方案的分離的多核苷酸可以整合入能導(dǎo)入宿主細(xì)胞并在其中復(fù)制的重組dna構(gòu)建體中?！拜d體”可以是這樣的構(gòu)建體，其包括復(fù)制系統(tǒng)和能在給定宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽編碼序列的序列。已經(jīng)描述了適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞或確立轉(zhuǎn)基因植物的許多載體，例如，pouwels等，cloningvectors：alaboratorymanual，1985，supp.1987：weissbach和weissbach，methodsforplantmolecularbiology，academicpress，1989；和flevin等，plantmolecularbiologymanual，kluweracademicpublishers，1990。一般地，植物表達(dá)載體包括，例如，在5′和3′調(diào)節(jié)序列和顯性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄控制下的一個(gè)或多個(gè)克隆的植物基因。這樣的植物表達(dá)載體也可以含有啟動(dòng)子調(diào)節(jié)區(qū)(例如，控制誘導(dǎo)型或組成型、環(huán)境-或發(fā)育-調(diào)節(jié)的、或細(xì)胞-或組織-特異性的表達(dá)的調(diào)節(jié)區(qū))、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、rna加工信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號(hào)。術(shù)語“重組構(gòu)建體”、“表達(dá)盒”、“表達(dá)構(gòu)建體”、“嵌合構(gòu)建體”、“構(gòu)建體”、“重組dna構(gòu)建體”和“重組dna片段”在本文中可互換地使用，且是核酸片段。重組構(gòu)建體包含核酸片段的人工組合，包括且不限于，在自然界不一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和編碼序列。例如，重組dna構(gòu)建體可以包含源自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或源自相同來源且以與自然界發(fā)現(xiàn)的不同的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。這樣的構(gòu)建體可以單獨(dú)使用，或可以與載體結(jié)合使用。如果使用載體，則載體的選擇依賴于用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法，如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，可以使用質(zhì)粒載體。熟練的技術(shù)人員熟知必須存在于載體上的遺傳元件，以成功地進(jìn)行轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖包含實(shí)施方案的任意分離的核酸片段的宿主細(xì)胞。通過擴(kuò)增、dna印跡分析、mrna表達(dá)的rna印跡分析、蛋白表達(dá)的免疫印跡分析、表型分析等，可以進(jìn)行篩選，以得到表現(xiàn)出多核苷酸或rcg1基因座的所需表達(dá)水平和模式的系。術(shù)語“重組dna構(gòu)建體”指由從不同來源獲取的核酸片段裝配而成的dna構(gòu)建體。核酸片段的類型和起源可以非常不同。在有些實(shí)施方案中，另外提供了包含可操作地連接到實(shí)施方案的異源核苷酸序列上的啟動(dòng)子的表達(dá)盒。實(shí)施方案的表達(dá)盒可以用于生成轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞和微生物，及用于實(shí)施誘導(dǎo)本文公開的植物真菌病原體抗性的方法。表達(dá)盒包括可操作地連接到實(shí)施方案的多核苷酸上的5′和3′調(diào)節(jié)序列?！翱刹僮鞯剡B接”意在指2個(gè)或更多個(gè)元件之間的功能連接?！罢{(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列的上游(5’非編碼序列)、之內(nèi)或下游(3’非編碼序列)的核苷酸，且其可以影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、rna加工、穩(wěn)定性或翻譯。調(diào)節(jié)序列可以包括，但不限于，啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識(shí)別序列。例如，目標(biāo)多核苷酸和調(diào)節(jié)序列(啟動(dòng)子，例如)之間的可操作連接是允許表達(dá)目標(biāo)多核苷酸的功能連接。可操作地連接的元件可以是鄰接的或非鄰接的。當(dāng)用于指2個(gè)蛋白編碼區(qū)的連接時(shí)，可操作地連接的意指編碼區(qū)是在相同讀框中。表達(dá)盒可以另外含有至少一個(gè)要共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物中的其它基因?；蛘?，可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供其它基因。這樣的表達(dá)盒提供有多個(gè)限制位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)，用于插入在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下的編碼抗病原體多肽的多核苷酸。表達(dá)盒可以另外含有選擇標(biāo)記基因。表達(dá)盒將在5′-3′轉(zhuǎn)錄方向包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即，啟動(dòng)子)、翻譯起始區(qū)、實(shí)施方案的多核苷酸、翻譯終止區(qū)和在宿主生物中起功能的任選的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。調(diào)節(jié)區(qū)(即，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和翻譯終止區(qū))和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账釋?duì)于宿主細(xì)胞而言或相互可以是天然的/類似的?；蛘?，調(diào)節(jié)區(qū)和/或?qū)嵤┓桨傅亩嗪塑账峥梢允撬拗骷?xì)胞異源的或彼此異源的。本文使用的“異源的”序列是源自外來物種的序列，或者如果來自相同物種，則通過故意的人工干預(yù)，從它在組合物和/或基因組基因座中的天然形式進(jìn)行相當(dāng)大的修飾。例如，可操作地連接到異源多核苷酸上的啟動(dòng)子來自與多核苷酸所來源的物種不同的物種，或者如果來自相同/類似物種，則從它們的原始形式和/或基因組基因座相當(dāng)大地修飾其中之一或二者，或者啟動(dòng)子不是可操作地連接的多核苷酸的天然啟動(dòng)子。任選地包含的終止區(qū)可以是對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)天然的，可以是對(duì)于可操作地連接的目標(biāo)多核苷酸天然的，可以是對(duì)于植物宿主天然的，或可以源自啟動(dòng)子、目標(biāo)多核苷酸、宿主或其任意組合的另一個(gè)來源(即，外來的或異源的)。方便的終止區(qū)可以從根癌土壤桿菌(a.tumefaciens)的ti-質(zhì)粒得到，例如，章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。也參見guerineau等(1991)mol.gen.genet.262：141-144；proudfoot(1991)cell64：671-674；sanfacon等(1991)genesdev.5：141-149；mogen等(1990)plantcell2：1261-1272；munroe等(1990)gene91：151-158；ballas等(1989)nucleicacidres.17：7891-7903；和joshi等(1987)nucleicacidres.15：9627-9639。在具體實(shí)施方案中，使用馬鈴薯蛋白酶抑制劑ii基因(pinii)終止子。參見，例如，keil等(1986)nucl.acidsres.14：5641-5650；和an等(1989)plantcell1：115-122，它們?cè)诒疚闹姓w引作參考。許多啟動(dòng)子可以用于實(shí)踐實(shí)施方案，包括目標(biāo)多核苷酸序列的天然啟動(dòng)子?？梢曰谒璧慕Y(jié)果來選擇啟動(dòng)子。在本文引作參考的potenza等(2004)invitrocelldevbiol-plant40：1-22的最近的綜述中，討論了許多種植物啟動(dòng)子。例如，核酸可以與組成型、組織-優(yōu)選的、病原體-誘導(dǎo)型或其它啟動(dòng)子相組合，以在植物中表達(dá)。這樣的組成型啟動(dòng)子包括，例如，rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子，和在wo99/43838和美國(guó)專利號(hào)6,072,050中公開的其它組成型啟動(dòng)子；核心camv35s啟動(dòng)子(odell等(1985)nature313：810-812)；稻肌動(dòng)蛋白(mcelroy等(1990)plantcell2：163-171)；遍在蛋白(christensen等(1989)plantmol.biol.12：619-632和christensen等(1992)plantmol.biol.18：675-689)；pemu(last等(1991)theor.appl.genet.81：581-588)；mas(velten等(1984)emboj.3：2723-2730)；als啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,659,026)，等。其它組成型啟動(dòng)子包括，例如，美國(guó)專利號(hào)5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。有時(shí)，從誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、尤其從病原體-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)基因有時(shí)是有益的。這樣的啟動(dòng)子包括，來自致病相關(guān)蛋白(pr蛋白)的那些，它們?cè)诓≡w感染后被誘導(dǎo)；例如，pr蛋白、sar蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等。參見，例如，redolfi等(1983)neth.j.plantpathol.89：245-254；uknes等(1992)plantcell4：645-656：和vanloon(1985)plantmol.virol.4：111-116。也參見本文引作參考的wo99/43819。令人感興趣的是導(dǎo)致在病原體感染部位處或附近局部地表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子。參見，例如，marineau等(1987)plantmol.biol.9：335-342；matton等(1989)molecularplant-microbeinteractions2：325-331；somsisch等(1986)proc.natl.acad.sci.usa83：2427-2430；somsisch等(1988)mol.gen.genet.2：93-98；和yang(1996)proc.natl.acad.sci.usa93：14972-14977。也參見，chen等(1996)plantj.10：955-966；zhang等(1994)proc.natl.acad.sci.usa91：2507-2511；warner等(1993)plantj.3：191-201；siebertz等(1989)plantcell1：961-968；美國(guó)專利號(hào)5,750,386(線蟲-誘導(dǎo)型)；和其中引用的參考文獻(xiàn)。特別令人感興趣的是玉米prms基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它的表達(dá)由病原體串珠鐮孢(fusariummoniliforme)誘導(dǎo)(參見，例如，cordero等(1992)physiol.mol.plantpath.41：189-200)。另外，隨著病原體通過傷口或昆蟲損傷進(jìn)入植物，傷口-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以用于實(shí)施方案的構(gòu)建。這樣的傷口-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括馬鈴薯蛋白酶抑制劑(pinii)基因(ryan(1990)ann.rev.phytopath.28：425-449；duan等(1996)naturebiotechnology14：494-498)；wun1和wun2，美國(guó)專利號(hào)5,428,148；win1和win2(stanford等(1989)mol.gen.genet.215：200-208)；系統(tǒng)素(mcgur1等(1992)science225：1570-1573)；wip1(rohmeier等(1993)plantmol.biol.22：783-792；eckelkamp等(1993)febsletters323：73-76)；mpi基因(corderok等(1994)plantj.6(2)：141-150)；等，本文引作參考。通過應(yīng)用外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑，可以將化學(xué)藥品調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子用于調(diào)節(jié)基因在植物中的表達(dá)。根據(jù)目的，啟動(dòng)子可以是化學(xué)藥品-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(這時(shí)使用化學(xué)藥品誘導(dǎo)基因表達(dá))或化學(xué)藥品-抑制型啟動(dòng)子(這時(shí)使用化學(xué)試劑阻抑基因表達(dá))?；瘜W(xué)藥品-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，并包括且不限于，玉米in2-2啟動(dòng)子，它由苯磺酰胺除草劑安全劑激活，玉米gst啟動(dòng)子，它由用作突出前(pre-emergent)除草劑的疏水親電子化合物激活，和煙草pr-1a啟動(dòng)子，它由水楊酸激活。其它化學(xué)藥品調(diào)節(jié)的目標(biāo)啟動(dòng)子包括類固醇-響應(yīng)型啟動(dòng)子(參見，例如，schena等(1991)proc.natl.acad.sci.usa88：10421-10425和mcnellis等(1998)plantj.14(2)：247-257中的糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)和四環(huán)素-誘導(dǎo)型和四環(huán)素-阻抑型啟動(dòng)子(參見，例如，gatz等(1991)mol.gen.genet.227：229-237，和美國(guó)專利號(hào)5,814,618和5,789,156)，本文引作參考。組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子可以用于在特定植物組織內(nèi)靶定增強(qiáng)的實(shí)施方案的多肽的表達(dá)。例如，組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子可以用于在疾病抗性特別重要的植物組織(例如，根、莖或葉子)中表達(dá)多肽。組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子包括yamamoto等(1997)plantj.12(2)：255-265；kawamata等(1997)plantcellphysiol.38(7)：792-803；hansen等(1997)mol.gengenet.254(3)：337-343；russell等(1997)transgenicres.6(2)：157-168；rinehart等(1996)plantphysiol.112(3)：1331-1341；vancamp等(1996)plantphysiol.112(2)：525-535；canevascini等(1996)plantphysiol.112(2)：513-524；yamamoto等(1994)plantcellphysiol.35(5)：773-778；lam(1994)resultsprobl.celldiffer.20：181-196；orozco等(1993)plantmolbiol.23(6)：1129-1138；matsuoka等(1993)procnatl.acad.sci.usa90(20)：9586-9590；和guevara-garcia等(1993)plantj.4(3)：495-505。如果需要，可以修飾這樣的啟動(dòng)子，進(jìn)行弱表達(dá)。維管組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的，且包括選擇性地驅(qū)動(dòng)在例如木質(zhì)部和韌皮部組織中的蛋白表達(dá)的那些啟動(dòng)子。維管組織-優(yōu)選的啟動(dòng)子包括且不限于，野黑櫻(prunusserotina)的野黑櫻苷水解酶基因啟動(dòng)子(參見，例如，國(guó)際公開號(hào)wo03/006651)，以及在美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)10/109,488中公開的那些。莖-優(yōu)選的啟動(dòng)子可以用于驅(qū)動(dòng)實(shí)施方案多肽的表達(dá)。示例性的莖-優(yōu)選的啟動(dòng)子包括玉米ms8-15基因啟動(dòng)子(參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,986,174和國(guó)際公開號(hào)wo98/00533)，和在graham等(1997)plantmolbiol33(4)：729-735中公開的那些。葉子-優(yōu)選的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，yamamoto等(1997)plantj.12(2)：255-265；kwon等(1994)plantphysiol.105：357-67；yamamoto等(1994)plantcellphysiol.35(5)：773-778；gotor等(1993)plantj.3：509-18；orozco等(1993)plantmol.biol.23(6)：1129-1138；和matsuoka等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90(20)：9586-9590。根-優(yōu)選的啟動(dòng)子是已知的，且可以選自從文獻(xiàn)可得到的或從各種相容物種從頭分離的許多啟動(dòng)子。參見，例如，hire等(1992)plantmol.biol.20(2)：207-218(大豆根-特異性的谷氨酰胺合成酶基因)；keller和baumgartner(1991)plantcell3(10)：1051-1061(菜豆的grp1.8基因中的根-特異性的控制元件)；sanger等(1990)plantmol.biol.14(3)：433-443(根癌土壤桿菌的甘露堿合酶(mas)基因的根-特異性的啟動(dòng)子)；和miao等(1991)plantcgll3(1)：11-22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(gs)的全長(zhǎng)cdna克隆，它在大豆根和根瘤中表達(dá))。也參見bogusz等(1990)plantcell2(7)：633-641，其中描述了2個(gè)分離自來自固氮非豆科植物糙葉山黃麻(parasponiaandersonii)和相關(guān)非固氮非豆科植物山黃麻(trematomentosa)的血紅蛋白基因的根-特異性啟動(dòng)子。這些基因的啟動(dòng)子連接在β-葡糖醛酸糖苷酶報(bào)告基因上，并導(dǎo)入非豆科植物煙草(nicotianatabacum)和豆科植物百脈根(lotuscorniculatus)，且在2個(gè)實(shí)例中，保留了根-特異性的啟動(dòng)子活性。leach和aoyagi(1991)描述了他們對(duì)高度表達(dá)的發(fā)根土壤桿菌(agrobacteriumrhizogenes)的rolc和rold根-誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的分析(參見plantscience(limerick)79(1)：69-76)。他們認(rèn)為，增強(qiáng)子和組織-優(yōu)選的dna決定子在那些啟動(dòng)子中分離。teeri等(1989)使用與lacz的基因融合來表明，編碼章魚堿合酶的土壤桿菌屬(agrobacterium)t-dna基因在根尖表皮中是特別有活性的，tr2′基因在完整植物中是根特異性的，且受到葉子組織受傷的刺激，即與殺蟲或殺幼蟲基因一起使用的特征的特別所需的組合(參見emboj.8(2)：343-350)。融合到nptii(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶ii)上的tr1′基因表現(xiàn)出類似的特征。其它根-優(yōu)選的啟動(dòng)子包括，vfenod-grp3基因啟動(dòng)子(kuster等(1995)plantmol.biol.29(4)：759-772)；和rolb啟動(dòng)子(capana等(1994)plantmol.biol.25(4)：681-691。也參見美國(guó)專利號(hào)5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179?！胺N子-優(yōu)選的”啟動(dòng)子包括“種子-特異性的”啟動(dòng)子(在種子發(fā)育過程中有活性的那些啟動(dòng)子，例如種子貯藏蛋白的啟動(dòng)子)以及“種子-萌發(fā)”啟動(dòng)子(在種子萌發(fā)過程中有活性的那些啟動(dòng)子)。參見thompson等(1989)bioessays10：108，本文引作參考。這樣的種子-優(yōu)選的啟動(dòng)子包括且不限于，cim1(細(xì)胞分裂素-誘導(dǎo)的信使)；cz19b1(玉米19kda玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(參見wo00/11177和美國(guó)專利號(hào)6,225,529；本文引作參考)。γ-玉米醇溶蛋白是優(yōu)選的胚乳-特異性的啟動(dòng)子。glob-1是一種優(yōu)選的胚-特異性的啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物，種子-特異性的啟動(dòng)子包括且不限于，豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。對(duì)于單子葉植物，種子-特異性的啟動(dòng)子包括且不限于，玉米15kda玉米醇溶蛋白、22kda玉米醇溶蛋白、27kda玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1等。也參見wo00/12733，其中公開了來自end1和end2基因的種子-優(yōu)選的啟動(dòng)子；本文引作參考。已知其它序列修飾以增強(qiáng)細(xì)胞宿主中的基因表達(dá)。它們包括消除編碼假多腺苷酸化信號(hào)的序列、外顯子-內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子-樣重復(fù)和可能對(duì)基因表達(dá)有害的其它這樣的確定表征的序列?？梢詫⑿蛄械膅-c含量調(diào)節(jié)至給定細(xì)胞宿主的平均水平，這可以通過參考在宿主細(xì)胞中表達(dá)的已知基因來計(jì)算。當(dāng)可行時(shí)，修飾序列，以避免預(yù)測(cè)的發(fā)夾二級(jí)mrna結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒可以另外含有5′前導(dǎo)序列。這樣的前導(dǎo)序列可以起增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域已知的，包括：小rna病毒前導(dǎo)序列，例如，emcv前導(dǎo)序列(腦心肌炎5′非編碼區(qū))(elroy-stein等(1989)proc.natl.acad.sci.usa86：6126-6130)；馬鈴薯y病毒組前導(dǎo)序列，例如，tev前導(dǎo)序列(煙草蝕斑病毒)(gallie等(1995)gene165(2)：233-238)，mdmv前導(dǎo)序列(玉米矮花葉病毒)，和人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(bip)(maceiak等(1991)nature353：90-94)；來自首?；ㄈ~病毒外殼蛋白mrna(amvrna4)的非翻譯前導(dǎo)序列(jobling等(1987)nature325：622-625)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(tmv)(gallie等(1989)inmolecularbiologyofrna，ed.cech(liss，newyork)，pp.237-256)；和玉米褪綠斑駁病毒前導(dǎo)序列(mcmv)(lommel等(1991)virology81：382-385)。也參見，della-cioppa等(1987)plantphysiol.84：965-968。也可以使用已知增強(qiáng)翻譯的其它方法，例如，內(nèi)含子等。在表達(dá)盒的制備中，可以操縱各種dna片段，以便以正確方向，且在適宜時(shí)，在正確的讀框中，提供dna序列。為此目的，可以使用銜接頭或接頭來連接dna片段，或可以包含其它操作，以提供方便的限制位點(diǎn)、去除多余的dna、去除限制位點(diǎn)等。為此目的，可以包含體外誘變，引物修復(fù)，限制，退火，重新置換，例如，轉(zhuǎn)換和顛換。表達(dá)盒也可以包含用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織。標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，例如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶ii(neo)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt)的基因，以及賦予對(duì)除草劑化合物的抗性的基因，例如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-d)。其它選擇標(biāo)記包括表型標(biāo)記，例如β-半乳糖苷酶和熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(gfp)(su等(2004)biotechnolbioeng85：610-9和fetter等(2004)plantcell16：215-28)、青色熒光蛋白(cyp)(bolte等(2004)j.cellscience117：943-54和kato等(2002)plantphysiol129：913-42)和黃色熒光蛋白(來自evrogen的phiyfptm，參見，bolte等(2004)j.cellscience117：943-54)。關(guān)于其它選擇標(biāo)記，一般參見，yarranton(1992)curr.opin.biotech.3：506-511；christopherson等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：6314-6318；yao等(1992)cell71：63-72；reznikoff(1992)mol.microbiol.6：2419-2422；barkley等(1980)intheoperon，pp.177-220；hu等(1987)cell48：555-566；brown等(1987)cell49：603-612；figge等(1988)cell52：713-722；deuschle等(1989)proc.natl.acad.aci.usa86：5400-5404；fuerst等(1989)proc.natl.acad.sci.usa86：2549-2553；deuschle等(1990)science248：480-483；gossen(1993)ph.d.thesis，universityofheidelberg；reines等(1993)proc.natl.acad.sci.usa90：1917-1921；labow等(1990)mol.cell.biol.10：3343-3356；zambretti等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：3952-3956；baim等(1991)proc.natl.acad.sci.usa88：5072-5076；wyborski等(1991)nucleicacidres.19：4647-4653；hillenand-wissman(1989)topicsmol.struc.biol.10：143-162；degenkolb等(1991)antimicrob.agentschemother.35：1591-1595；kleinschnidt等(1988)biochemistry27：1094-1104；bonin(1993)ph.d.thesis，universityofheidelberg；gossen等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89：5547-5551；oliva等(1992)antimicrob.agentschemother.36：913-919；hlavka等(1985)handbookofexperimentalpharmacology，vol.78(springer-verlag，berlin)；gill等(1988)nature334：721-724。這些公開內(nèi)容在本文中引作參考。上面的選擇標(biāo)記基因列表不是限制性的。在實(shí)施方案中可以使用任意的選擇標(biāo)記基因?？梢詫?shí)施方案的基因表達(dá)為轉(zhuǎn)基因，以使植物抗cg。使用本文別處所述的不同啟動(dòng)子，將允許在不同環(huán)境中以受調(diào)節(jié)的形式表達(dá)。例如，人們可能希望在莖中更高水平的表達(dá)，以增強(qiáng)對(duì)cg-造成的莖腐爛的抗性。在cg-造成的葉斑病是嚴(yán)重問題的情況下，可以使用在葉子中具有更高表達(dá)水平的系。但是，人們也可以插入整個(gè)基因(天然啟動(dòng)子和編碼序列)作為轉(zhuǎn)基因。最后，使用實(shí)施方案的基因作為轉(zhuǎn)基因，將允許與其它特性(例如昆蟲或除草劑抗性)快速組合。在某些實(shí)施方案中，可以將實(shí)施方案的核酸序列與目標(biāo)多核苷酸序列的任意組合相堆疊，以生成具有所需表型的植物。該堆疊可以如下實(shí)現(xiàn)：通過dna構(gòu)建體內(nèi)基因的組合，或通過使rcg1與包含該組合的另一個(gè)系雜交。例如，實(shí)施方案的多核苷酸可以與實(shí)施方案的任意其它多核苷酸或其它基因相堆疊。產(chǎn)生的組合也可以包括目標(biāo)多核苷酸中的任一個(gè)的多個(gè)拷貝。實(shí)施方案的多核苷酸也可以與任意其它基因或基因組合相堆疊，以生產(chǎn)具有許多所需的性狀組合的植物，所述性狀包括、且不限于下述物質(zhì)需要的性狀：動(dòng)物飼料例如高油基因(例如，美國(guó)專利號(hào)6,232,529)；平衡的氨基酸(例加hordothionins(美國(guó)專利號(hào)5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麥高賴氨酸(williamson等(1987)eur.j.biochem.165：99-106；和wo98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白(pedersen等(1986)j.biol.chem.261：6279；kirihara等(1988)gene71：359；和musumura等(1989)plantmol.biol.12：123))；增加的可消化性(例如，改良的貯藏蛋白(2001年11月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)10/053,410)；和硫氧還蛋白(2001年12月3日提交的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)10/005,429))，它們的公開內(nèi)容在本文引作參考。實(shí)施方案的多核苷酸也可以與昆蟲、疾病或除草劑抗性需要的性狀相堆疊(例如，蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)毒蛋白(美國(guó)專利號(hào)5,366,892；5,747,450；5,737,514；5723,756；5,593,881；geiser等(1986)gene48：109)；凝集素(vandamme等(1994)plantmol.biol.24：825)；串珠鐮孢菌素解毒基因(美國(guó)專利號(hào)5,792,931)；毒力和疾病抗性基因(jones等(1994)science266：789；martin等(1993)science262：1432；mindrinos等(1994)cell78：1089)；導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(als)突變體，例如s4和/或hra突變；谷氨酰胺合酶抑制劑，例如膦絲菌素或草銨膦(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(epsps基因、gat基因，例如在美國(guó)專利申請(qǐng)公開us2004/0082770、以及wo02/36782和wo03/092360中公開的那些))；和與下述內(nèi)容需要的性狀相堆疊：加工或處理產(chǎn)物例如高油(例如，美國(guó)專利號(hào)6,232,529)；改良油(例如，脂肪酸去飽和酶基因(美國(guó)專利號(hào)5,952,544；wo94/11516))；改性淀粉(例如，adpg焦磷酸化酶(agp酶)、淀粉合酶(ss)、淀粉分支酶(sbe)和淀粉脫支酶(sdbe))；和聚合物或生物塑料(bioplastics)(例如，美國(guó)專利號(hào)5.602,321；β-酮硫解酶、聚羥基丁酸鹽合酶和乙酰乙酰輔酶a還原酶(schubert等(1988)j.bacteriol.170：5837-5847)促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯(pha)的表達(dá))，它們的公開內(nèi)容在本文引作參考。人們也可以將實(shí)施方案的多核苷酸與提供農(nóng)藝學(xué)性狀(例如雄性不育(例如，參見美國(guó)專利號(hào)5.583,210)、莖強(qiáng)度、開花時(shí)間)或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀(例如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因打靶(例如wo99/61619；wo00/17364；wo99/25821))的多核苷酸相組合，它們的公開內(nèi)容在本文引作參考。這些堆疊組合可以通過下述任意方法來生成：包括且不限于，通過任意常規(guī)的或方法或遺傳轉(zhuǎn)化，雜交育種植物。如果通過遺傳轉(zhuǎn)化植物堆疊性狀，則可以在任意時(shí)間且以任意次序組合目標(biāo)多核苷酸序列。例如，可以將包含一個(gè)或多個(gè)所需性狀的轉(zhuǎn)基因植物用作通過隨后的轉(zhuǎn)化導(dǎo)入其它性狀的靶。在共轉(zhuǎn)化方案中，可以與轉(zhuǎn)化盒的任意組合提供的目標(biāo)多核苷酸同時(shí)導(dǎo)入性狀。例如，如果將導(dǎo)入2個(gè)序列，則2個(gè)序列可以包含在分開的轉(zhuǎn)化盒中(反式)或包含在相同轉(zhuǎn)化盒中(順式)。序列的表達(dá)可以由相同啟動(dòng)子或不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在某些情況下，可能需要導(dǎo)入將抑制目標(biāo)多核苷酸的表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒。這可以與其它抑制盒或超表達(dá)盒的任意組合相組合，以在植物中生成所需的性狀組合。實(shí)施方案的方法可以包含，且不限于，向植物中導(dǎo)入多肽或多核苷酸。“導(dǎo)入”意在指向植物呈遞該多核苷酸。在有些實(shí)施方案中，多核苷酸的呈遞方式使得該序列能進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部，包括它向植物基因組中的潛在插入。實(shí)施方案的方法不依賴于向植物中導(dǎo)入序列的具體方法，只是多核苷酸能進(jìn)入至少一個(gè)植物細(xì)胞內(nèi)部。向植物中導(dǎo)入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，包括且不限于，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法。“轉(zhuǎn)化”指核酸片段向宿主生物基因組中的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致遺傳穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物稱作“轉(zhuǎn)基因”生物?！八拗骷?xì)胞”指其中發(fā)生重組dna構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，且可以包括酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞和植物細(xì)胞。植物轉(zhuǎn)化的方法的實(shí)例除了別的以外包括土壤桿菌屬-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(deblaere等，1987，meth.enzymol.143：277)和顆粒-加速的或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(klein等，1987，nature(london)327：70-73；美國(guó)專利號(hào)4,945,050)。“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”意在指，導(dǎo)入植物中的核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)植物基因組中，且能被其后代遺傳。“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”或“瞬時(shí)表達(dá)”意在指，多核苷酸被導(dǎo)入植物中，但不整合進(jìn)植物基因組中，或多肽被導(dǎo)入植物中。轉(zhuǎn)化方案以及向植物中導(dǎo)入多肽或多核苷酸序列的方案可以隨被靶定用于轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞(即，單子葉植物或雙子葉植物)類型而異。合適的向植物細(xì)胞中導(dǎo)入多肽和多核苷酸的方法包括顯微注射(crossway等(1986)biotechniques4：320-334)、電穿孔(riggs等(1986)proc.natl.acad.sci.usa83：5602-5606、土壤桿菌屬-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國(guó)專利號(hào)5,563,055和5,981,840)、直接基因轉(zhuǎn)移(paszkowski等(1984)emboj.3：2717-2722)和沖擊顆粒加速(參見，例如，sanford等，美國(guó)專利號(hào)4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；tomes等(1995)inplantcell，tissue，andorganculture：fundamentalmethods，ed.gamborg和phillips(springer-verlag，berlin)；mccabe等(1988)biotechnology6：923-926)；和lecl轉(zhuǎn)化(wo00/28058)。也參見，weissinger等(1988)ann.rev.genet.22：421-477；sanford等(1987)particulatescienceandtechnology5：27-37(洋蔥)；christou等(1988)plantphysiol.87：671-674(大豆)；mccabe等(1988)bio/technology6：923-926(大豆)；finer和mcmullen(1991)invitrocelldev.biol.27p：175-182(大豆)；singh等(1998)theorr.appl.genet.96：319-324(大豆)；datta等(1990)biotechnology8：736-740(稻)；klein等(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：4305-4309(玉米)；klein等(1988)biotechnology6：559-563(玉米)；美國(guó)專利號(hào)5,240,855；5,322,783和5,324,646；klein等(1988)plantphysiol.91：440-444(玉米)；fromm等(1990)biotechnology8：833-839(玉米)；hooykaas-vanslogteren等(1984)nature(london)311：763-764；美國(guó)專利號(hào)5,736,369(谷類)；bytebier等(1987)proc.natl.acad.sci.usa84：5345-5349(百合科(liliaceae))；dewet等(1985)intheexperimentalmanipulationofovuletissues，ed.chapman等(longman，newyork)，pp.197-209(花粉)；kaeppler等(1990)plantcellreports9：415-418和kaeppler等(1992)theor.appl.genet.84：560-566(whisker-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；d′halluin等(1992)plantcell4：1495-1505(電穿孔)；li等(1993)plantcellreports12：250-255和christou和ford(1995)annalsofbotany75：407-413(稻)；osjoda等(1996)naturebiotechnology14：745-750(玉米經(jīng)由根癌土壤桿菌)；它們都在本文引作參考。在植物基因組的特定位置靶向插入多核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用位點(diǎn)-特異性的重組系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)在所需基因組位置的多核苷酸的插入。參見，例如，wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，它們都在本文引作參考。簡(jiǎn)而言之，實(shí)施方案的多核苷酸可以包含在側(cè)接2個(gè)不相同的重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移盒中。將轉(zhuǎn)移盒導(dǎo)入植物，該植物已經(jīng)在它的基因組中穩(wěn)定地整合了靶位點(diǎn)，后者側(cè)接與轉(zhuǎn)移盒的位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的2個(gè)不相同的重組位點(diǎn)。提供適當(dāng)?shù)闹亟M酶，并將轉(zhuǎn)移盒整合在靶位點(diǎn)。因此，將目標(biāo)多核苷酸整合在植物基因組的特定染色體位置。根據(jù)常規(guī)方式，可以使已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在植物中生長(zhǎng)。參見，例如，mccormick等(1986)plantcellreports5：81-84。這些植物然后可以生長(zhǎng)，用相同的轉(zhuǎn)化品系或不同品系授粉，且產(chǎn)生的后代具有所需的鑒別出的表型特征的組成型表達(dá)。可以生長(zhǎng)2代或更多代，以確保穩(wěn)定地維持和遺傳所需表型特征的表達(dá)，然后收獲種子，以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。以此方式，實(shí)施方案提供了轉(zhuǎn)化的種子(也稱作“轉(zhuǎn)基因種子”)，其具有穩(wěn)定地整合入它們的基因組中的實(shí)施方案的核苷酸構(gòu)建體，例如，實(shí)施方案的表達(dá)盒。本文使用的術(shù)語“植物”可以是完整植物、其任意部分、或源自植物的細(xì)胞或組織培養(yǎng)物。因而，術(shù)語“植物”可以指下述任一種：完整植物、植物組分或器官(包括但不限于胚、花粉、胚珠、種子、葉子、花、枝、果實(shí)、核、谷穗、穗軸、外殼、莖、根、根尖、花藥等)、植物組織、植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可以再生玉米植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物塊和植物種子。植物細(xì)胞是直接取自種子或植物、或通過培養(yǎng)取自植物的細(xì)胞產(chǎn)生的植物的細(xì)胞。谷粒意在指商業(yè)種植者為了生長(zhǎng)或繁殖物種以外的目的而生產(chǎn)的成熟種子。再生的植物的后代、變體和突變體也包括在實(shí)施方案范圍內(nèi)，前提是，這些部分包含導(dǎo)入的多核苷酸。本發(fā)明實(shí)施方案可以用于賦予或增強(qiáng)真菌植物病原體抗性，或保護(hù)植物、尤其玉米(玉蜀黍)免受真菌病原體攻擊。它可以保護(hù)植物的不同部分免受病原體攻擊，包括且不限于莖、谷穗、葉子、根和雄花穗。在實(shí)踐本發(fā)明實(shí)施方案中，其它植物物種也具有重要性，包括且不限于，其它單子葉農(nóng)作物植物。在適當(dāng)時(shí)，可以最優(yōu)化多核苷酸，以在轉(zhuǎn)化的生物中增加表達(dá)。例如，使用提高表達(dá)的植物-優(yōu)選的密碼子，可以合成多核苷酸。關(guān)于宿主-優(yōu)選的密碼子選擇的討論，參見，例如，campbell和gowri(1990)plantphysiol.92：1-11。在本領(lǐng)域可以得到用于合成植物-優(yōu)選的基因的方法。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,380,831和5,436,391，和murray等(1989)nucleicacidres.17：477-498，本文引作參考。本發(fā)明實(shí)施方案可以有效地抗多種植物病原體，尤其真菌病原體，例如，毛盤孢屬，包括cg。本發(fā)明實(shí)施方案也可以有效地抗玉米莖腐爛，包括炭疽病莖腐爛，其中病原體是毛盤孢屬。其它植物病原性真菌和卵菌(后者中的許多在歷史上已經(jīng)被視作真菌，盡管現(xiàn)代分類學(xué)家現(xiàn)在已經(jīng)將它們單獨(dú)分類)包括且不限于，下述的：大豆：大雄疫霉(phytophthoramegasperma)fsp.glycinea、菜豆大殼球孢(macrophominaphaseolina)、茄屬絲核菌(rhizoctoniasolani)、油菜核盤菌(sclerotiniasclerotiorum)、尖孢鐮孢(fusariumoxysporum)、diaporthephaseolorumvar.sojae(大豆擬莖點(diǎn)霉(phomopsissojae))、diaporthephaseolorumvar.caulivora、整齊小核菌(sclerotiumrolfsii)、菊池尾孢(cercosporakikuchii)、大豆尾孢(cercosporasojina)、東北霜霉(peronosporamanshurica)、束狀毛盤孢(colletotichumdematium)(平頭毛盤孢(colletotichumtruncatum))、山扁豆生棒孢(corynesporacassiicola)、大豆殼針孢(septoriaglycine)、大豆生葉點(diǎn)霉(phyllostictasojicola)、互格鏈格孢(alternariaalternata)、擴(kuò)散叉絲殼(microsphaeradiffusa)、半裸鐮孢(fusariumsemitectum)、phialophoragregata、大豆炭疽病霉(glomerellaglycine)、豆薯層銹菌(phakopsorapachyrhizi)、瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum)、終極腐霉(pythiumultimum)、德巴利氏腐霉(pythiumdebaryanum)、茄病鐮孢(fusariumsolani)；低芥酸菜子：蔬菜白銹菌(albugocandida)、甘藍(lán)黑斑病鏈格孢(alternariabrassieae)、leptosphaeriamaculans、茄屬絲核菌、油菜核盤菌、蕓苔生球腔菌(mycosphaerellabrassiccola)、終極腐霉、寄生霜霉(peronosporaparasitica)、玫瑰色鐮孢(fusariumroseum)、互格鏈格孢；苜蓿：終極腐霉、畸雌腐霉(pythiumirregulare)、華麗腐霉(pythiumsplendens)、德巴利氏腐霉、瓜果腐霉、大雄疫霉、車軸草霜霉(peronosporatrifoiorum)、phomamedicaginisvar.medicaginis、苜蓿尾孢(cercosporamedicaginis)、苜蓿假盤菌(pseudopezizamedicaginis)、leptotrochilamedicaginis、尖孢鐮孢、棉黃萎輪枝孢(verticilliumalbo-atrum)、根腐絲囊霉(aphanomyceseuteiches)、stemphyliumherbarum、stemphyliumalfalfae、三葉草毛盤孢(colletotrichumtrifolii)、leptosphaerulinabriosiana、條紋單孢銹菌(uromycesstriatus)、三葉草核盤菌(sclerotiniatrifoliorum)、stagnosporameliloti、葡萄串狀葡柄霉(stemphyliumbotryosum)、leptotrochilamedicaginis；小麥：冰草條黑粉菌(urocystisagropyri)、互格鏈格孢、臘葉棱孢(cladosporiumherbarum)、千谷鐮孢(fusariumgraminearum)、燕麥鐮孢(fusariumavenaceum)、大刀鐮孢(fusariumculmorum)、大麥散黑粉菌(ustilagotritici)、ascochytatritici、禾谷頭孢(cephalosporiumgramineum)、禾生毛盤孢、禾白粉菌(erysiphegraminis)f.sp.tritici、禾柄銹菌(pucciniagraminis)f.sp.tritici、隱匿柄銹菌(pucciniarecondita)f.sp.tritici、條形柄銹菌(pucciniastriiformis)、偃麥草核腔菌(pyrenophoratritici-repentis)、穎枯殼針孢(septorianodorum)、小麥殼針孢(septoriatritici)、septoriaavenae、pseudocercosporellaherpotrichoides、茄屬絲核菌、禾谷絲核菌(rhizoctoniacerealis)、禾頂囊殼(gaeumannomycesgraminis)var.tritici、瓜果腐霉、強(qiáng)雄腐霉(pythiumarrhenomanes)、終極腐霉、麥根腐離蠕孢(bipolarissorokiniana)、紫癜麥角菌(clavicepspurpurea)、小麥網(wǎng)腥黑粉菌(tilletiatritici)、深藍(lán)腥黑粉菌(tilletialaevis)、大麥散黑粉菌、印度腥黑粉菌(tilletiaindica)、茄屬絲核菌、強(qiáng)雄腐霉(pythiumarrhenomannes)、pythiumgramicola、瓜果腐霉；向日葵：plasmophorahalstedii、油菜核盤菌、向日葵殼針孢(septoriahelianthi)、phomopsishelianthi、alternariahelianthi、百日草鏈格孢(alternariazinniae)、灰色葡萄孢(botrvtiscinerea)、phomamacdonaldii、菜豆大殼球孢、二孢白粉菌(erysiphecichoracearum)、米根霉(rhizopusoryzae)、無根根霉(rhizopusarrhizus)、匍枝根霉(rhizopusstolonifer)、向日葵柄銹菌(pucciniahelianthi)、大麗花輪枝孢(verticilliumdahliae)、erwiniacarotovorumpv.carotovora、枝頂頭孢(cephalosporiumacremonium)、隱地疫霉(phytophthoracryptogea)、albugotragopogonis；玉米：串珠鐮孢var.subglutinans、斯獲氏歐文氏桿菌(erwiniastewartii)、串珠鐮孢、玉蜀黍赤霉(gibberellazeae)(禾谷鐮孢)、stenocarpellamaydi(diplodiamaydis)、畸雌腐霉、德巴利氏腐霉、禾生腐霉(pythiumgraminicola)、華麗腐霉、終極腐霉、瓜果腐霉、黃色曲霉(aspergillusflavus)、bipolarismaydiso，t(異紋旋孢霉(cochliobolusheterostrophus))、炭色長(zhǎng)蠕孢(helminthosporiumcarbonum)i，ii&iii(cochlioboluscarbonum)、exserohilumturcicumi，ii&iii、helminthosporiumpedicellatum、玉蜀黍節(jié)壺菌(physodermamavdis)、phyllostictamaydis、kabatiellamaydis、高粱尾孢(cercosporasorghi)、玉蜀黍黑粉菌(ustilagomaydis)、高粱柄銹菌(pucciniasorghi)、多堆柄銹菌(pucciniapolysora)、菜豆大殼球孢、草酸青霉(penicilliumoxalicum)、稻黑孢(nigrosporaoryzae)、臘葉枝孢、新月彎孢(curvularialunata)、不等彎孢(curvulariainaequalis)、蒼白彎孢(curvulariapallescens)、綠色木霉(trichodermaviride)、clavicepssorghi、菊歐文氏桿菌(erwiniachrysanthemi)pv.zea、胡蘿卜歐文氏桿菌(erwiniacarotovora)、大孢色二孢(diplodiamacrospora)、大孢指疫霉(sclerophthoramacrospora)、高粱指霜霉(peronosclerosporasorghi)、菲律賓指霜霉(peronosclerosporaphilippinensis)、peronosclerosporamaydis、peronosclerosporasacchari、高粱軸黑粉菌(sphacelothecareiliana)、physopellazeae、cephalosporiummaydis、枝頂頭孢；高粱：exserohilumturcicum、禾生毛盤孢(glomerellagraminicola)、高粱尾孢、高粱膠尾孢(gloeocercosporasorghi)、高粱生殼二孢(ascochytasorghina)、紫色柄銹菌(pucciniapurpurea)、菜豆大殼球孢、perconiacircinata、串珠鐮孢、互格鏈格孢、高梁生平臍蠕孢(bipolarissorghicola)、helminthosporiumsorghicola、新月彎孢、phomainsidiosa、高粱座枝孢(ramulisporasorghi)、高粱生座枝孢(ramulisporasorghicola)、甘蔗黑痣菌(phyllacharasacchari)、sporisoriumreilianum(高粱軸黑粉菌)、高粱軸黑粉菌(sphacelothecacruenta)、sporisoriumsorghi、clavicepssorghi、茄屬絲核菌、acremoniumstrictum、大孢指疫霉(sclerophthonamacrospora)、高粱指霜霉、菲律賓指霜霉、禾生指根霉(sclerosporagraminicola)、禾谷鐮孢、尖孢鐮孢、強(qiáng)雄腐霉、禾生腐霉等?！胺N質(zhì)”指?jìng)€(gè)體(例如，植物)、一組個(gè)體(例如，植物系、品種或家族)，或從系、品種、物種或培養(yǎng)物衍生的克隆的遺傳材料，或來自它們的遺傳材料。種質(zhì)可以是生物或細(xì)胞的部分，或可以分離自生物或細(xì)胞。一般而言，種質(zhì)提供具有特定分子組成的遺傳材料，后者提供生物或細(xì)胞培養(yǎng)物的一些或全部遺傳品質(zhì)的物理基礎(chǔ)。本文使用的種質(zhì)包括可以生長(zhǎng)成新植物的細(xì)胞、種子或組織，或可以培養(yǎng)成完整植物的植物部分，例如葉子、莖、花粉或細(xì)胞。術(shù)語“等位基因”指在特定基因座中產(chǎn)生的2個(gè)或更多個(gè)不同核苷酸序列之一。第一個(gè)等位基因見于一個(gè)染色體上，而第二個(gè)等位基因存在于那個(gè)染色體的同源物的相同位置處，例如，存在于雜合個(gè)體的不同染色體上，或在群體的不同純合或雜合個(gè)體之間?！坝欣牡任换颉笔琴x予或有助于農(nóng)藝學(xué)需要的表型(例如，對(duì)cg感染的抗性)的特定基因座處的等位基因。有利的標(biāo)記等位基因是與有利表型一起分離的標(biāo)記等位基因。有利的等位基因形式的染色體區(qū)段是，在物理地位于染色體區(qū)段上的一個(gè)或多個(gè)遺傳基因座處包含有助于優(yōu)秀農(nóng)藝學(xué)性能的核苷酸序列的染色體區(qū)段。“等位基因頻率”指群體、或系的群體內(nèi)的等位基因的頻率(比例或百分比)。人們通過平均來自該群體的個(gè)體樣本的等位基因頻率，可以估計(jì)群體內(nèi)的等位基因頻率。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀相連鎖、且等位基因的存在指示著所需的性狀或性狀形式將存在于包含該等位基因的植物中時(shí)，等位基因“陽性地”與性狀相關(guān)聯(lián)。當(dāng)?shù)任换蚺c性狀相連鎖、且等位基因的存在指示著所需的性狀或性狀形式將不存在于包含該等位基因的植物中時(shí)，等位基因“陰性地”與性狀相關(guān)聯(lián)。如果個(gè)體在給定基因座處僅僅具有一種類型的等位基因，則該個(gè)體是“純合的”(例如，二倍體個(gè)體在2個(gè)同源染色體中的每一個(gè)的基因座處具有相同等位基因的一個(gè)拷貝)。如果個(gè)體在給定基因座處存在超過一個(gè)等位基因類型，則該個(gè)體是“雜合的”(例如，具有2個(gè)不同等位基因中的每一個(gè)的一個(gè)拷貝的二倍體個(gè)體)。雜合情形的特殊情況是這樣的，其中一個(gè)染色體具有基因的等位基因，而另一個(gè)染色體完全缺少該基因、基因座或區(qū)域——換而言之，相對(duì)于第一個(gè)染色體具有缺失。該情形稱作“半合子的”。術(shù)語“同質(zhì)性”指，一組中的成員在一個(gè)或多個(gè)特定基因座處基因型。相反地，術(shù)語“異質(zhì)性”用于指，一組中的個(gè)體在一個(gè)或多個(gè)特定基因座處基因型不同。實(shí)施方案不僅提供了用于轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的基因和它的功能變體，而且提供了允許使用標(biāo)記輔助育種來在玉米系之間移動(dòng)rcg1抗性基因的序列和方法。實(shí)施方案也涉及這些方法生產(chǎn)的植物，它們保持包含rcg1抗性基因的截短的染色體區(qū)間。遺傳學(xué)圖是基因組(或基因組的部分，例如單個(gè)染色體)的圖解表示，其中通過界標(biāo)之間的重組頻率，測(cè)量染色體上界標(biāo)之間的距離。使用在本文更詳細(xì)描述的許多分子遺傳標(biāo)記(也稱作分子標(biāo)記)，可以檢測(cè)遺傳界標(biāo)之間的重組。關(guān)于用于檢測(cè)重組的標(biāo)記，它們需要檢測(cè)待監(jiān)控的群體內(nèi)的差異或多態(tài)性。關(guān)于分子標(biāo)記，這意味著由于多核苷酸序列差異（例如ssr、rflps、flps、snp)造成的dna水平的差異?；蚪M變異性可以來自任意來源，例如，插入、缺失、重復(fù)、重復(fù)元件、點(diǎn)突變、重組事件或轉(zhuǎn)座因子的存在和序列。分子標(biāo)記可以源自基因組或表達(dá)的核酸(例如，ests)。ests通常在物種內(nèi)是非常保守的，而dna的其它區(qū)域(通常非編碼)傾向于積累多態(tài)性，且因此，可以在相同物種的個(gè)體之間更可變。大量玉米分子標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的，且是公開的，或可以從各種來源得到，例如maizegdb互聯(lián)網(wǎng)資源和universityofarizona管理的亞利桑那州基因組研究所(arizonagenomicsinstitute)互聯(lián)網(wǎng)資源。分子標(biāo)記可以用于許多植物育種應(yīng)用(例如參見staub等(1996)hortscience31：729-741；tanksley(1983)plantmolecularbiologyreporter.1：3-8)。主要目標(biāo)領(lǐng)域之一是提高使用標(biāo)記輔助選擇(mas)回交和漸滲基因的效率。證實(shí)了與影響所需表型性狀的基因座的連鎖的分子標(biāo)記，提供用于選擇植物群體的性狀的有用工具。當(dāng)表型難以測(cè)定時(shí)，例如許多疾病抗性性狀，或發(fā)生在植物發(fā)育的晚期，例如核特征，這尤其是正確的。由于與田地表型測(cè)定相比，dna標(biāo)記測(cè)定費(fèi)力更少，且需要更小的物理空間，所以可以測(cè)定大的多的群體，從而增加發(fā)現(xiàn)含有轉(zhuǎn)移到受體系的來自供體系的靶區(qū)段的重組體的機(jī)會(huì)。連鎖越緊密，標(biāo)記越有用，因?yàn)橹亟M不太可能發(fā)生在標(biāo)記和造成性狀的基因之間，這可以產(chǎn)生假陽性。具有側(cè)接標(biāo)記減少發(fā)生假陽性選擇的機(jī)會(huì)，因?yàn)閷⑿枰p重組事件。理想的情況是，在基因本身中具有標(biāo)記，從而使得標(biāo)記和基因之間不會(huì)發(fā)生重組。這樣的標(biāo)記稱作‘完美標(biāo)記’。當(dāng)基因被mas漸滲時(shí)，不僅導(dǎo)入了該基因，而且導(dǎo)入了側(cè)接區(qū)(gepts.(2002).cropsci；42：1780-1790)。這稱作“連鎖拖曳”。在供體植物與受體植物高度不相關(guān)的情況下，如在從mp305(外來來源)向原種近交中漸滲rcg1基因座的情況下，這些側(cè)接區(qū)攜帶可以編碼農(nóng)藝學(xué)上不需要的性狀的其它基因。該“連鎖拖曳”也可以導(dǎo)致降低的產(chǎn)量或其它負(fù)面農(nóng)藝學(xué)特征，甚至在回交進(jìn)原種玉米系多個(gè)周期后。這有時(shí)也稱作“產(chǎn)量拖曳”。通過其它回交，可以減少側(cè)接區(qū)的大小，盡管這不會(huì)總成功，因?yàn)橛N者不能控制該區(qū)域的大小或重組斷裂點(diǎn)(young等(1998)genetics120：579-585)。在經(jīng)典的育種中，通常僅僅偶然選擇重組，這有助于減小供體區(qū)段的大小(tanksley等(1989)。biotechnology7：257-264)。甚至在這類回交中20次回交后，人們可以預(yù)期發(fā)現(xiàn)仍然與要選擇的基因連鎖的相當(dāng)大的供體染色體片。但是，使用標(biāo)記可能選擇在目標(biāo)基因附近已經(jīng)經(jīng)歷重組的那些罕見的個(gè)體。在150株回交植物中，至少一株植物將經(jīng)歷1cm基因內(nèi)的交換的機(jī)會(huì)是95％，這基于單減數(shù)分裂圖距。標(biāo)記也允許明確地鑒別那些個(gè)體。利用300株植物的另外一次回交，在基因另一側(cè)的1cm單減數(shù)分裂圖距內(nèi)的交換的機(jī)會(huì)是95％，從而產(chǎn)生在小于2cm的靶基因周圍的區(qū)段，這基于單減數(shù)分裂圖距。這可以在含有標(biāo)記的2代中完成，同時(shí)平均需要沒有標(biāo)記的100代(參見tanksley等，同上)。當(dāng)已知基因的準(zhǔn)確位置時(shí)，可以使用在該基因周圍的一系列側(cè)接標(biāo)記，來選擇不同群體大小的重組。例如，可以預(yù)見更小的群體大小中重組進(jìn)一步遠(yuǎn)離該基因，所以需要更遠(yuǎn)側(cè)的側(cè)接標(biāo)記來檢測(cè)重組。含有增加密度的公開可得玉米標(biāo)記的玉米基因組的綜合連鎖圖的可用性，已經(jīng)促進(jìn)了玉米遺傳作圖和mas。參見，例如ibm2相鄰4圖[在線]，[在2006-03-21檢索]。從因特網(wǎng)檢索：<url：http：//www.maizegdb.org/cgi-bin/displaymaprecord.cgi？id＝871214>執(zhí)行mas的關(guān)鍵組分是：(i)定義其中可以測(cè)定標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)的群體，它可以是分離群體，或隨機(jī)的或結(jié)構(gòu)化的群體；(ii)監(jiān)控多態(tài)標(biāo)記相對(duì)于性狀的分離或結(jié)合，和使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，確定連鎖或關(guān)聯(lián)；(iii)基于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果，定義一組需要的標(biāo)記；和(iv)使用和/或外推該信息到現(xiàn)有的育種種質(zhì)集合，以實(shí)現(xiàn)基于標(biāo)記的選擇決定。在本公開內(nèi)容中所述的3類標(biāo)記可以用于標(biāo)記輔助選擇方案；簡(jiǎn)單序列重復(fù)(ssr，也稱作微衛(wèi)星)標(biāo)記、單核苷酸多態(tài)性(snp)標(biāo)記和片段長(zhǎng)度多態(tài)(flp)標(biāo)記。ssr可以定義為相對(duì)短的長(zhǎng)度為6bp或更小的串聯(lián)重復(fù)dna串(tautz(1989)nucleicacidresearch17：6463-6471；wang等(1994)theoreticalandappliedgenetics，88：1-6)。多態(tài)性產(chǎn)生的原因是重復(fù)單元數(shù)目的變化，可能由dna復(fù)制過程中的滑動(dòng)造成(levinson和gutman(1987)molbiolevol4：203-221)。通過設(shè)計(jì)保守的非重復(fù)側(cè)接區(qū)的pcr引物，可以檢測(cè)重復(fù)長(zhǎng)度的變化(weber和may(1989)amjhumgenet44：388-396)。ssr非常適用于作圖和mas，因?yàn)樗鼈兪嵌嗟任换虻摹⒐诧@性的、可重復(fù)的且順從高通量自動(dòng)化的(rafalski等(1996)generatingandusingdnamarkersinplants。見：non-mammaliangenomicanalysis：apracticalguide.academicpress.pp75-135)。例如，在本文的實(shí)施例5中提供了mp305的ssr標(biāo)記特性(profile)。通過這些標(biāo)記的引物對(duì)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳，產(chǎn)生該標(biāo)記特性。標(biāo)記基因型的評(píng)分是基于擴(kuò)增片段的大小，在該情況下其通過片段的堿基對(duì)權(quán)重來測(cè)量。盡管使用的引物或?qū)嶒?yàn)室操作中的變化會(huì)影響報(bào)道的堿基對(duì)權(quán)重，相對(duì)值將保持恒定，而不管使用的具體引物或?qū)嶒?yàn)室。因而，當(dāng)對(duì)比系時(shí)，對(duì)比的ssr性狀應(yīng)當(dāng)從相同實(shí)驗(yàn)室獲取，以便使用相同的引物和裝置。為此原因，當(dāng)關(guān)于特定標(biāo)記來對(duì)比植物或系時(shí)，優(yōu)選地說明這樣的植物或系在特定基因座處具有相同的(或不同的)等位基因(例如人們可以聲稱，如果植物在umc15a處或下邊不包含mp305衍生的染色體區(qū)間，則它將在實(shí)施例5的表6列出的umc15a處或下邊的所有基因座處不包含與mp305相同的等位基因)。在dnalandmarksinsaint-jean-sur-richelieu，quebec，canada合同(contractual)基礎(chǔ)上，公眾可以得到玉米的ssr服務(wù)?？梢援a(chǎn)生各種類型的flp標(biāo)記。最常見地，使用擴(kuò)增引物來產(chǎn)生片段長(zhǎng)度多態(tài)性。這樣的flp標(biāo)記在許多方面類似于ssr標(biāo)記，例外是，該引物擴(kuò)增的區(qū)域通常不是高度重復(fù)區(qū)域。另外，擴(kuò)增的區(qū)域或擴(kuò)增子在種質(zhì)中將具有足夠的變異性，這經(jīng)常是由于插入或缺失，從而可以在多態(tài)的個(gè)體中區(qū)分?jǐn)U增引物產(chǎn)生的片段，且已知這樣的插入/缺失經(jīng)常發(fā)生在玉米中(bhattramakki等(2002).plantmolbiol48，539-547；rafalski(2002b)，同上)。術(shù)語“插入/缺失”指插入或缺失，其中一個(gè)系可以稱作相對(duì)于第二個(gè)系具有插入，或第二個(gè)系可以稱作相對(duì)于第一個(gè)系具有缺失。本文公開的mza標(biāo)記是已經(jīng)選擇的擴(kuò)增的flp標(biāo)記的實(shí)例，因?yàn)樗鼈兣crcg1基因非常接近。snp標(biāo)記檢測(cè)單堿基對(duì)核苷酸置換。在所有分子標(biāo)記類型中，snp是最豐富的，因而具有提供最高遺傳學(xué)圖分辨率的潛力(bhattramakki等2002plantmolecularbiology48：539-547)?？梢栽谏踔帘萻sr更高水平的通量，以所謂的‘超高通量’方式，測(cè)定snp，因?yàn)樗鼈儾恍枰罅康膁na，且測(cè)定的自動(dòng)化可以是簡(jiǎn)單的。snp也具有相對(duì)低成本系統(tǒng)的前景。這3個(gè)因素一起使得snp在mas中的應(yīng)用非常有吸引力?？梢缘玫綆追Nsnp基因型分析的方法，包括但不限于，雜交、引物延伸、寡核苷酸連接、核酸酶切割、微測(cè)序(minisequencing)和編碼的球。這樣的方法的綜述見：gut(2001)hummutat17pp.475-492；shi(2001)clinchem47，pp.164-172；kwok(2000)pharmacogenomics1，pp.95-100；bhattramakki和rafalski(2001)discoveryandapplicationofsinglenucleotidepolymorphismmarkersinplants。見：r.j.henry.ed，plantgenetyping：thednafingerprintingofplants，cabipublishing，wallingford。許多可商業(yè)得到的技術(shù)使用這些和其它方法來查詢snp，包括masscodetm(qiagen)，(thirdwavetechnologies)，(appliedbiosystems)，(appliedbiosystems)和beadarraystm(illumina)。在序列內(nèi)或跨連接的序列的許多snp一起可以用于描述任意特定基因型的單元型(ching等(2002)，bmcgenet.3：19ppgupta等2001，rafalski(2002b)，同上)。單元型可以比單個(gè)snp更有信息量，且更能描述任意特定基因型。例如，單snp可以是mp305的等位基因‘t’，但是等位基因‘t’也可能發(fā)生在用于回歸親本的玉米育種群體中。在該情況下，單元型，例如在連鎖的snp標(biāo)記處的一系列等位基因，可以更有信息量。一旦已經(jīng)將獨(dú)特的單元型分配給供體染色體區(qū)域，則該單元型可以用于群體或其任意子集中，以確定個(gè)體是否具有特定基因。參見，例如，wo2003054229。使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的自動(dòng)化高通量標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái)，使該過程非常有效率和有效。如本文所述，在表1和2中列出的許多引物可以容易地用作flp標(biāo)記，來選擇rcg1基因座。這些引物也可以用于將相同區(qū)域中的這些標(biāo)記轉(zhuǎn)化成snp或其它結(jié)構(gòu)類似的或功能等同的標(biāo)記(ssrs、caps、插入/缺失等)。snp轉(zhuǎn)變的一種非常多產(chǎn)的方法記載在rafalski(2002a)currentopinioninplantbiology5(2)：94-100和rafalski(2002b)plantscience162：329-333。使用pcr，引物用于擴(kuò)增來自代表目標(biāo)群體的多樣性的個(gè)體(優(yōu)選近交)的dna區(qū)段。直接在一個(gè)或兩個(gè)方向?qū)cr產(chǎn)物測(cè)序。比對(duì)得到的序列，并鑒別多態(tài)性。多態(tài)性不限于單核苷酸多態(tài)性(snp)，也包括插入/缺失、caps、ssr和vntrs(同向重復(fù)序列可變數(shù))。具體地，關(guān)于本文所述的精細(xì)圖信息，人們可以容易地使用本文提供的信息來得到使用本公開內(nèi)容列出的引物擴(kuò)增的區(qū)域內(nèi)的其它多態(tài)snp(和其它標(biāo)記)。在所述圖區(qū)域內(nèi)的標(biāo)記可以與bac或其它基因組文庫雜交，或與基因組序列電子地比對(duì)，以發(fā)現(xiàn)在與所述標(biāo)記相同的近似位置處的新序列。除了上述的ssr’s、flps和snps以外，其它類型的分子標(biāo)記也被廣泛使用，包括但不限于已表達(dá)序列標(biāo)志(ests)和源自est序列的ssr標(biāo)記，和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)dna(rapd)。本文使用的術(shù)語“遺傳標(biāo)記”應(yīng)指任意類型的基于核酸的標(biāo)記，包括但不限于，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)(ssr)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)dna(rapd)、切割的擴(kuò)增的多態(tài)序列(caps)(rafalski和tingey，1993，trendsingenetics9：275-280)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(aflp)(vos等，1995，nucleicacidres.23：4407-4414)、單核苷酸多態(tài)性(snp)(brookes，1999，gene234：177-186)、序列表征的擴(kuò)增的區(qū)域(scar)(paran和michelmore，1993，theor.appl.genet.85：985-993)、標(biāo)志序列位點(diǎn)(sts)(onozaki等，2004，euphytica138：255-262)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)(orita等，1989，procnatlacadsciusa86：2766-2770)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(issr)(blair等，1999，theor.appl.genet.98：780-792)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間擴(kuò)增多態(tài)性(irap)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(remap)(kalendar等，1999，theor.appl.genet.98：704-711)、rna切割產(chǎn)物(例如lynx標(biāo)記)等。更一般地，當(dāng)鑒別連鎖的基因座時(shí)，術(shù)語“分子標(biāo)記”可以用于指上面定義的遺傳標(biāo)記，或用作參照點(diǎn)的其編碼產(chǎn)物(例如，蛋白)。標(biāo)記可以源自基因組核苷酸序列或表達(dá)的核苷酸序列(例加，來自剪接的rna、cdna等)，或來自編碼的多肽。該術(shù)語也指與標(biāo)記序列互補(bǔ)或側(cè)接標(biāo)記序列的核酸序列，例如用作探針或能擴(kuò)增標(biāo)記序列的引物對(duì)的核酸。“分子標(biāo)記探針”是可以用于鑒別標(biāo)記基因座的存在的核酸序列或分子，例如，與標(biāo)記基因座序列互補(bǔ)的核酸探針?；蛘?，在有些方面，標(biāo)記探針指任意類型的能區(qū)分在標(biāo)記基因座中存在的特定等位基因(即，基因型分析)的探針。當(dāng)它們?cè)谌芤褐刑禺愋缘仉s交時(shí)，例如，根據(jù)watson-crick堿基配對(duì)規(guī)則，核酸是“互補(bǔ)的”。當(dāng)位于插入/缺失區(qū)域(例如本文所述的非同線性區(qū)域)上時(shí)，本文所述的有些標(biāo)記也稱作雜交標(biāo)記。這是因?yàn)椋鳛槎x，關(guān)于沒有該插入的植物，插入?yún)^(qū)域是多態(tài)現(xiàn)象。因而，標(biāo)記只需要指明是否存在插入/缺失區(qū)域?？梢允褂萌我夂线m的標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)來鑒別這樣的雜交標(biāo)記，例如snp技術(shù)被用于本文提供的實(shí)施例中?！盎蚪M核酸”是其序列與細(xì)胞中的可遺傳核酸相對(duì)應(yīng)的核酸。常見實(shí)例包括核基因組dna和其擴(kuò)增子。在有些情況下，基因組核酸不同于剪接的rna或?qū)?yīng)的cdna，因?yàn)榧艚拥膔na或cdna通過例如剪接機(jī)制來加工，以去除內(nèi)含子?；蚪M核酸任選地包含不轉(zhuǎn)錄的(例如，染色體結(jié)構(gòu)序列、啟動(dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)等)和/或非翻譯的序列(例如，內(nèi)含子)，而剪接的rna/cdna通常不具有不轉(zhuǎn)錄的序列或內(nèi)含子?！澳０搴怂帷笔窃跀U(kuò)增反應(yīng)(例如，基于聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)例如pcr，連接酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)例如lcr、轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等)中用作模板的核酸。模板核酸可以是基因組起源的，或者，可以源自表達(dá)的序列，例如，cdna或est。在核酸擴(kuò)增的上下文中，術(shù)語“擴(kuò)增”是生成選定核酸(或其轉(zhuǎn)錄形式)的其它拷貝的任意方法。一般的擴(kuò)增方法包括各種基于聚合酶的復(fù)制方法，包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、連接酶介導(dǎo)的方法例如連接酶鏈反應(yīng)(lcr)和基于rna聚合酶的擴(kuò)增(例如，通過轉(zhuǎn)錄)方法?！皵U(kuò)增子”是擴(kuò)增的核酸，例如，通過任意可得到的擴(kuò)增方法(例如，pcr、lcr、轉(zhuǎn)錄等)，通過擴(kuò)增模板核酸，生成的核酸。在有些情況下，同工酶特性和關(guān)聯(lián)的形態(tài)學(xué)特征也直接用作標(biāo)記。盡管它們它們不直接檢測(cè)dna差異，但它們經(jīng)常受到特定遺傳差異的影響。但是，檢測(cè)dna變異的標(biāo)記比同工酶或形態(tài)學(xué)標(biāo)記更多且更多態(tài)(tanksley(1983)plantmolecularbiologyreporter1：3-8)。序列比對(duì)或毗連群也可以用于發(fā)現(xiàn)在本文列出的特定標(biāo)記上游或下游的序列。鄰近本文所述標(biāo)記的這些新序列然后可以用于發(fā)現(xiàn)和開發(fā)功能等同的標(biāo)記。例如，比對(duì)不同的物理和/或遺傳學(xué)圖，以定位在本說明書中沒有描述、但是在類似區(qū)域中的等價(jià)標(biāo)記。這些圖可以是在玉米物種內(nèi)，或甚至在已經(jīng)遺傳地或物理地與玉米比對(duì)的其它物種之間，例如稻、小麥、大麥或高粱。如實(shí)施例2所指出的，通過使用來自側(cè)接rcg1基因座的區(qū)域的共同序列(其與mo17和b73bac文庫中的bac雜交)，以蓋瓦方式將來自兩個(gè)文庫的bac與來自側(cè)接rcg1基因座的de811asr(bc5)同源區(qū)的bac排列，如圖9(a)所示。公開的b73bac，c0113f01和c0117e18被鑒別為分別在rcg1基因座的正北和正南。利用該信息，通過比對(duì)該區(qū)域內(nèi)的遺傳標(biāo)記和b73bac的物理圖，可以生成遺傳標(biāo)記umc2285和umc15a之間、umc2285和umc2187之間、umc1086和umc2200之間、或umc2041和umc2200之間的延長(zhǎng)的非鄰接的蓋瓦方式的b73bac。從環(huán)球網(wǎng)上，通過前綴為“www.”的網(wǎng)址genome.arizona.edu/fbc/maize/#webagcol進(jìn)入，可以從亞利桑那州基因組研究所的玉米基因組數(shù)據(jù)庫獲取b73的遺傳學(xué)圖和物理圖的比對(duì)信息。在webchrom的角度，人們可以選擇在rcg1基因附近的遺傳標(biāo)記，并獲取與這些遺傳標(biāo)記所處的物理毗連群的連鎖。通過以這樣的方式比對(duì)物理圖和遺傳學(xué)圖，人們可以發(fā)現(xiàn)遺傳標(biāo)記umc2285和umc15a、umc2285和umc2187、umc1086和umc2200或umc2041和umc2200定義的染色體區(qū)間之間的區(qū)域中過剩的b73bac。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用bac來開發(fā)用于將rcg1基因座漸滲進(jìn)玉米種質(zhì)中的新標(biāo)記。具體地，這樣的遺傳標(biāo)記可以用于追蹤其中已經(jīng)漸滲進(jìn)rcg1基因座或rcg1基因的任意系中的rcg1基因座，并用于在回交程序中選擇回歸親本基因組。例如，為了設(shè)計(jì)可以用于在其它玉米種質(zhì)中漸滲和選擇rcg1基因或基因座的多態(tài)標(biāo)記，可以使用在rcg1基因座周圍區(qū)域的序列信息。存在許多在目標(biāo)區(qū)域可獲得的b73衍生的細(xì)菌人工染色體(bac)，從它們可以得到序列信息。在圖21中顯示了目標(biāo)區(qū)域中的bacs的實(shí)例，該圖顯示了b73物理圖上與de811asr(bc5)中的rcg1區(qū)域同源的毗連群[圖212006-03-10檢察]。從因特網(wǎng)檢察：<url：http：//www.genome.arizona.edu/cgi-bin//webagcol/webfpc/webfpc_direct_v2.1.cgi？name＝maize&contig＝187&marker＝ssu1>。序列信息通過已經(jīng)可以公開得到的信息(例如bac末端-序列、與該區(qū)域中的bacs雜交的已表達(dá)序列標(biāo)志(ests)的序列、經(jīng)常與這些ests相關(guān)的重疊寡核苷酸探針等)來獲取，或通過在該區(qū)域直接測(cè)序bac克隆得到新序列來獲取。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的幾種不同方法，從該序列中人們可以確定哪個(gè)區(qū)域是最獨(dú)特的。例如，通過使用基因預(yù)測(cè)軟件或通過針對(duì)所有可得到的玉米序列blasting該序列，人們可以選擇非重復(fù)的序列。低拷貝序列可以用于開發(fā)許多基于核酸的標(biāo)記。這些標(biāo)記用于篩選其中存在rcg1基因座的植物材料和其中不存在rcg1基因座的植物材料。如果需要在rcg1基因座之外的標(biāo)記，則使用該標(biāo)記來篩選其中存在rcg1基因座的植物材料和其中不存在rcg1基因座的植物材料，以確定該標(biāo)記在這樣的種質(zhì)中是否是多態(tài)的。多態(tài)標(biāo)記然后在其它玉米種質(zhì)中用于標(biāo)記輔助的rcg1區(qū)域的漸滲和選擇，且最佳地也用于回歸親本基因組選擇。因而，利用鑒別出的rcg1基因座的定位和確立的它與對(duì)毛盤孢屬抗性的關(guān)聯(lián)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用任意數(shù)目的現(xiàn)有標(biāo)記，或容易地開發(fā)新標(biāo)記，它們可以用于漸滲或鑒別種質(zhì)中rcg1基因座的存在與否，和在回交程序中選擇回歸親本基因組。在遺傳學(xué)圖上，將一個(gè)分子標(biāo)記與基因或另一個(gè)分子標(biāo)記的連鎖測(cè)量為重組頻率。一般而言，遺傳學(xué)圖上的2個(gè)基因座(例如，2個(gè)ssr標(biāo)記)越近，它們?cè)谖锢韴D上彼此的位置越近。相對(duì)的遺傳距離(通過交換頻率確定，以厘摩為單位測(cè)量；cm)可以與染色體上2個(gè)相連鎖的基因座彼此隔開的物理距離(以堿基對(duì)為單位測(cè)量，例如，千堿基對(duì)[kb]或兆堿基對(duì)[mbp])成比例。cm和物理距離之間的精確比例的缺少，可以源自不同染色體區(qū)域重組頻率的變異，例如，有些染色體區(qū)域是重組“熱點(diǎn)”，而其它區(qū)域不表現(xiàn)出任何重組，或僅僅表現(xiàn)出罕見的重組事件。有些漸滲數(shù)據(jù)和作圖信息提示，rcg1基因座周圍的區(qū)域是確實(shí)具有大量重組的區(qū)域。一般而言，一個(gè)標(biāo)記與另一個(gè)標(biāo)記越近，無論按照重組還是物理距離測(cè)量，它們的連鎖也越強(qiáng)。分子標(biāo)記與賦予特定表型(疾病抗性)的多肽的編碼基因越近，無論按照重組還是物理距離測(cè)量，該標(biāo)記就越好地用于標(biāo)記所需表型性狀。如果可行，最好的標(biāo)記是在基因本身中的標(biāo)記，因?yàn)樗偸潜３峙c造成所需表型的基因的連鎖。也可以在相同農(nóng)作物物種(包括玉米)的不同群體之間，觀察到遺傳作圖變異性。盡管遺傳學(xué)圖中的該變異性可能發(fā)生在群體之間，但源自一個(gè)群體的遺傳學(xué)圖和標(biāo)記信息通常仍可以用于跨多個(gè)群體的具有所需性狀的植物的鑒別中、具有不希望的性狀的植物的反選擇中和指導(dǎo)mas。為了定位跨遺傳學(xué)圖的等價(jià)標(biāo)記，可以使用作圖群體來證實(shí)任意這樣的等價(jià)標(biāo)記是否在本文所述區(qū)域內(nèi)，并從而用于選擇rcg1。使用該方法，在這樣的作圖群體上繪制等價(jià)標(biāo)記、以及本文列出的標(biāo)記。落入相同區(qū)域內(nèi)的任意等價(jià)標(biāo)記可以用于選擇rcg1。本領(lǐng)域已知的且可以用于該目的的作圖群體包括、但不限于，在sharopova，n.等(2002)plantmolbiol48(5)：463-481和lee，m.等(1999)：toolsforhighresolutiongeneticmappinginmaize-statusreport.proc.plantanimalgenomevii，january17-21，1999，sandiego，usa，p.146中描述的ibm群體和t218xgt119if2群體；在davis，g.l.等(1999)genetics152(3)：1137-72和davis，m.d.等，(1998)the1998umcmaizegeneticmap：ests，sequencedcoremarkers，andnonmaizeprobesasafoundationforgenediscovery，maizegeneticsconferenceabstracts40中描述的umc98群體。本文使用的“漸滲現(xiàn)象”或“漸滲”指，通過下述方式，使基因或基因座從一個(gè)系移動(dòng)到另一個(gè)系：(1)使每個(gè)系的個(gè)體雜交，以生成群體；和(2)選擇攜帶所需基因或基因座的個(gè)體。每次雜交后，重復(fù)選擇過程。例如，實(shí)施方案的基因、或含有該基因的基因座，可以漸滲進(jìn)非抗性的或僅僅部分抗性(這意味著它對(duì)cg敏感或易感，或?qū)g部分地敏感或易感)的回歸親本中。含有漸滲的基因或基因座的回歸親本系然后具有增強(qiáng)的或新賦予的對(duì)cg的抗性。其中已經(jīng)漸滲進(jìn)rcg1基因座的系在本文中稱作rcg1基因座轉(zhuǎn)變。當(dāng)該過程重復(fù)2次或更多次時(shí)，漸滲的過程經(jīng)常稱作“回交”。在漸滲或回交中，“供體”親本指含有待漸滲的所需基因或基因座的親本植物?！笆荏w”親本(使用一次或多次)或“回歸”親本(使用2次或更多次)指向其中漸滲基因或基因座的親本植物。例如，參見ragot，m.等(1995)marker-assistedbackcrossing：apracticalexample，intechniquesetutilisationsdesmarqueursmoleculaires(lescolloques，vol.72，pp.45-56和openshaw等，(1994)marker-assistedselectioninbackcrossbreeding，analysisofmolecularmarkerdata，pp.41-43。初步雜交產(chǎn)生f1代；術(shù)語“bc1”則指回歸親本的第二次使用，“bc2”指回歸親本的第三次使用，依此類推。在rcg1的情況下，其中可以得到該基因和非常接近區(qū)域的序列，可以開發(fā)基于該基因本身或緊密連鎖序列的dna標(biāo)記，以用于在回歸親本背景下直接選擇供體基因。盡管可以使用來自攜帶該基因的染色體區(qū)域的任意多態(tài)dna序列，但在實(shí)施方案中提供的序列允許使用在該基因內(nèi)或附近的dna標(biāo)記，從而使基因的假陽性選擇最小化。側(cè)接標(biāo)記限制導(dǎo)入受體背景中的供體基因組片段的大小，從而使所謂的“連鎖拖曳”最小化，這意味著從供體系導(dǎo)入不需要的序列，所述序列影響另外原種種質(zhì)的植物性能。實(shí)施方案提供了可以如此使用的dna標(biāo)記的多個(gè)實(shí)例，且本領(lǐng)域技術(shù)人員能使用提供的基因組序列來生成甚至更多的標(biāo)記。一個(gè)實(shí)例是使用特異性地(排它地)與和基因座緊密連鎖(包括在基因座內(nèi))的序列雜交(在rflp測(cè)定的情況下)或退火(在pcr測(cè)定的情況下)的標(biāo)記。原則上，如果組合使用幾個(gè)這樣的標(biāo)記，則可以使用還在基因組的其它地方雜交或退火的序列。當(dāng)使用pcr反應(yīng)時(shí)，實(shí)踐中在擴(kuò)增反應(yīng)中使用的引物的長(zhǎng)度應(yīng)當(dāng)是至少約15個(gè)核苷酸，但是根據(jù)序列和雜交條件，可以使用提供特異性退火的任意長(zhǎng)度，例如約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28或更長(zhǎng)。對(duì)于pcr反應(yīng)，術(shù)語“退火”常規(guī)地使用，且如本文使用的，它應(yīng)當(dāng)理解為具有與“雜交”相同的含義。因而，通過使用本文所述的標(biāo)記和方法，人們可以生產(chǎn)包含截短的染色體區(qū)間的植物，所述截短的染色體區(qū)間包含rcg1基因座和/或rcg1基因。術(shù)語“染色體區(qū)間”或“染色體區(qū)段”指在植物中(inplanta)存在于單個(gè)染色體上的基因組dna的鄰接線性區(qū)間，通常參照定義染色體區(qū)間的末端的2個(gè)標(biāo)記來定義。指定的區(qū)間可以包括在末端的標(biāo)記(例如一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記在標(biāo)記a和標(biāo)記b定義的染色體區(qū)間上或內(nèi)部)，或可以不包括在區(qū)間末端的標(biāo)記(例如一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記在標(biāo)記a和標(biāo)記b定義的染色體區(qū)間內(nèi)部)。截短的染色體區(qū)間指，通過選擇一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)減小染色體區(qū)間大小的重組事件，而已經(jīng)被減小尺寸的染色體區(qū)間。“重組事件”指同源染色體之間發(fā)生的重組，且也指其中已經(jīng)發(fā)生重組的特定的染色體定位(例如在染色體末端內(nèi)側(cè)的染色體區(qū)間的重組，將在染色體區(qū)間的每個(gè)末端具有重組事件)。參照在區(qū)段末端點(diǎn)的一個(gè)或2個(gè)新標(biāo)記，可以定義截短的染色體區(qū)間。通過厘摩或堿基對(duì)，可以測(cè)量2個(gè)染色體區(qū)段的長(zhǎng)度。位于單個(gè)染色體區(qū)間上的遺傳元件或基因是物理地連鎖的。染色體區(qū)間的大小沒有特殊限制，但是在本發(fā)明實(shí)施方案的上下文中，位于單個(gè)染色體區(qū)間內(nèi)的遺傳元件通常也是遺傳上連鎖的。使用實(shí)施方案的方法，可能選擇包含截短的染色體區(qū)間的植物，所述截短的染色體區(qū)間包含rcg1基因。具體地，參照下面實(shí)施例中更詳細(xì)描述的本發(fā)明，染色體區(qū)間可以減小至12cm或更小、10cm或更小、8cm或更小、6cm或更小、4cm或更小、3cm或更小、2.5cm或更小、2cm或更小、1.5cm或更小、1cm或更小、0.75cm或更小、0.50cm或更小或0.25cm或更小的長(zhǎng)度，在每種情況下，參照從2006年3月21目生效的ibm2相鄰4遺傳學(xué)圖所示的圖距進(jìn)行測(cè)量。如按照堿基對(duì)測(cè)得的，染色體區(qū)間可以減小至15mbp或更小、10mbp或更小、5mbp或更小、3mbp或更小、1mpb或更小、500kbp或更小或250kbp或更小的長(zhǎng)度。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，不希望造成非常近側(cè)rcg1編碼序列的染色體區(qū)域的斷裂（例如在5kpb內(nèi)或更小、在4kbp內(nèi)或更小、3kbp或更小、2kbp或更小、1kbp或更小或0.5kbp或更小)，從而使得啟動(dòng)子和其它上游調(diào)節(jié)元件與編碼序列不連鎖。術(shù)語“基因座”通常指，攜帶基因(或可行時(shí)，2個(gè)或更多個(gè)在遺傳上非常緊密連鎖的基因，它們作為負(fù)責(zé)表型的單個(gè)基因座起作用)的染色體的遺傳上確定的區(qū)域。當(dāng)在本文中提及rcg1使用時(shí)，“rcg1基因座”應(yīng)指染色體的確定區(qū)域，它攜帶rcg1基因，包括它的相關(guān)調(diào)節(jié)序列，以及與b73非同線性的rcg1基因周圍的區(qū)域，或其保留rcg1基因和相關(guān)調(diào)節(jié)序列的任意更小的部分。該基因座還在別處稱作asr基因座，且在這里將稱作rcg1基因座?！盎颉敝富蜃鶅?nèi)的特定遺傳編碼區(qū)，包括它的相關(guān)調(diào)節(jié)序列。編碼rcg1初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的區(qū)域在本文中稱作“rcg1編碼序列”，將用于定義rcg1基因的位置，且本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，相關(guān)的調(diào)節(jié)序列將在離rcg1編碼序列約4kb的距離內(nèi)，啟動(dòng)子位于它上游。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是，分離rcg1基因，并證實(shí)它是負(fù)責(zé)由基因座的存在而賦予的表型的基因。本文使用的“連鎖的”或“連鎖”(與術(shù)語“可操作地連接”相區(qū)分)指基因座或基因的遺傳的或物理的連鎖。如果在單個(gè)減數(shù)分裂圖上測(cè)得，它們之間的重組頻率小于約50％，則認(rèn)為基因座或基因是遺傳連鎖的。如果在單個(gè)減數(shù)分裂圖上測(cè)得，重組頻率是約40％、約30％、約20％、約10％或更小，則它們是逐漸更大連鎖的。如果已經(jīng)證實(shí)它們是在單個(gè)dna片段(例如染色體)上，則2個(gè)或更多個(gè)基因是物理連鎖的(或同染色體上的)。遺傳連鎖的基因在實(shí)踐中是物理連鎖的(或同染色體上的)，但是尚未證實(shí)確切的物理距離(核苷酸數(shù)目)。本文使用的術(shù)語“緊密連鎖的”指遺傳連鎖的標(biāo)記在15cm或更小內(nèi)，包括但不限于12cm或更小、10cm或更小、8cm或更小、7cm或更小、6cm或更小、5cm或更小、4cm或更小、3cm或更小、2cm或更小、1cm或更小和.5cm或更小，如在本公開內(nèi)容前面提及的maizegdb網(wǎng)站上可公開得到的ibm2相鄰4遺傳學(xué)圖上所測(cè)得的。dna序列，例如代表在基因座內(nèi)的序列或與其互補(bǔ)的序列的短寡核苷酸，也與該基因座連鎖?！跋怠被颉捌废怠笔且唤M相同家系的個(gè)體，它們通常是一定程度的近交，且通常在大多數(shù)基因座處是純合的和同質(zhì)的。“祖系”或“祖先”是用作基因來源的親本系，例如，用于開發(fā)原種系?！昂蟠笔亲嫦档暮笠?，且可以通過許多代育種與它們的祖先分離。例如，許多原種系是b73或mo17的后代?！跋底V結(jié)構(gòu)”定義了后裔和產(chǎn)生該后裔的每個(gè)祖先之間的關(guān)系。系譜結(jié)構(gòu)可以跨一代或多代，描述后裔和它的親本、祖親本、曾祖親本等之間的關(guān)系?！霸N系”或“原種品種”是已經(jīng)從為優(yōu)秀的農(nóng)藝學(xué)性能而進(jìn)行的許多育種和選擇循環(huán)中產(chǎn)生的農(nóng)藝學(xué)上優(yōu)秀的系或品種?！霸N近交系”是作為近交的原種系，且已經(jīng)表明可以用于生產(chǎn)足夠高產(chǎn)的、且農(nóng)藝學(xué)上適宜的雜種品種(“原種雜種品種”)?？梢缘玫皆S多原種系和品種，且是玉米育種領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。類似地，“原種種質(zhì)”是農(nóng)藝學(xué)上優(yōu)秀的種質(zhì)，其通常源自和/或能產(chǎn)生具有優(yōu)秀的農(nóng)藝學(xué)性能的植物，例如現(xiàn)有的或新開發(fā)的玉米原種系。相反地，“外來玉米系”或“外來玉米種質(zhì)”是源自不屬于可得到的原種系、原種品種或原種種質(zhì)的玉米的種質(zhì)。在2個(gè)玉米植物之間雜交的上下文中，外來系或外來種質(zhì)在血統(tǒng)上不與它雜交的原種系、原種品種或原種種質(zhì)緊密相關(guān)。最常見地，選擇外來系或外來種質(zhì)來將新遺傳元件(通常新等位基因)導(dǎo)入育種程序。單位、前綴和符號(hào)可以以它們的si接受的形式注解。除非另有說明，核酸以5′至3′方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基方向從左向右書寫。數(shù)字范圍包含定義該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文中可以用它們普遍已知的三字母符號(hào)或iupac-iub生化命名委員會(huì)(biochemicalnomenclaturecommission)推薦的單字母符號(hào)來表示。類似地，核苷酸可以用它們普通接受的單字母代碼來表示。上面定義的術(shù)語參照說明書整體更完全地定義。關(guān)于本文指出的圖方向，代替術(shù)語5’和3’，使用術(shù)語“北邊”和“上邊”(例如，在rcg1基因北邊的標(biāo)記指，參照以垂直方向提供的圖，例如圖7和8，確定的在rcg1基因上邊的標(biāo)記，和參照以水平方向提供的圖，例如圖22，確定的在rcg1基因左邊的標(biāo)記)。類似地，使用術(shù)語“南邊”和“下邊”(例如，在rcg1基因南邊的標(biāo)記指，參照本文提供的垂直方向的圖確定的在rcg1基因下邊的標(biāo)記，和參照本文提供的水平方向的圖確定的在rcg1基因右邊的標(biāo)記)。更具體地，在rcg1編碼序列上邊指，在seqidno：1的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物上邊或北邊的染色體(大致在flp110f)，且在rcg1編碼序列下邊指，在seqidno：1的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物下邊或南邊的染色體(大致在flpa1r)。參見圖26。術(shù)語“近側(cè)”和“遠(yuǎn)側(cè)”是相對(duì)術(shù)語，當(dāng)用于相對(duì)于指定位置對(duì)比圖上的2個(gè)點(diǎn)時(shí)，分別指離指定位置(例如，rcg1基因)更近和更遠(yuǎn)。術(shù)語“計(jì)算機(jī)系統(tǒng)”泛指用于執(zhí)行有些或全部本文所述方法步驟的各種自動(dòng)化的系統(tǒng)。術(shù)語“指令”指，指示計(jì)算機(jī)系統(tǒng)執(zhí)行有些或全部方法步驟的計(jì)算機(jī)代碼。除了實(shí)施有些或全部方法步驟外，數(shù)字或模擬系統(tǒng)(例如，包含數(shù)字或模擬計(jì)算機(jī))也可以控制許多其它功能，例如用戶可視顯示器(例如，以允許用戶觀察方法結(jié)果)和/或輸出控制部件(例如，以輔助標(biāo)記輔助選擇或控制自動(dòng)化野外裝備)。本文所述的某些方法可以任選地(且一般地)通過一種或多種計(jì)算機(jī)程序(例如，儲(chǔ)存并可以用于分析分子標(biāo)記數(shù)據(jù))來實(shí)現(xiàn)。因而，實(shí)施方案提供了數(shù)字系統(tǒng)，例如，計(jì)算機(jī)、計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)和/或包含用于執(zhí)行本文方法的指令(例如，包含在適當(dāng)軟件中)的集成系統(tǒng)。數(shù)字系統(tǒng)將包括與對(duì)于一組遺傳標(biāo)記的植物基因型和任選的表型值和/或家族關(guān)系相對(duì)應(yīng)的信息(數(shù)據(jù))。系統(tǒng)也可以輔助用戶根據(jù)本文方法進(jìn)行rcg1的標(biāo)記輔助選擇，或可以控制野外裝備，該裝備可以自動(dòng)化選擇、收獲和/或育種方案。通過輸入裝載在數(shù)字系統(tǒng)存儲(chǔ)器中的數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行本文指出的操作，可以使標(biāo)準(zhǔn)的桌面應(yīng)用程序例如字處理軟件(例如，microsoftwordtm或corelwordperfecttm)和/或數(shù)據(jù)庫軟件(例如，電子制表軟件例如microsoftexceltm、corelquattroprotm或數(shù)據(jù)庫程序例如microsoftaccesstm或paradoxtm)適用于實(shí)施方案。例如，系統(tǒng)可以包含與用戶界面聯(lián)合使用的具有適當(dāng)?shù)幕蛐蛿?shù)據(jù)和任選的系譜數(shù)據(jù)的前述軟件(例如，在標(biāo)準(zhǔn)操作系統(tǒng)例如windows、macintosh或linux系統(tǒng)中的gui)，以進(jìn)行本文指出的任意分析，或簡(jiǎn)單地獲取要在本文方法中使用的數(shù)據(jù)(例如，在電子制表軟件中)。計(jì)算機(jī)可以是，例如，pc(intelx86或奔騰芯片兼容的dos，tmos2，tmwindows，tmwindowsnt，tmwindows95，tmwindows98，tmlinux，apple-兼容的，macintoshtm兼容的，powerpc兼容的，或unix兼容的(例如，suntm工作站)機(jī)器)或技術(shù)人員已知的其它商業(yè)上常見的計(jì)算機(jī)。根據(jù)本文方法，技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)的編程語言，例如visualbasic、fortran、basic、java等，可以構(gòu)建用于進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和/或表型值預(yù)測(cè)的軟件。任意系統(tǒng)控制器或計(jì)算機(jī)任選地包含監(jiān)視器，后者可以包括，例如，陰極射線管(“crt”)顯示器、平板顯示器(例如，有源矩陣液晶顯示器、液晶顯示器)等。計(jì)算機(jī)線路通常置于盒子中，該盒子包含許多集成電路芯片，例如微處理器、存儲(chǔ)器、接口電路等。該盒子也任選地包含硬盤驅(qū)動(dòng)器，軟盤驅(qū)動(dòng)器，高容量可移動(dòng)驅(qū)動(dòng)器，例如可寫入cd-rom和其它常見外圍設(shè)備。相關(guān)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中的輸入裝置(例如鍵盤或鼠標(biāo))任選地提供用戶輸入和用戶選擇遺傳標(biāo)記基因型、表型值等。計(jì)算機(jī)通常包含用于接收用戶指令的適當(dāng)軟件，無論是以用戶輸入一組參數(shù)字段的形式(例如，在gui中)，還是以預(yù)編程的指令形式(例如，為許多不同的特殊操作預(yù)編程)。軟件然后將這些指令轉(zhuǎn)換成適當(dāng)語言，以指導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行任意需要的操作。例如，數(shù)字系統(tǒng)可以根據(jù)本文的相關(guān)方法，指導(dǎo)選擇包含某些標(biāo)記的植物，或控制野外裝備收割、選擇、雜交或儲(chǔ)藏農(nóng)作物。本發(fā)明也可以在應(yīng)用特異性的集成電路(asic)或可編程邏輯裝置(pld)的線路內(nèi)實(shí)現(xiàn)。在這樣的情況下，本發(fā)明可以用用于生成asic或pld的計(jì)算機(jī)可讀的描述符語言實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明也可以在許多其它數(shù)字設(shè)備(例如pdas、膝上型計(jì)算機(jī)系統(tǒng)、顯示器、圖像編輯裝置等)的線路或邏輯處理器內(nèi)實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步定義了本發(fā)明實(shí)施方案，除非另有說明，其中所有份數(shù)和百分比都是按重量計(jì)，且度數(shù)是攝氏度。應(yīng)當(dāng)理解，在指示本發(fā)明實(shí)施方案時(shí)，這些實(shí)施例僅僅作為解釋而提供。從上面的討論和這些實(shí)施例中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明實(shí)施方案的基本特征，且可以在不脫離其精神和范圍的情況下，作出各種變化和修改，以使它適應(yīng)各種用途和條件。因而，除了本文表明和描述的那些以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員從前面描述可以明白本發(fā)明實(shí)施方案的各種修改。這樣的修改也在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本文所述每篇文獻(xiàn)的公開內(nèi)容，整體引作參考。實(shí)施例1-4和7-12是實(shí)際的。實(shí)施例5、6和13是部分實(shí)際、部分預(yù)測(cè)的。實(shí)施例14l特定區(qū)域的rcg1基因座的精細(xì)作圖為了繪制和克隆負(fù)責(zé)玉米系mp305對(duì)cg的抗性的基因，以前已經(jīng)生成了系，它們彼此在遺傳上的差異盡可能地少，例外是，存在負(fù)責(zé)抗性表型的基因座。這樣的系稱作近等基因系。為此目的，已經(jīng)將de811與mp305雜交，且已經(jīng)將后代與敏感系de811回交3次，在每次回交時(shí)，選擇對(duì)cg的抗性和另外de811特征(weldekidan和hawk，(1993)，maydica，38：189-192)。得到的系命名為de811asr(bc3)(weldekidan和hawk，(1993)同上)。該系用作rcg1基因座的精細(xì)作圖的起點(diǎn)。首先必須大致知道它在玉米基因組中位于何處。使用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳方法，jung等((1994)同上)以前已經(jīng)定位了染色體4長(zhǎng)臂上的基因座。因?yàn)橐郧耙呀?jīng)將rcg1基因座作圖在玉米染色體4的長(zhǎng)臂上，所以使用上面jung等(1994)得到的基因座附近的標(biāo)記上的信息，分析位于命名為4.06-4.08的染色體區(qū)域中的所有可得到的公開可得的和私有的簡(jiǎn)單序列重復(fù)(ssr)標(biāo)記，以確定這些標(biāo)記是否在2個(gè)近等基因系de811和de811asr(bc5)之間是多態(tài)的。如下從上面weldekidan和hawk(1993)所述的de811asr(bc3)系衍生出de811asr(bc5)系：通過在選擇對(duì)cg的抗性下與de811的2次回交，然后自交5代和選擇，以得到bc5系。使bc5系與de811另外回交2次，以生成用于精細(xì)作圖的bc7分離群體。為了能夠在家族基礎(chǔ)上進(jìn)行表型評(píng)價(jià)，使bc7個(gè)體自交，以生成bc7s1家族。從該分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)ssr標(biāo)記phi093和umc2041是多態(tài)的。使用可公開得到的相互交配(inter-mated)(coe等(2002)plantphysiol.128：9-12；gardiner，等，(2004)，plantphysiol.，134：1317-1326；yim等，(2002)plantphysiol.130：1686-1696)b73xmo17(ibm)neighborsmap(lee等(2002)plantmolbiol48：453-61；sharopova等，(2002)plantmolbiol48：463-81)，使用3個(gè)附近的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)標(biāo)記cdo365、csu166和cdo127的序列，來生成片段長(zhǎng)度多態(tài)標(biāo)記(下文命名為flps)。flps是在使用確定序列的引物的pcr反應(yīng)之后，使用凝膠電泳或任意類似的高分辨率片段分離方法可以測(cè)定的標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)所有3個(gè)標(biāo)記都是多態(tài)的。在表1中總結(jié)了繪制rcg1基因座圖所使用的flps。在表1中所示的mzaflps的任意引物(它們也具有表2所示的相同mza標(biāo)記名稱)，將擴(kuò)增在表2所示內(nèi)部序列內(nèi)部的flp的區(qū)域。表1列出的所有引物的退火溫度是60℃。為了確定這3個(gè)多態(tài)flps和2個(gè)多態(tài)ssr的存在是否與抗性表型相關(guān)聯(lián)，從而指示攜帶rcg1基因座的區(qū)域位于含有這3個(gè)標(biāo)記的染色體區(qū)段上，生成一個(gè)表，其中通過野外觀察確定4784個(gè)體的表型狀態(tài)，并輸入通過片段大小分析測(cè)得的相對(duì)于5個(gè)標(biāo)記中的每一個(gè)的基因型狀態(tài)。該數(shù)據(jù)依次呈遞給軟件程序joinmap(vanooijen，等，(2001)，plantresearchinternational，wageningen，thcnetherlands)和windowsqtlcartographer(wang，等，(2004)，(在線，2.0版在2004-06-14檢索，2.5版在2005-02-22檢索)；在因特網(wǎng)上從北卡羅來納州立大學(xué)統(tǒng)計(jì)遺傳學(xué)和生物信息學(xué)(northcarolinastateuniversitystatisticalgeneticsandbioinformatics)網(wǎng)站檢索<url：http：//statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm>。前一個(gè)程序測(cè)定沿著染色體區(qū)域的標(biāo)記次序。后者測(cè)定標(biāo)記的特定等位基因(標(biāo)記的2個(gè)多態(tài)形式中的一個(gè)特定形式)是否與表型的存在顯著相關(guān)。一個(gè)或另一個(gè)等位基因的存在與抗性表型更顯著相關(guān)的標(biāo)記，可能更接近負(fù)責(zé)抗性表型的基因。圖3描述了windowsqtlcartographer生成的圖，它顯示了負(fù)責(zé)cg抗性表型的基因座位于flp標(biāo)記定義的染色體上的特定位置(x軸)處的機(jī)會(huì)(y軸)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。從fengler等((2004)plantandanimalgenomexiiabstractbook，page192(posternumberp487)，january10-14，sandiego，california)和上面的gardiner(2004)所述的綜合物理和遺傳學(xué)圖，可能鑒別2個(gè)細(xì)菌人工染色體(bac)毗連群，它們?cè)醋詍o17bac文庫，攜帶上述遺傳標(biāo)記。但是，含有側(cè)接目標(biāo)區(qū)域的標(biāo)記的2個(gè)bac毗連群，含有不知大小的缺口。為了鑒別在該缺口架橋的其它bac，使用含有標(biāo)記(其具有物理圖上的已知位置)的密集遺傳學(xué)圖(fengler，(2004)同上)來發(fā)現(xiàn)通常與以前在2個(gè)bac毗連群上鑒別出的標(biāo)記遺傳連鎖的其它標(biāo)記。表2中的這些其它標(biāo)記，用于從b73bac文庫鑒別bac毗連群，它們關(guān)閉了以前發(fā)現(xiàn)的mo17-衍生的bac毗連群之間的物理缺口(coe等(2002)同上；gardiner(2004)同上；yim等(2002)同上。4個(gè)標(biāo)記mza11455、mza6064、mza2591和mza15842用于作圖目的。在表2中，“e”代表“外部的”，且“i”代表“內(nèi)部的”，它們分別指在嵌套式pcr過程中使用的外部和內(nèi)部引物。外部集合用于第一輪pcr，此后內(nèi)部序列用于在第一輪產(chǎn)物上的第二輪pcr。這增加反應(yīng)的特異性。大寫字母代表基于載體序列的引物部分，它們以后用于測(cè)序pcr。它們不是玉米序列。關(guān)于正向內(nèi)部嵌套mza引物，序列的大寫部分是seqidno：126，且關(guān)于反向內(nèi)部嵌套mza引物，大寫部分是seqidno：127。表2所示的內(nèi)部正向mza嵌套引物的序列因此是seqidno：126和每個(gè)各自引物的seqidno的組合。類似地，表2所示的內(nèi)部反向mza嵌套引物的序列是seqidno：127和每個(gè)各自引物的seqidno的組合。這些組合在表2中的seqidno：列表示。表2列出的所有引物的退火溫度是55℃。表2所述的所有標(biāo)記已經(jīng)在不同組的玉米種質(zhì)內(nèi)表現(xiàn)出多態(tài)性，包括mp305和表18所示的玉米系。使用幾種這樣的bac的末端序列以及已知位于這些bac上的est，來鑒別用于進(jìn)一步縮小基因座定位范圍的新標(biāo)記。用于該目的的其它標(biāo)記在表1中命名為flp8、flp27、flp33、flp41、flp56和flp95。以與上述類似的方式，確定表型和基因型關(guān)聯(lián)。測(cè)得基因座最可能位于flp8和flp27之間(參見圖3)。實(shí)施例2從抗性系分離bac克隆和在rcg1基因座區(qū)域鑒別候選基因?yàn)榱朔蛛x負(fù)責(zé)rcg1基因座賦予的表型的基因，從由抗性系de811asr(bc5)制備的bac文庫分離出含有flp8和flp27標(biāo)記之間的區(qū)域的bac。使用制備基因組dna的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(zhang等(1995)plantjournal7：175-184)制備該文庫，然后用hindiii部分消化，并將大小選擇的片段連接進(jìn)改良形式的可商業(yè)得到的載體pcc1bactm(epicentre，madison，usa)。按照出售商的說明書(epicentre，madison，usa)轉(zhuǎn)化進(jìn)epi300tm大腸桿菌(e.coli)細(xì)胞后，將125,184個(gè)重組克隆排列在326384-孔微量滴定盤中。然后將這些克隆裝格子到尼龍濾器上(hybondn+，amershambiosciences，piscataway，usa)。用在前面實(shí)施例表明存在于flp8和flp27之間的bac序列中的序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的重疊寡核苷酸探針(重疊寡核苷酸探針；ross等(1999)screeninglarge-insertlibrariesbyhybridization，p.5.6.1-5.6.52，ina.boyl，ed.currentprotocolsinhumangenetics.wiley，newyork)探測(cè)文庫。進(jìn)行blast搜索分析，以篩選出重復(fù)序列，并鑒別出用于探針設(shè)計(jì)的獨(dú)特序列。通過pcr，證實(shí)探針在毗連群上的位置和間距。對(duì)于每個(gè)探針，設(shè)計(jì)8bp自互補(bǔ)的2個(gè)24-聚體寡核苷酸。它們的退火產(chǎn)生40bp重疊寡核苷酸，補(bǔ)平它們的2個(gè)16bp突出端。在表4中顯示了以此方式使用的探針。應(yīng)當(dāng)指出，有些這樣的探針是基于也在實(shí)施例1和表1中使用的標(biāo)記的，但是確切序列是不同的，因?yàn)樗鼈儽挥米髦丿B寡核苷酸探針，而不僅僅是pcr引物。如(ross等(1999)同上)所述制備雜交探針，并如(ross等(1999)同上)所述雜交和洗滌通過裝格子bac文庫制備的濾器。使用感光成像儀分析來檢測(cè)雜交信號(hào)。此后，如下剝離膜的探針：將它們置于剛剛沸騰的0.1xssc和0.1％sds的溶液中，且使它們?cè)谌芤褐羞^夜冷卻至室溫。從平板分離產(chǎn)生陽性信號(hào)的bac。使用限制酶切作圖、含有與以前使用的標(biāo)記相對(duì)應(yīng)的引物和從每個(gè)bac末端得到的序列的pcr實(shí)驗(yàn)來測(cè)定覆蓋目標(biāo)區(qū)域的bac的次序。選擇跨整個(gè)區(qū)域的4個(gè)bac用于測(cè)序。使用標(biāo)準(zhǔn)的鳥槍法測(cè)序技術(shù)和使用phred/phrap/consed軟件包(ewing等(1998)genomeresearch，8：175-185)裝配的序列，對(duì)這些bac測(cè)序。裝配后，注解在作圖數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上認(rèn)為最接近基因座的區(qū)域中的序列，即推導(dǎo)出可能的基因編碼區(qū)和代表重復(fù)元件的區(qū)域。使用fgenesh軟件包(softberry，mountkisco，newyork，usa)，搜索基因編碼(基因的)區(qū)域。fgenesh預(yù)測(cè)出蛋白的部分，當(dāng)blast(blastx/nr)時(shí)，它在氨基酸水平顯示出與稻蛋白的部分(該部分注解為編碼賦予稻疾病抗性的蛋白)的部分同源性。表現(xiàn)出與該蛋白的同源性的玉米序列部分落在bac共有序列的鄰接序列段末端，且似乎被截短。為了充分代表玉米bac中的基因，在針對(duì)來自相同玉米bac克隆的所有其它共有序列的tblastn分析中，使用稻氨基酸序列。這導(dǎo)致代表玉米基因3′末端的共有序列的鑒別。但是，在這樣得到的序列中沒有代表該基因的中心部分?；谕贫ɑ虻?′和3′區(qū)域，設(shè)計(jì)pcr引物，并用于pcr實(shí)驗(yàn)，該pcr實(shí)驗(yàn)使用來自原始玉米bac的dna作為模板。產(chǎn)生的pcr產(chǎn)物的序列含有連接以前分離的5′和3′片段的序列。de811asr(bc5)已經(jīng)保藏在atcc，且本文所述的方法可以用于獲得包含rcg1基因座的bac克隆。如圖9(a)所示，含有rcg1基因座的de811asr(bc5)染色體區(qū)間與b73和mo17的對(duì)應(yīng)區(qū)域非同線(參見圖9和22)，如通過分析bac文庫確定的。使用與mo17和b73bac文庫中的bac雜交的共同序列，以蓋瓦方式排列來自2個(gè)文庫的對(duì)應(yīng)bac，如圖22所示。為了附圖的目的，給出圖22中b73bac的更短名稱。下面的表3顯示了在圖22上指出的每個(gè)bac命名的bacid。公開的b73bac，c0113f01和c0117e18分別在rcg1基因座插入/缺失區(qū)域的正北和正南，在b73中發(fā)生缺失?？梢栽趲讉€(gè)網(wǎng)站上看到關(guān)于這2個(gè)bac的信息，包括玉米gdb網(wǎng)站(maizegdb.org)、gramene網(wǎng)站(gramene.org)和亞利桑那州基因組研究所的玉米基因組數(shù)據(jù)庫(genome.arizona.edu)。亞利桑那州基因組研究所網(wǎng)站還提供了玉米瓊脂糖fpcmap，2005年7月19日版，它鑒別出了鄰接c0113f01和c0117e18的bac。通過搜索這些數(shù)據(jù)庫，鑒別出許多bac，它們形成側(cè)接rcg1基因座的區(qū)域的毗連群。因而，現(xiàn)在已經(jīng)在玉米遺傳學(xué)圖和物理圖上鑒別出rcg1基因座和rcg1基因的精確位置。參見圖7(a、b)和22。表3：在圖22中的bac命名，它們是上述亞利桑那州基因組研究所網(wǎng)站所示的b73的187毗連群(b73a至b73p)或188毗連群(b73q至b73af)的部分。在圖22中的b73bac命名b73bacidb73ac0100m06b73bb0050k15b73cc0127n01b73dc0449o09b73ec0046c06b73fc0212g06b73gc0153l14b73hc0105c14b73ib0502a04b73jb0239l06b73kb0171g07b73lc0273k24b73mc0113f01b73nc0117e18b73oc0119n15b73pb0369n20b73qb0031c17b73rc0081g12b73sc0303g03b73tc0222i18b73uc0428j12b73vc0314e18b73wc0150j16b73×b0085n01b73yc0040c01b73zc0018f13b73aac0091e23b73abb0100g11b73acc0177e03b73adb0264h08b73aec0410a17b73afc0012f18推定基因的完整序列由seqidno：1顯示。該基因含有1個(gè)內(nèi)含子，從seqidno：1的核苷酸950至核苷酸1452。使用從de811asr(bc5)植物制備的rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶-pcr，以確定內(nèi)含子的邊界。該基因的蛋白編碼序列為seqidno：2所示，且氨基酸翻譯為seqidno3所示。預(yù)測(cè)的蛋白具有110.76kd的分子量。大致從氨基酸157至404的氨基端與所謂的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nbs)具有同源性。存在與大致位于氨基酸528-846的lrr結(jié)構(gòu)域具有寬松同源性的區(qū)域。但是，與以前研究的nbs-lrr蛋白不同，該富亮氨酸的區(qū)域缺少在更經(jīng)典的lrr結(jié)構(gòu)域中可見的系統(tǒng)性重復(fù)性質(zhì)(lxx)，且具體的，沒有wang等((1999)，plantj.19：55-64)或bryan等((2000)，plantcell12：2033-2045)所述的共有序列的實(shí)例。該基因與如圖2(a、b和c)所示的稻基因和大麥基因家族具有寬松同源性。大多數(shù)同源性是在蛋白的氨基末端；羧基末端是非常不同的。這在圖2(a、b和c)中用粗體表示，它們是與實(shí)施方案的基因相同的氨基酸，而不同的那些沒有以粗體表示。表4.退火來合成重疊寡核苷酸探針的寡核苷酸實(shí)施例3抗性和易感系之間的rcg1基因座區(qū)域內(nèi)的基因結(jié)構(gòu)對(duì)比和在抗性和易感系之間的該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的候選基因的表達(dá)特性發(fā)現(xiàn)在遺傳上確定的攜帶負(fù)責(zé)炭疽病表型抗性的基因座區(qū)域中的候選基因后，首先進(jìn)行努力來確定該區(qū)域是否可能存在其它基因，其次確定候選基因的表達(dá)模式是否與它的推定作用相一致。fu和dooner((2002)，procnatlacadsci99：9573-9578)和brunner等((2005)，plantcell17：343-360)已經(jīng)證實(shí)，不同的玉米近交系可能具有顯著的重排，且彼此缺少同線性。因而在更大的區(qū)域?qū)Ρ冗@樣的基因組是復(fù)雜的。mo17(missouri17)和de811asr(bc5)的這樣的基因組對(duì)比揭示，在de811asr(bc5)中發(fā)現(xiàn)候選基因的區(qū)域中，存在相對(duì)于mo17的大插入。對(duì)插入內(nèi)部和周圍的區(qū)域測(cè)序，并掃描可能的基因。在de811asr(bc5)和mo17基因組兩者中發(fā)現(xiàn)了編碼核酮糖二磷酸羧化酶(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶，光合作用之后的碳固定涉及的蛋白，它的基因以多個(gè)拷貝存在于玉米基因組中)亞基的基因，它緊挨在rcg1基因位置的下游。發(fā)現(xiàn)了與營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)藏蛋白有關(guān)的假基因(由于破壞編碼序列的突變，導(dǎo)致非功能性的基因)，它僅僅存在于de811asr(bc5)基因組中，在rcg1基因上游一段距離。可能編碼具有可能與疾病抗性相關(guān)的功能的蛋白的唯一的結(jié)構(gòu)完整的基因是在前面實(shí)施例分離出的rcg1基因。同等不可能參與疾病抗性的其它基因以及大量重復(fù)序列位于離基因座最可能的位置更遠(yuǎn)的距離。為了確定rcg1基因是否轉(zhuǎn)錄和在何處轉(zhuǎn)錄，使用兩種技術(shù)。首先，使用大量平行特征測(cè)序(massivelyparallelsignaturesequencing)(mpss；lynxtherapeutics，berkeley，usa)，測(cè)量抗性和易感的植物材料的rna特性。簡(jiǎn)而言之，如(brenner，s.等(2000)nat.biotechnol.18(6)：630-634)所述，構(gòu)建cdna文庫，并固定化到微珠上。在固體支持物上構(gòu)建文庫，允許在單層中排列文庫，并允許平行地對(duì)數(shù)千個(gè)克隆進(jìn)行核苷酸序列分析。分析產(chǎn)生“特征”17-聚體序列，它的發(fā)生頻率與植物組織中轉(zhuǎn)錄物的豐度成比例。對(duì)從de811asr(bc5)和de811(對(duì)照系，易感cg)制備的rna衍生出的cdna進(jìn)行mpss分析。得到的特征的生物信息學(xué)檢查表明，在cg接種后9天(dpi)，在本文中稱作lynx19的特征序列(seqidno：19)以百萬分之43(ppm)存在于來自de811asr(bc5)禾受感染的莖的rna樣品中，且以65ppm存在于感染的、抗性莖中。在易感玉米系de811的未受感染的或cg-感染的莖的cdna文庫中，沒有檢測(cè)出該特征序列。rcg1的序列分析表明，17-聚體標(biāo)記存在于該基因的推定3′非翻譯區(qū)中seqidno：1的核苷酸3945-3961處。通過rt-pcr實(shí)驗(yàn)，得到了rcg1在源自mp305且抗炭疽病莖腐爛的玉米系中排它表達(dá)的其它證據(jù)。使用rnastat-60tm(iso-texdiagnostics，friendswood，texas，usa)，從抗性的(de811asr1(bc5))和易感的(de811)玉米系的未受感染的和cg-感染的莖分離出總rna。使用generna-pcr試劑盒(appliedbiosystems，fostercity，california，usa)，將來自0、3、6、9和13dpi抗性和易感樣品的總rna(250ng)拷貝成cdna，并擴(kuò)增。根據(jù)試劑盒規(guī)程，使用隨機(jī)六聚體作為引物，裝配cdna合成反應(yīng)，并在42℃溫育45分鐘。對(duì)于pcr，分別使用從rcg1的推定3′非翻譯序列設(shè)計(jì)的keb131(seqidno：20)和keb138(seqidno：21)作為上游和下游引物。將cdna擴(kuò)增30個(gè)由在94℃1分鐘、在50℃2分鐘和在72℃3分鐘組成的循環(huán)，然后在72℃延伸7分鐘。如圖4所示，rt-pcr的等分試樣的瓊脂糖凝膠電泳揭示，260bp帶存在于源自受感染的和未受感染的抗性植物的樣品中，但是在易感樣品中不存在。dna序列分析證實(shí)，該片段與rcg1序列的nt3625-3884相對(duì)應(yīng)，與從引物keb131和keb138預(yù)測(cè)的擴(kuò)增產(chǎn)物相一致。實(shí)施例4含有候選基因中的mu插入的系的分離確定基因是否負(fù)責(zé)表型的一種方法是，通過插入轉(zhuǎn)座因子(所謂的轉(zhuǎn)座子標(biāo)記)遺傳地破壞該基因，然后確定是否改變了植物的相關(guān)表型，在本例中，從對(duì)cg的抗性變成對(duì)cg易感。在玉米中，這可以使用增變基因(mu)元件來完成(walbot，v.(1992)annu.rev.plantphysiol.plantmol.biol.43：49-82)。圖5所示的基本策略是，將有活性的增變基因元件導(dǎo)入攜帶抗性基因的系中，通過測(cè)定相關(guān)的dna標(biāo)記以及接種cg后對(duì)cg的抗性，分離抗性基因純合的植物，然后使這些純合的植物與易感“試驗(yàn)者”系雜交。如果抗性基因是顯性的，則原則上所有產(chǎn)生的后代都是對(duì)基因抗性但雜合的。但是，如果mu元件以破壞其功能的方式插入抗性基因，則個(gè)體會(huì)對(duì)cg易感。然后可以分離和表征被破壞的基因。使mp305與15種不同的增變基因原種(攜帶有活性的增變基因元件的系)雜交。使得到的f1以所有可能的組合相互交配(彼此雜交)。為了追蹤已知它上面存在抗性基因座的染色體區(qū)域4l(參見實(shí)施例1)，選擇已知位于來自實(shí)施例1所述工作的基因座附近的許多dna標(biāo)記，并用于mu-標(biāo)記的材料上。檢查約1500個(gè)來自相互交配過程的后代植物對(duì)cg的抗性和這些標(biāo)記的存在。使用實(shí)施例1所述的dna印跡(botstein等，(1980)am.j.hum.gen.32：314-331)(對(duì)于rflp標(biāo)記)或pcr(對(duì)于flp標(biāo)記)，分析標(biāo)記。選擇對(duì)所有測(cè)試的標(biāo)記純合的且對(duì)cg抗性的植物，并與易感試驗(yàn)者系(a63、eh6wa和ef09b)測(cè)交。然后種植從這些純合的且抗性的植物產(chǎn)生的約16,000粒測(cè)交種子，并用作母本(指去除了產(chǎn)生花粉的雄花穗)，與用作父本的易感試驗(yàn)者系雜交。篩選所有雌性植株對(duì)cg的易感性。鑒別出超過10株易感植物(推定的敲除突變體)。收獲來自每株這樣的易感植物的開放傳粉的種子，用8株抗性姊妹株作為對(duì)照。從來自每一推定的敲除和對(duì)照抗性姊妹株的一組24株幼苗(生長(zhǎng)在紙巾中)中提取dna。將該dna用作模板，以使用基因-特異性的引物以及從來自增變基因元件序列的末端反向重復(fù)序列(tir)設(shè)計(jì)的共有引物(seqidno：125)，從mu-插入位點(diǎn)擴(kuò)增側(cè)接序列。換而言之，如果mu元件已經(jīng)插入在實(shí)施例2中分離的候選基因，則只會(huì)觀察到pcr產(chǎn)物。引物flp110f、flp110r、flp111f、flp111r、flp112f、flp112r、flp113f和flpa1r用作基因-特異性的引物(參見表1)。將pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物印跡到尼龍膜上，并與從實(shí)施例2分離的候選基因的dna探針雜交。從凝膠切下表現(xiàn)出強(qiáng)雜交的pcr產(chǎn)物，純化，克隆，并測(cè)序。通過與來自候選基因和mu-tir的序列比對(duì)，分析得到的序列。增變基因元件在插入位點(diǎn)造成9bp同向重復(fù)。基于側(cè)接序列信息和9bp同向重復(fù)，在候選基因的外顯子1中鑒別出了4個(gè)獨(dú)立的插入(圖5)。在基因的5′非翻譯區(qū)，在起始密碼子上游約97bp處檢測(cè)出一個(gè)插入(m177)。在3株易感植物m164、m159和m179中，在起始密碼子下游270bp檢出了一個(gè)共同的插入事件。發(fā)現(xiàn)m171易感植物含有2個(gè)mu-插入，在起始密碼子下游556bp和286bp處。當(dāng)使用該基因的外顯子1區(qū)域作為dna探針進(jìn)行dna印跡時(shí)，觀察到的修改的雜交模式進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果。該實(shí)施例和前述實(shí)施例可以總結(jié)如下。在實(shí)施例1中引用的早期工作表明，以前觀察到的賦予對(duì)cg的抗性的基因座位于玉米染色體4的長(zhǎng)臂上。完全不知道該基因座的性質(zhì)、它的確切位置或它編碼的基因。在實(shí)施例1中進(jìn)行的工作證實(shí)，該基因座可以作圖到染色體4長(zhǎng)臂上的非常小的區(qū)域。實(shí)施例2證實(shí)，在該染色體區(qū)僅僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因可能是這樣的抗性基因。它編碼新形式的nbs-lrr蛋白，即已知參與對(duì)病原體抗性的蛋白家族，但是它們的序列和抗性特異性有很大變化。實(shí)施例3表明，該基因僅僅存在于抗性系中，不存在于等基因的易感系中，且在抗性系中發(fā)現(xiàn)了與該基因相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄物，從而表明該基因被表達(dá)，且這些轉(zhuǎn)錄物僅僅見于抗性系中。實(shí)施例4證實(shí)，在4個(gè)獨(dú)立分離的mu插入事件中，當(dāng)通過插入mu元件來破壞基因時(shí)，這些植物的表型從對(duì)cg抗性變成對(duì)cg易感?？傊?，這些數(shù)據(jù)有力地證實(shí)，本發(fā)明實(shí)施方案的主題是可以增強(qiáng)或賦予玉米植物cg抗性的基因。實(shí)施例5rcg1基因座回交進(jìn)易感系進(jìn)行近交的rcg1基因座漸滲，以證實(shí)rcg1基因座可以成功地回交進(jìn)近交中，且用含有rcg1基因座的近交系生成的雜種會(huì)具有增強(qiáng)的或賦予的cg抗性。還開發(fā)了de811asr(bc5)，并用作用于漸滲rcg1基因座的改良的供體來源。然后，使用幾種其它的近交作為回歸親本，以使用本文所述的標(biāo)記輔助育種方法有效地將rcg1基因座漸滲進(jìn)許多近交和雜種遺傳背景中，從而增強(qiáng)或賦予對(duì)cg的抗性。在下面更詳細(xì)地討論了每個(gè)這樣的實(shí)施例。概念的證明(ph09b)mp305是白色核顏色近交系，它具有強(qiáng)對(duì)cg的抗性，但是它的延遲開花、低產(chǎn)量和弱農(nóng)藝學(xué)特征使它成為在不使用本文所述標(biāo)記輔助育種方法的情況下差的供體親本。在表6中提供了mp305的分子標(biāo)記特性。表中報(bào)道的ssr使用的引物可以從可公開得到的序列構(gòu)建，所述序列見于在環(huán)球網(wǎng)上的maizegdb.org(usdaagriculturalresearchservice主辦)的maizegdb、sharopova等(plantmol.biol.48(5-6)：463-481)和/或lee等(plantmol.biol.48(5-6)；453-461)。umc15a是rflp標(biāo)記，且報(bào)道的評(píng)分是基于ecor1限制的。為了證實(shí)rcg1基因座的表型值，首先如下所述將基因座漸滲進(jìn)系ph09b(美國(guó)專利5,859,354)，直至bc3階段。將從mp305和系ph09b之間的雜交衍生的f1群體與系ph09b再回交一次，從而產(chǎn)生bc1群體。種植幼苗，再與系ph09b回交，以形成bc2群體。從bc2家族的葉子穿孔制備dna。為了確定種植哪個(gè)bc2家族來進(jìn)一步回交，使用側(cè)接目標(biāo)區(qū)域的標(biāo)記umc2041、phi093和csu166的引物，對(duì)來自bc2家族的dna進(jìn)行基因型分析(參見表1)。種植來自bc2家族的種子，并使用與上面提及的相同的3個(gè)標(biāo)記，對(duì)個(gè)體植物再次進(jìn)行基因型分析，以確定mp305形式的染色體區(qū)域的存在。使陽性植物再與系ph09b回交一次，以形成bc3群體。種植來自這些bc3群體的種子，并將植物自交，以得到對(duì)于目標(biāo)區(qū)域分離的bc3s1家族以及缺少目標(biāo)區(qū)域的bc3s1家族。將這些家族用于表型對(duì)比(對(duì)于目標(biāo)區(qū)域分離的bc3s1對(duì)比沒有目標(biāo)區(qū)域的bc3s1)。為了觀察rcg1基因在雜合情形(例如在商業(yè)雜種中會(huì)發(fā)現(xiàn)的)下的表現(xiàn)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)臏y(cè)交。具體地，種植對(duì)于目標(biāo)區(qū)域分離的bc3s1家族，并對(duì)個(gè)體bc3s1植物進(jìn)行基因型分析。使用每個(gè)家族內(nèi)rcg1基因純合的植物以及無效等位基因(缺少2個(gè)染色體上的基因)純合的植物，進(jìn)行與近交ph2ej(美國(guó)專利6,333,453)、ph2no(美國(guó)專利6,124,533)、ph4cv(美國(guó)專利6,897,363)和ph8cw(美國(guó)專利6,784,349)的測(cè)交。在bc3s1系和雜種的情況下，觀察到的表型差異指示著含有攜帶rcg1的區(qū)域的系和雜種中asr抗性的顯著提高。漸滲的rcg1基因座在bc3s1家族和衍生的測(cè)交雜種中的作用，導(dǎo)致在受感染的節(jié)間數(shù)和超過75％受感染的節(jié)間數(shù)方面的增加。在下面的表5中顯示了使用植物育種者常用的視覺評(píng)分系統(tǒng)得到的評(píng)分。數(shù)據(jù)清楚地證實(shí)，使用雜交技術(shù)來將實(shí)施方案基因轉(zhuǎn)移進(jìn)遺傳上能使用該基因的其它系中導(dǎo)致增強(qiáng)的對(duì)cg的抗性。表5：bc3s1家族和衍生的測(cè)交中漸滲的rcg1區(qū)域?qū)μ烤也∏o腐爛抗性程度的作用表6：mp305的分子標(biāo)記特性作為用于回交的提高最大的供體的de811asr(bc5)盡管mp305用于上面的實(shí)驗(yàn)中，但如圖8(a)所解釋的，de811asr(bc5)保留比de811asr(bc3)(當(dāng)然以及mp305)更小的含有rcg1基因座的mp305染色體區(qū)間，且因此特別可用作rcg1基因的供體來源。已經(jīng)表明來自de811asr(bc5)來源的縮短的染色體區(qū)間與提高的農(nóng)藝學(xué)表型相關(guān)。在2005年11月至2006年3月，在溫室中培養(yǎng)22株來自de811asr(bc3)衍生系的植物、20株來自de811asr(bc5)衍生系的植物、5株de811植物和5株mp305植物，并采集植物高度和谷穗高度的數(shù)據(jù)；50％植物釋放花粉的日期(midshed)，50％植物具有可看到的谷穗新芽(earshoots)的日期(midves)和50％植物具有從谷穗新芽突出的穗絲的日期(midslk)；并觀察核顏色。平均而言，de811asr(bc5)系比de811asr(bc3)更短(293cm對(duì)比345cm)，且de811asr(bc5)的谷穗的位置比de811asr(bc3)更低(146cm對(duì)比183cm)，它們二者在原種品種開發(fā)方面都是陽性性狀。與de811asr(bc3)相比，de811asr(bc5)的midshed、midves和midslk更早。與de811asr(bc3)相比，de811asr(bc5)的midshed早約1天，midves早約6天，且midslk早約3天。de811asr(bc5)的核是微黃棕色(青銅色)顏色，而de811asr(bc3)的核具有淺黃色果殼。de811asr(bc5)和de811的midshed、midves和midslk日期類似，而mp305的midshed晚約11天，且沒有產(chǎn)生50％可看到的谷穗新芽，在生長(zhǎng)時(shí)間段也沒有50％穗絲。盡管這些數(shù)據(jù)僅僅是基于少數(shù)de811和mp305植物，且在這少數(shù)系上沒有產(chǎn)生谷穗，但這些溫室結(jié)果類似于這些系在田間的觀察結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，de811asr(bc5)比de811asr(bc3)更接近地類似于de811回歸親本。因而，de811asr(bc5)在基因型和表型上是rcg1基因座和rcg1基因的優(yōu)良起始供體來源。另外，當(dāng)以類似于de811的適應(yīng)向種質(zhì)中漸滲rcg1基因座時(shí)，de811asr(bc5)是特別有用的。de811由j.hawk(hawk，j.a.(1985).cropsciencevol25：p716)開發(fā)，且已經(jīng)被描述為黃色馬齒形(dent)近交系，它源自自交和在由b68與源自[b37htx(c103xmp3204雙雜交)sel.]的近交的雜交繁衍的系譜程序中選擇6代。在delaware的測(cè)試中，de811抽絲比b73晚1-2天，但是在missouri比b73晚4天。有限的產(chǎn)量試驗(yàn)表明，de811具有令人滿意的配合力。它能良好地抽絲(形成好穗絲，后者是玉米雌花對(duì)育性重要的組分)和釋放花粉，且可以與早熟種質(zhì)雜交以適應(yīng)北美，并與晚熟種質(zhì)雜交以適應(yīng)南美。因而，de811asr(bc5)與本文公開的標(biāo)記和育種方法的組合可以用作將rcg1基因漸滲進(jìn)多種種質(zhì)(包括適應(yīng)存在cg的所有美國(guó)區(qū)域的種質(zhì))中的原始供體來源。近交的rcg1基因座轉(zhuǎn)變的生成在上述ph09b中測(cè)試成功的rcg1基因座漸滲后，在其它近交系中進(jìn)行其它rcg1基因座轉(zhuǎn)變。第一系列具有5次回交，其中使用mp305和de811asr(bc5)作為供體。對(duì)于第二系列的回交，使用分子標(biāo)記以減少來自第一系列的bc5轉(zhuǎn)變中的染色體區(qū)間。選擇這些bc5轉(zhuǎn)變，以用于在rcg1基因下交換。然后回交那些選擇的植物，以生成bc6代。在bc6代中選擇具有在該基因上邊的交換的植物。第一系列的回交在第一系列中，使用de811asr(bc5)作為主要供體來源，但是也使用mp305作為供體來源，對(duì)相同的近交進(jìn)行平行漸滲。下面更詳細(xì)地描述的這些數(shù)據(jù)證實(shí)，盡管de811asr(bc5)在許多情況下是優(yōu)選的供體，但mp305也可以與本文教導(dǎo)的實(shí)施方案的標(biāo)記輔助育種方法一起有效地使用。選擇最初適應(yīng)北美生長(zhǎng)條件的原種近交系用作回歸親本。最初選擇的用作回歸親本的近交系是系ph0r8(us6,717,036)、ph7ch(us6,730,835)、ph705(us6,903,25)、ph5w4(us6,717,040)、ph51k(us6,881,881)和ph87p(us6,888,051)。使每個(gè)這樣的系與de811asr(bc5)雜交，以及與mp305雜交。使源自每個(gè)這樣的雜交的f1代與各個(gè)近交系再回交一次，從而產(chǎn)生第一次回交(回歸親本bc1)世代。將幼苗移植到土地上，并從葉子穿孔制備dna。使用側(cè)接目標(biāo)區(qū)域的標(biāo)記的引物，進(jìn)行pcr反應(yīng)；umc1466、umc1418、bnlg2162、umc1086、umc2041、umc1612、csu166、umc1051、umc2187、umc1371和umc1856用于早期bc輪次(參見表1)，而在晚期bc輪次中，使用umc1418、bnlg2162、umc1051、umc2041、umc2187、umc1371和umc1856。然后，將pcr反應(yīng)產(chǎn)生陽性結(jié)果(意味著存在mp305衍生的rcg1基因座)的幼苗進(jìn)一步與各個(gè)近交系回交，以制備bc2。該操作稱作“基因型分析”，鑒別出在特定標(biāo)記位點(diǎn)的植物基因組成。重復(fù)這些步驟，進(jìn)行回歸親本bc3、bc4和bc5開發(fā)。分析表明，5次回交后，這些系保留了顯著截短的包含rcg1基因座的染色體區(qū)間，且基于視覺觀察，沒有觀察到由于rcg1基因座的存在而產(chǎn)生的負(fù)面作用的跡象。還通過選擇表型上最像回歸親本的植物，進(jìn)行回歸親本選擇。使用這些基因型和表型方法，用在整個(gè)基因組間高百分比的回歸親本，選擇高品質(zhì)轉(zhuǎn)變。該實(shí)施例也說明，側(cè)接標(biāo)記沒有排它地用于選擇rcg1基因或者遠(yuǎn)離rcg1基因選擇。然后，將pcr反應(yīng)產(chǎn)生陽性結(jié)果(意味著存在mp305衍生的rcg1基因座)的幼苗進(jìn)一步與各個(gè)近交系回交，以進(jìn)行第一系列中的最終回交(回歸親本bc5代)。當(dāng)最接近的側(cè)接多態(tài)標(biāo)記確定該基因存在時(shí)，使用離該基因更遠(yuǎn)的下一組雙側(cè)接多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行回歸親本選擇。因而，側(cè)接rcg1基因或rcg1基因座的標(biāo)記的應(yīng)用，可以用于解釋在該區(qū)域中發(fā)生的重組。第二系列的回交然后，將在第一系列回交中使用側(cè)接rcg1基因座的ssr制備的近交rcg1基因座轉(zhuǎn)變，用作下一個(gè)回交輪次的供體。對(duì)于該系列的回交，為rcg1基因開發(fā)snp標(biāo)記，其能以高通量方式實(shí)現(xiàn)標(biāo)記輔助選擇，如實(shí)施例13所述，以選擇rcg1基因。還在rcg1基因座周圍的區(qū)域中設(shè)計(jì)snp標(biāo)記，從而允許將側(cè)接標(biāo)記用于遠(yuǎn)離rcg1基因座周圍的mp305染色體區(qū)間選擇，和選擇回歸親本基因型，從而顯著減少連鎖拖曳。僅僅通過物理作圖和克隆該基因，這樣精確的標(biāo)記輔助回歸親本選擇是可行的。首先，用更精確的標(biāo)記集合重新篩選從第一系列回交產(chǎn)生的回歸親本bc5植物，并選擇在rcg1基因南邊的重組。將緊密與rcg1基因連鎖的側(cè)接標(biāo)記(mza8761、mza1851、umc1051和umc2187)用于在約40后代的小群體大小中選擇在該基因南邊的回歸親本(參見圖8(a-b))。然后，使用本文公開的flp標(biāo)記，分析這些后代，以更精確地確定重組點(diǎn)。該數(shù)據(jù)表明，選擇的有些后代含有在rcg1基因南邊小于1cm的回歸親本基因組(基于ibm2相鄰遺傳學(xué)圖距)，如圖8(b)所示。其它后代含有在rcg1基因南邊小于4cm的回歸親本基因組。然后，將這些標(biāo)記-選擇的bc5轉(zhuǎn)變用作供體，并與作為回歸親本的ph705、ph5w4、ph51k和ph87p的近等基因副本雜交，以產(chǎn)生bc6群體。再次將rcg1基因中的標(biāo)記用于選擇rcg1，這次在rcg1北邊的側(cè)接標(biāo)記用于選擇回歸親本。在這輪選擇中，在每個(gè)群體中，在rcg1和標(biāo)記mza15842之間檢測(cè)到重組。使用相對(duì)于側(cè)接標(biāo)記umc2285和phi093的回歸，從它在圖7(b)、圖b所示的高分辨率圖上的位置，可以外推mza15842在ibm2相鄰遺傳學(xué)圖上的位置。這將在520.5cm處的mza15842置于ibm2相鄰遺傳學(xué)圖上。因此，如圖8(b)所示，在2輪回交中，每個(gè)群體中的供體基因組減小至小于6cm的區(qū)段，或小于染色體4的0.8％，這基于ibm2相鄰遺傳學(xué)圖距，且在有些后代中，該區(qū)段小于2.1cm，或小于染色體4的0.25％。為了對(duì)比，de811asr(bc3)內(nèi)含有rcg1基因座的mp305染色體區(qū)間是131cm，或染色體4的約16％，這基于ibm2相鄰遺傳學(xué)圖距。僅僅通過物理作圖和克隆該基因，這樣精確的且有效的標(biāo)記輔助回歸親本選擇是可行的。進(jìn)一步的分析因此，作為精細(xì)對(duì)rcg1基因位置作圖的結(jié)果，人們可以使用與rcg1基因遺傳連鎖的任意2個(gè)側(cè)接標(biāo)記來選擇含有在rcg1基因北邊和南邊的交換的小染色體區(qū)域。這具有減少連鎖拖曳的優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)嘗試將來自未適應(yīng)的種質(zhì)(例如mp305)的特定基因漸滲進(jìn)原種種質(zhì)(例如上述的近交系)中時(shí)，它可能是致混淆因素。圖7和22和表16顯示了可以用于該目的的側(cè)接rcg1基因和基因座的標(biāo)記的許多組合?？梢杂糜谶x擇包含rcg1基因或基因座的截短的染色體區(qū)間的有些特異性的側(cè)接標(biāo)記是umc2285和umc15a、umc2285和umc2187、umc1086和umc2200、umc2041和umc2200、umc2041和phi093、mza11455和umc15a、mza11455和mza3434、mza15842和mza3434和flp8和flp33。任選地，在每個(gè)這樣的染色體區(qū)間上或內(nèi)部，人們可以使用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個(gè)或更多個(gè)標(biāo)記，以定位重組事件和選擇具有最大量的回歸親本基因型的rcg1基因或rcg1基因座。此外，在這樣的染色體區(qū)間的北末端和rcg1基因的頂端之間和/或在這樣的染色體區(qū)間的南末端和rcg1基因的底端之間，可以有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個(gè)標(biāo)記。具有用于選擇基因的緊密連鎖的側(cè)接標(biāo)記是有利的，且具有在基因本身內(nèi)的標(biāo)記是非常有利的。這是勝過使用單個(gè)標(biāo)記或遠(yuǎn)距離側(cè)接標(biāo)記的改進(jìn)，因?yàn)槭褂脝蝹€(gè)標(biāo)記或遠(yuǎn)距離側(cè)接標(biāo)記，可能會(huì)破壞與rcg1相關(guān)的連鎖，且通過選擇這樣的標(biāo)記，人們更可能不經(jīng)意地選擇不含有rcg1基因的植物。因?yàn)橐坏┮呀?jīng)確認(rèn)標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)，就經(jīng)常使用標(biāo)記輔助選擇來代替表型選擇，所以這樣的錯(cuò)誤的不幸結(jié)果將是，選擇不抗cg的植物和拋棄抗cg的植物。在這點(diǎn)上，在rcg1基因內(nèi)的標(biāo)記是特別有用的，因?yàn)樗鼈兏鶕?jù)定義將保持與該基因增強(qiáng)或賦予的對(duì)cg的抗性的連鎖。此外，出于類似的原因，在rcg1基因座內(nèi)的標(biāo)記同樣有用。由于它們非常接近rcg1基因，所以它們非常可能保持與rcg1基因的連鎖。一旦漸滲該rcg1基因，這樣的原種近交就可以用于雜種種子生產(chǎn)和用作將rcg1基因進(jìn)一步漸滲進(jìn)其它近交系的供體來源。因而，數(shù)據(jù)清楚地表明，使用de811asr(bc5)作為供體來源轉(zhuǎn)化的近交后代保留截短的mp305染色體區(qū)間。包含截短的mp305染色體區(qū)間的近交本身非常適用作供體來源，且不需要回復(fù)到作為供體來源的de811asr(bc5)。通過使用本文所述的標(biāo)記輔助育種，可以根據(jù)需要進(jìn)一步減小截短的mp305染色體區(qū)間的大小，而無需擔(dān)心喪失標(biāo)記和rcg1基因之間的連鎖。表型上，減小的染色體區(qū)間與提高的農(nóng)藝學(xué)性能相關(guān)聯(lián)，如上述的de811asr(bc5)和de811asr(bc3)的對(duì)比所證實(shí)的。實(shí)施例6使用rcg1作為轉(zhuǎn)基因來生成抗性玉米植物rcg1基因也可以表達(dá)為轉(zhuǎn)基因，從而允許在不同環(huán)境下調(diào)節(jié)它的表達(dá)。下面的實(shí)施例顯示了如何以不同方式表達(dá)rcg1基因，以對(duì)抗不同的疾病或保護(hù)植物的不同部分，或簡(jiǎn)單地將rcg1基因作為轉(zhuǎn)基因移動(dòng)進(jìn)不同玉米系中，作為實(shí)施例5所述方法的替代方案。實(shí)施例6a：在本實(shí)施例中，使用它自己的啟動(dòng)子，表達(dá)rcg1基因。使用相同的bac，對(duì)rcg1基因的上游區(qū)域測(cè)序，所述bac在實(shí)施例2中提供該基因的蛋白編碼段的序列。在seqidno：24中，描述了在atg5’的1684bp的序列。為了轉(zhuǎn)化完整的rcg1基因，包括啟動(dòng)子和蛋白編碼區(qū)，使用bac克隆#24(pk257m7)作為模板dna，pcr擴(kuò)增從seqidno：137的位置41268延伸至位置47176的5910bp片段。為了實(shí)現(xiàn)使用技術(shù)(invitrogen，carlsbad，usa)的克隆，通過bp重組反應(yīng)，將attb位點(diǎn)摻入pcr引物，并將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)pdonr221載體。通過lr重組反應(yīng)，將得到的側(cè)接attl位點(diǎn)的片段移動(dòng)進(jìn)二元載體。然后，將構(gòu)建體dna用于實(shí)施例7所述的玉米轉(zhuǎn)化。實(shí)施例6b：為了在整個(gè)植物中低水平地表達(dá)rcg1基因，將基因編碼區(qū)和它的終止子置于稻肌動(dòng)蛋白基因(美國(guó)專利號(hào)5,641,876和5,684,239)或f3.7基因(美國(guó)專利5,850,018)的啟動(dòng)子的后面。為了實(shí)現(xiàn)使用技術(shù)(invitrogen，carlsbad，usa)的克隆，將attb位點(diǎn)整合入pcr引物，后者用于擴(kuò)增從其起始密碼子上游35bp開始的rcg1基因。將noti位點(diǎn)加入attb1引物。通過bp重組反應(yīng)(invitrogen，carlsbad，usa)，將擴(kuò)增的rcg1產(chǎn)物克隆進(jìn)pdonr221載體?？寺『螅o得到的rcg1基因側(cè)接attl位點(diǎn)，且其在起始密碼子上游35bp處具有獨(dú)特的noti位點(diǎn)。此后，使用含有noti位點(diǎn)的引物，pcr擴(kuò)增啟動(dòng)子片段。將每個(gè)啟動(dòng)子融合到rcg1的noti位點(diǎn)上。在最后一步中，通過lr重組反應(yīng)(invitrogen，carlsbad，usa)，將嵌合基因構(gòu)建體移動(dòng)進(jìn)二元載體php20622。將它用于實(shí)施例7所述的玉米轉(zhuǎn)化。實(shí)施例6c：為了在整個(gè)植物中高水平地表達(dá)rcg1基因，將基因編碼區(qū)和它的終止子置于玉米遍在蛋白基因的啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)和內(nèi)含子的后面(christensen等(1989)plantmol.biol.12：619-632；christensen等(1992)plantmol.biol.18：675-689)。為了實(shí)現(xiàn)使用技術(shù)(invitrogen，carlsbad，usa)的克隆，將attb位點(diǎn)整合入pcr引物，后者用于擴(kuò)增從起始密碼子上游142bp開始的rcg1基因。使用bp重組反應(yīng)(invitrogen，carlsbad，usa)，將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆進(jìn)pdonr221(invitrogen，carlsbad，usa)。克隆后，給得到的rcg1基因側(cè)接attl位點(diǎn)。在最后一步中，通過lr重組反應(yīng)(invitrogen，carlsbad，usa)，在遍在蛋白表達(dá)盒后面，將rcg1克隆移動(dòng)進(jìn)載體中，所述載休包含christensen等(同上)所述的玉米遍在蛋白啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)和遍在蛋白基因的第一個(gè)內(nèi)含子，后面是用于插入rcg1基因的attr1和r2位點(diǎn)。該載體也含有適用于玉米轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因，所以得到的攜帶嵌合基因(玉米遍在蛋白啟動(dòng)子-遍在蛋白5′非翻譯區(qū)-遍在蛋白內(nèi)含子1-rcg1)的質(zhì)粒適用于實(shí)施例7所述的玉米轉(zhuǎn)化。實(shí)施例6d：為了莖-優(yōu)選地、低水平地表達(dá)rcg1基因，將基因編碼區(qū)和它的終止子置于br2基因啟動(dòng)子的后面(美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)10/931,077)。使用實(shí)施例6b所述的含有側(cè)接attl位點(diǎn)的rcg1編碼區(qū)、且含有在rcg1起始密碼子上游35bp處的獨(dú)特noti位點(diǎn)的片段，實(shí)現(xiàn)使用技術(shù)(invitrogen，carlsbad，usa)的克隆。使用含有noti位點(diǎn)的引物，pcr擴(kuò)增br2或zm-419的啟動(dòng)子片段。將每個(gè)啟動(dòng)子融合到rcg1的noti位點(diǎn)。在最后一步中，通過lr重組反應(yīng)(invitrogen，carlsbad，usa)，將嵌合基因構(gòu)建體移動(dòng)進(jìn)二元載體php20622。將它用于實(shí)施例7所述的玉米轉(zhuǎn)化。實(shí)施例7土壤桿菌屬-介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物的再生如下使用在實(shí)施例6a和6c中制備的重組dna構(gòu)建體，來制備轉(zhuǎn)基因玉米植物。使用zhao(美國(guó)專利號(hào)5,981,840和pct專利公開wo98/32326)的方法，用實(shí)施例6a和6c所述的選擇的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化玉米。簡(jiǎn)而言之，從玉米分離未成熟的胚，并使胚接觸土壤桿菌屬懸浮液，其中所述細(xì)菌能將多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)移至至少一個(gè)未成熟的胚的至少一個(gè)細(xì)胞中(步驟1：感染步驟)。在該步驟中，將禾成熟的胚浸沒在土壤桿菌屬懸浮液中，用于開始接種。將胚與土壤桿菌屬共培養(yǎng)一段時(shí)間(步驟2：共培養(yǎng)步驟)。在感染步驟后，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟的胚。在該共培養(yǎng)時(shí)間段后，進(jìn)行任選的“休眠”步驟。在該休眠步驟中，在有至少一種已知抑制土壤桿菌屬生長(zhǎng)的抗生素存在下，溫育胚，而不加入植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3：休眠步驟)。在含有抗生素、但是不含有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)未成熟的胚，以消除土壤桿菌屬，并使感染的細(xì)胞進(jìn)入休眠期。接著，在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)接種的胚，并回收生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化的愈傷組織(步驟4：選擇步驟)。然后，將愈傷組織再生成植物(步驟5：再生步驟)，并在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織，以再生植物。實(shí)施例8：轉(zhuǎn)基因植物評(píng)價(jià)分別使用實(shí)施例6a和6c所述的構(gòu)建體，如實(shí)施例7所述制備轉(zhuǎn)基因植物。對(duì)于天然rcg1基因和遍在蛋白rcg1基因構(gòu)建體，生成30個(gè)獨(dú)立的事件和10個(gè)僅載體的對(duì)照事件。收獲每個(gè)天然基因轉(zhuǎn)基因事件的葉盤，用于總rna分離。使用seqidno：37和38所述的基因特異性的引物flp111f和flp111r，進(jìn)行rt-pcr。在30/30個(gè)轉(zhuǎn)基因事件中，存在預(yù)期的637bprt-pcr帶，從而指示天然基因構(gòu)建體的表達(dá)。在溫室中，在相同的30個(gè)天然rcg1轉(zhuǎn)基因事件上進(jìn)行疾病測(cè)定，以確定植物是否抗cg。為此，首先使用實(shí)施例10所述的操作，對(duì)每個(gè)事件的5個(gè)姊妹株植物進(jìn)行葉斑病測(cè)定。發(fā)現(xiàn)單個(gè)事件會(huì)表現(xiàn)出比缺少天然rcg1基因構(gòu)建體的對(duì)照植物顯著的疾病減少。使已經(jīng)進(jìn)行葉斑病測(cè)定的植物在開花后發(fā)育2周，然后通過將cg接種進(jìn)第一個(gè)伸長(zhǎng)的莖節(jié)間，進(jìn)一步測(cè)試。這些莖感染測(cè)定顯示了當(dāng)與對(duì)照植物相比較時(shí)，對(duì)cg感染更高抗性的表達(dá)天然rcg1轉(zhuǎn)基因的單個(gè)轉(zhuǎn)基因事件。但是，該事件不同于通過葉子感染測(cè)定鑒別出的陽性事件。以類似的方式，分析用實(shí)施例6c所述的遍在蛋白rcg1構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物。rt-pcr分析表明，28/30的轉(zhuǎn)基因事件包含預(yù)期的轉(zhuǎn)錄物帶，從而指示著遍在蛋白rcg1構(gòu)建體的表達(dá)。當(dāng)在來自30個(gè)事件中的每一個(gè)事件的5株植物上進(jìn)行葉子感染測(cè)定時(shí)，鑒別出單個(gè)事件，它表現(xiàn)出比對(duì)照植物統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少的疾病。通過莖感染測(cè)定，進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因植物。當(dāng)與缺少遍在蛋白rcg1基因的對(duì)照植物相對(duì)比時(shí)，發(fā)現(xiàn)3個(gè)事件表現(xiàn)出增加的對(duì)莖腐爛的抗性。這些轉(zhuǎn)基因事件不包含在葉斑病測(cè)定中鑒別出的從前的陽性事件。認(rèn)為這些試驗(yàn)的結(jié)果會(huì)支持表現(xiàn)出一些抗性、但是總體上由于幾個(gè)原因不確定的事件。在葉斑病測(cè)定中表現(xiàn)出增強(qiáng)的疾病抗性的陽性事件不能與通過莖感染測(cè)定鑒別出的那些相關(guān)聯(lián)。這與de811asr(bc5)陽性對(duì)照相反，后者在葉斑病和莖感染測(cè)定中表現(xiàn)出相對(duì)于de811明顯的抗性增加。另外，初級(jí)轉(zhuǎn)基因的測(cè)定表現(xiàn)出比de811或de811asr(bc5)對(duì)照的測(cè)定更高程度的變異性。這經(jīng)常在復(fù)制品以及陰性的對(duì)照事件中觀察到。后一種觀察結(jié)果可以使陽性和陰性事件的區(qū)別變得困難。疾病測(cè)定結(jié)果的不確定性質(zhì)的可能的原因包括、但不限于下述原因。本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，組織培養(yǎng)衍生出的轉(zhuǎn)基因植物，表現(xiàn)出比種子衍生的對(duì)照植物更大的植株間變異性。此外，初級(jí)轉(zhuǎn)化體(即通過實(shí)施例7所述的轉(zhuǎn)化和再生方法產(chǎn)生的植物)中的基因表達(dá)，由于組織培養(yǎng)操作的應(yīng)激，經(jīng)常是不可預(yù)測(cè)的。實(shí)際上，如果事件是陰性的(在這點(diǎn)上不能確定)，該情況是這樣有幾個(gè)技術(shù)原因。進(jìn)行的測(cè)定也不能確定rcg1基因編碼的蛋白是否實(shí)際上存在于轉(zhuǎn)基因系中——使用rt-pcr，僅能測(cè)定預(yù)測(cè)的mrna區(qū)段的存在。在轉(zhuǎn)化過程中可能將人為產(chǎn)物導(dǎo)入了基因盒——沒有進(jìn)行廣泛的dna印跡或測(cè)序來測(cè)定轉(zhuǎn)基因系中整個(gè)構(gòu)建體的完整性。為了更仔細(xì)地研究這些轉(zhuǎn)基因系，可以在野外條件下以更大的數(shù)目培養(yǎng)較后世代的植物，并測(cè)定疾病抗性。預(yù)期這些將來的轉(zhuǎn)基因植物將更清楚地表現(xiàn)出增加的對(duì)cg的抗性。實(shí)施例9種質(zhì)間rcg1基因分布的分析和rcg1序列變體的鑒別對(duì)rcg1鑒別、測(cè)序和精細(xì)作圖后，篩選其它系的rcg1基因。為了確定rcg1基因在其它玉米種質(zhì)中的存在，通過聚合酶鏈反應(yīng)，使用基因特異性的引物組合flp111f和flp111r以及flp113f和flpa1r來從玉米近交系(包括表18列出的那些系和f2834t)的不同組中擴(kuò)增基因組dna。僅在玉米近交系組的14株(包括mp305)中，檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物，從而表明rcg1基因在篩選的近交系中僅僅以非常小的百分比存在。因而，除了使用mp305或de811asr(bc5)作為供體來源以外，含有rcg1基因的其它來源也可以用作供體來源。例如，公開的含有rcg1基因的近交系tx601(可在id‘a(chǎn)mes22763’下從國(guó)家植物種質(zhì)系統(tǒng)(npgs)得到)和f2834t(可在id’ames27112’下從npgs得到)可以用作供體來源，與不含有rcg1基因的其它玉米近交系雜交，并使用本文所述的標(biāo)記來選擇rcg1基因。還鑒別了rcg1基因的變體，并分析單核苷酸多態(tài)性(snp)。在與413、958、971、1099、1154、1235、1250、1308、1607、2001、2598和3342中的一個(gè)或多個(gè)位置相對(duì)應(yīng)的序列id號(hào)1上的位置處，鑒別出snp。(參見表7)。并非rcg1基因的所有等位基因變體都指示著抗性表型。因此，這些snp可以用作標(biāo)記，來精確地鑒別和追蹤植物育種程序中的rcg1序列，和區(qū)別抗性和易感的等位基因變體。此外，這些snp表明，存在表現(xiàn)出抗性表型，且可以用于本文公開的方法和產(chǎn)物中的變體序列。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4種其它系含有rcg1等位基因：byd10、7f11、cml261和cml277。10株植物的測(cè)試沒有提供足夠的數(shù)據(jù)來明確地確定系7f11是否是抗性的。關(guān)于byd10、cml261和cml277系的抗性，沒有得到數(shù)據(jù)，且還沒有完成這些等位基因的測(cè)序。實(shí)施例10含有rcg1基因的系對(duì)炭疽病-誘導(dǎo)的葉斑病是抗性的使用下述方法，測(cè)試實(shí)施例1所述的近等基因系de811和de811asr對(duì)cg造成的葉斑病的抗性的差異。將4個(gè)普通的家用縫衣針粘貼到金屬支持物上，從而使線孔從金屬片延伸出來，所有4個(gè)針延伸相同的距離。將該裝置浸在5x106孢子/ml的cg孢子懸浮液中，然后使它穿過嫩玉米葉子的表面，從而使葉子受傷，同時(shí)給傷口接種孢子。將濕棉拭置于接種位點(diǎn)附近的中脈上，并給整個(gè)區(qū)域覆蓋塑料膜，在其上覆蓋反射布，二者都用帶子固定，以保持濕潤(rùn)和陰暗。在標(biāo)準(zhǔn)的溫室中，使植物保持在該狀態(tài)50-54小時(shí)，此后去除帶子、布和塑料膜。在接種后第7和15天，測(cè)量損傷的大小，并以平方厘米為單位記錄。圖10(a-b)顯示了所有各個(gè)葉子上在接種后15天的損傷大小分布。損傷大小在每個(gè)數(shù)據(jù)組中有變化，但是實(shí)際上所有de811葉子(圖10b)都具有比在de811asr(bc5)葉子上發(fā)現(xiàn)的最大損傷(圖10a)明顯更大的損傷大小。在圖11中，總結(jié)了接種后7天和15天數(shù)據(jù)組的數(shù)據(jù)。在7和15天時(shí)，攜帶rcg1基因的葉子上的平均損傷大小更小。隨著真菌有時(shí)間生長(zhǎng)并造成進(jìn)一步損傷，差異隨著時(shí)間推移變得更大，從而盡管在7天時(shí)差異是約2倍，但不遲于15天，差異超過4倍，且實(shí)際上真菌在de811asr(bc5)葉子上僅僅產(chǎn)生了微小的進(jìn)展。這些結(jié)果清楚地證實(shí)，含有rcg1基因的基因座的存在，賦予對(duì)炭疽病葉斑病的抗性。實(shí)施例11當(dāng)感染了禾生毛盤孢時(shí)，從de811asr(bc5)衍生的雜種系具有比從de811衍生的雜種更高的產(chǎn)量為了證實(shí)含有rcg1基因的玉米雜種在感染cg時(shí)具有比不含有rcg1的雜種系de811asr(bc5)和de811更高的產(chǎn)量潛力，將實(shí)施例1所述的等基因系分別與近交系b73ht和mo17ht雜交，后二者都對(duì)cg易感。在2005年，在美國(guó)的5個(gè)不同州的6個(gè)位置，培養(yǎng)雜種系，并評(píng)價(jià)對(duì)cg的反應(yīng)。對(duì)于每個(gè)雜種系，以約74,000株植物/公頃，一式三份地種植4行。在開花后約10天，在莖基部給植物接種cg。通過測(cè)定接種后4-5周對(duì)cg的反應(yīng)，評(píng)價(jià)每個(gè)4行樣地中的第一行，以確定接種是否成功。劈開莖，并通過觀察沿莖生長(zhǎng)時(shí)的真菌的特征黑色，對(duì)疾病的進(jìn)展評(píng)分。如jung等(1994)theoreticalandappliedgenetics，89：413-418)所述，進(jìn)行疾病分級(jí)。在前5個(gè)節(jié)間，記錄變色大于75％的節(jié)間的總數(shù)(antgr75)(參見圖20)。這提供從0至5的疾病評(píng)分，0表示沒有超過75％變色的節(jié)間，且5表示前5個(gè)節(jié)間完全變色。通過在生理成熟時(shí)合并收割中心的2塊樣地，并測(cè)定以kg/ha計(jì)的谷粒產(chǎn)量。對(duì)所有位置總結(jié)的結(jié)果顯示在圖12(對(duì)于疾病嚴(yán)重性)和圖13(對(duì)于產(chǎn)量)中。數(shù)據(jù)表明，含有rcg1的雜種(de811asr(bc5)/b73ht和de811asr(bc5)/mo17ht)具有比不含rcg1的雜種(de811/b73ht和de811/mo17ht)輕的多的疾病進(jìn)展。易感雜種(缺少rcg1)中疾病進(jìn)展的高評(píng)分顯示了cg實(shí)驗(yàn)的成功感染。此外，數(shù)據(jù)表明，當(dāng)感染cg時(shí)，含有rcg1的雜種具有比缺少rcg1的雜種更高的產(chǎn)量。單個(gè)的逐對(duì)對(duì)比的差異是顯著的，p＜0.05。這些結(jié)果清楚地證實(shí)，通過使用實(shí)施方案的方法，人們可以生成雜種，當(dāng)感染cg時(shí)，每公頃會(huì)產(chǎn)生更多kg的谷粒。實(shí)施例12從de811asr(bc5)或mp305衍生出的近交和雜種rcg1基因座轉(zhuǎn)變對(duì)禾生毛盤孢誘導(dǎo)的莖腐爛是抗性的為了證實(shí)可以使商業(yè)化的玉米系對(duì)cg-誘導(dǎo)的莖腐爛是抗性的，將mp305和de811asr(bc5)與ph87p、ph5w4和ph705雜交。將得到的后代再與相同的3個(gè)系(即，用作回交程序中的回歸親本的系)雜交另外3次，每次使用上面實(shí)施例5所述的分子標(biāo)記，選擇rcg1基因的存在。作為對(duì)照，還從相同的回交程序收集缺少rcg1基因的選擇的回交系。完成3次回交后，選擇幾個(gè)形式并自交，以得到bc3s1家族。將單個(gè)bc3s1植物進(jìn)行基因型分析，并使對(duì)rcg1純合陽性和純合陰性的植物自交，以得到bc3s2家族，然后將其進(jìn)行表型分析。在每行含有約25株植物的單行樣地中，種植含有rcg1的bc3s2形式，和作為對(duì)照的不含有該基因的選定形式。在美國(guó)5個(gè)不同州的5個(gè)不同位置種植試驗(yàn)，命名為位置1、2、3、4和5。在開花后約2周，在莖基部給植物接種cg。4-5周后，劈開莖，通過肉眼估計(jì)莖中的疾病量，評(píng)價(jià)疾病的進(jìn)展。基于接種節(jié)間和接種節(jié)間上面的4個(gè)節(jié)間中每個(gè)節(jié)間的感染程度，給每個(gè)莖分配視覺評(píng)分。低評(píng)分因而指對(duì)疾病的抗性。所有行和位置的匯集結(jié)果總結(jié)在圖14中。2個(gè)系的代表性圖片如圖15和16所示。數(shù)據(jù)表明，在所有位置，rcg1基因的存在使得每個(gè)原種近交系更抗疾病。賣給農(nóng)民的玉米種子是“雜種”，意味著它最常見地是2個(gè)近交親本雜交的結(jié)果，稱作單交雜種。多年的育種和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)已經(jīng)表明，單交雜種的使用產(chǎn)生更高的產(chǎn)量。因而，對(duì)于商業(yè)化應(yīng)用重要的是雜種植物(農(nóng)民的生產(chǎn)地中的那些)中的rcg1基因功能，甚至當(dāng)它存在于用于制備單交雜種種子的2個(gè)親本中的僅一個(gè)中時(shí)。因而，通過與不攜帶rcg1基因的原種近交ph4cv雜交，將已經(jīng)雜交進(jìn)rcg1系的近交系之一ph705用于制備雜種種子。將得到的雜種種子用于與上面討論的為近交系描述的試驗(yàn)相同的試驗(yàn)中，并以相同方式，在所有5個(gè)位置評(píng)分。在圖17中總結(jié)了所有位置的數(shù)據(jù)，它也顯示了近交ph705的性能，且代表性圖片顯示在圖18和19中。可以看出，在雜種ph705xph5w4的所有位置，和在ph705xph87p的5個(gè)位置，都觀察到疾病進(jìn)展的明顯差異。在第五個(gè)位置，環(huán)境條件對(duì)植物生長(zhǎng)是非常應(yīng)激的，從而導(dǎo)致植物處于差的條件下。在這些條件下，植物疾病抗性的測(cè)量經(jīng)常是不可靠的。近交系和含有rcg1的雜種組合的結(jié)果清楚地證實(shí)，使用實(shí)施方案的方法，人們可以制備商業(yè)上有用的抗cg-誘導(dǎo)的莖腐爛的系。實(shí)施例13rcg1編碼序列內(nèi)的標(biāo)記，rcg1基因座內(nèi)的標(biāo)記位置和設(shè)計(jì)，和用于側(cè)接染色體區(qū)域的單元型作為對(duì)rcg1基因精細(xì)作圖和克隆的結(jié)果，可以使用3個(gè)水平的標(biāo)記位置，在rcg1編碼序列內(nèi)設(shè)計(jì)的標(biāo)記、在鑒別rcg1基因座的非同線性區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)的標(biāo)記(但是在rcg1編碼序列外)和在側(cè)接同線性區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)的標(biāo)記。在rcg1編碼序列內(nèi)的標(biāo)記在對(duì)rcg1基因鑒別和精細(xì)作圖后，設(shè)計(jì)將對(duì)snp平臺(tái)起作用的雜交標(biāo)記。由于rcg1基因發(fā)生在玉米基因組的非同線性區(qū)域，所以雜交標(biāo)記將存在于包含rcg1基因的系中，且在不包含rcg1基因的系中不存在。這些標(biāo)記鑒別seqidno：1中列出的rcg1編碼序列特異的多核苷酸序列。如表7所示，存在含有seqidno：1所述的rcg1編碼序列變體的其它玉米系，且這些標(biāo)記也設(shè)計(jì)用于鑒別這些rcg1編碼序列變體。為此，生成來自不同來源的變體rcg1編碼序列的共有序列圖，如表7所示。該共有序列圖比對(duì)了從mp305分離的rcg1編碼序列的4209個(gè)堿基和來自phbtb的3451個(gè)堿基以及來自ph26t的3457個(gè)堿基。phbtb和ph26t中的rcg1基因表現(xiàn)出對(duì)炭疽病的抗性。接著，對(duì)包含nt(來自ncbi的公開可得的dna)的幾個(gè)數(shù)據(jù)庫blastrcg1編碼序列的區(qū)段，且將最高同源性命中值(hit)與rcg1共有序列比對(duì)，以確定與nbs-lrr家族中的其它抗性基因共有高同源性且具有共同區(qū)段的區(qū)段。選擇rcg1編碼序列特有的且在rcg1的不同來源共有的區(qū)域，用于標(biāo)記設(shè)計(jì)。具體地，由于flp111f和flp111r引物產(chǎn)生單個(gè)擴(kuò)增子，后者可靠地診斷出來自不同來源的rcg1的存在，所以靶向flp111f和flp111r雜交的區(qū)域，以用于開發(fā)snp標(biāo)記設(shè)計(jì)。使用來自含有2個(gè)引物位點(diǎn)的共有序列的1413bp區(qū)段，設(shè)計(jì)invadertm(thirdwavetechnologies，madison，wi)標(biāo)記，其中靶定引物區(qū)本身進(jìn)行探針和invadertm寡核苷酸雜交。在每個(gè)探針位點(diǎn)周圍設(shè)計(jì)引物，以產(chǎn)生大小小于150bp的擴(kuò)增子。該標(biāo)記指示著由于雜交具有熒光的rcg1編碼序列的存在，其中rcg1編碼序列的不存在導(dǎo)致沒有熒光。通過設(shè)計(jì)與第二個(gè)高度保守的玉米基因雜交的標(biāo)記，從而使得rcg1編碼序列的存在產(chǎn)生2種染料的熒光(rcg1和保守基因)，且rcg1的不存在產(chǎn)生僅保守基因的熒光，也可以產(chǎn)生對(duì)照熒光信號(hào)。通過區(qū)分實(shí)際上不存在rcg1的情形和由于反應(yīng)失敗已經(jīng)發(fā)生假陰性的情形，該“對(duì)照”熒光可以用于減少實(shí)驗(yàn)室誤差。這樣的標(biāo)記不限于特定的標(biāo)記檢測(cè)平臺(tái)。標(biāo)記(appliedbiosystems)也設(shè)計(jì)在相同的位置(引物對(duì)flp111f和flp111r)，其用作invadertm標(biāo)記。標(biāo)記顯示在表15和圖23和24中。在多種來源中測(cè)試標(biāo)記設(shè)計(jì)c00060-01-a和c00060-02-a，且其在鑒別含有rcg1基因座和rcg1基因的植物方面是非常成功的，無論rcg1基因座或rcg1基因的來源。還針對(duì)已知不攜帶該基因的接近100個(gè)不同的近交系的對(duì)照組，使用這些標(biāo)記，且在對(duì)照組中沒有檢測(cè)到熒光。證實(shí)了其中標(biāo)記設(shè)計(jì)c00060-01-a和c00060-02-a的一個(gè)或兩個(gè)含有rcg1的植物，包括表7所示的那些。因此，該實(shí)施例表明了，基于本文提供的教導(dǎo)，可以構(gòu)建出鑒別許多來源中的rcg1編碼序列的標(biāo)記。在rcg1基因座內(nèi)的標(biāo)記除了使用在rcg1編碼序列本身內(nèi)的標(biāo)記或作為替代，可以設(shè)計(jì)rcg1基因座的標(biāo)記。rcg1編碼序列和非同線性區(qū)域之間的緊密物理距離使得通過重組可喪失在非同線性區(qū)域內(nèi)、但是在rcg1編碼序列之外的標(biāo)記之間的連鎖為不可能。關(guān)于rcg1編碼序列的標(biāo)記，顯示存在或不存在的標(biāo)記足以鑒別出rcg1基因座。為了設(shè)計(jì)該區(qū)域的標(biāo)記，對(duì)包含rcg1基因的非同線性區(qū)域和在rcg1基因正北的區(qū)域的64,460bp區(qū)段進(jìn)行測(cè)序。將該序列中的bac分解成長(zhǎng)度為約800核苷酸的亞克隆，并測(cè)序。然后，裝配這些序列，以構(gòu)建bac序列，并鑒別基因區(qū)域和重復(fù)區(qū)域。鑒別出重復(fù)區(qū)域，以避免將標(biāo)記置于重復(fù)區(qū)域中。類似地，通過簡(jiǎn)單的blast搜索，可以容易地避免與已知的玉米序列具有高同源性的序列。避免含有ssr、a、t或g串的潛在序列，或會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生低gc含量(這會(huì)在invadertm平臺(tái)內(nèi)造成問題)的探針的潛在序列。參見圖9(b)和表17。然后將選擇的區(qū)段置于invadercreatortm軟件(thirdwave，madison，wi)中，其產(chǎn)生invadertm反應(yīng)的寡核苷酸。這生成所有snp的有義和反義設(shè)計(jì)。選擇具有最好評(píng)分且沒有罰分的有義設(shè)計(jì)。盡管已經(jīng)設(shè)計(jì)了這些標(biāo)記，但尚未測(cè)試它們。使用primer3(steverozen和helenj.skaletsky(2000)primer3availableontheworldwidewebforgeneralusersandforbiologistprogrammers見：krawetzs，miseners(eds)bioinformaticsmethodsandprotocols：methodsinmolecularbiology.humanapress，totowa，nj，pp365-386)，設(shè)計(jì)引物。選擇在invadertm組分之外的引物，并選擇長(zhǎng)度接近或小于150bp的優(yōu)選引物。將引物溫度和長(zhǎng)度調(diào)節(jié)至對(duì)invadertm平臺(tái)最有用，盡管如果使用其它檢測(cè)平臺(tái)，可以為在這樣平臺(tái)上的應(yīng)用優(yōu)化引物。在同線性區(qū)域中的標(biāo)記和相關(guān)的單元型緊密連鎖的側(cè)接rcg1基因座的標(biāo)記可以有效地用于選擇已經(jīng)遺傳了來自包含rcg1基因座的親本的rcg1基因座的后代植物。本文所述的標(biāo)記，例如表16上列出的那些，以及遺傳地或物理地作圖到相同染色體區(qū)段的其它標(biāo)記，可以用于選擇包含rcg1基因座的截短的染色體區(qū)段。一般地，將使用在該基因上邊的側(cè)接區(qū)中的這些標(biāo)記的集合(例如，2或更多個(gè)、3或更多個(gè)、4或更多個(gè)、5或更多個(gè))，和在該基因下邊的側(cè)接區(qū)中的類似集合。任選地，如上所述，也可以使用在rcg1基因和/或rcg1基因座內(nèi)的標(biāo)記。篩選親本和它們后代中的這些標(biāo)記集合，且在2個(gè)親本之間多態(tài)的標(biāo)記用于選擇。使用離rcg1基因或rcg1基因座最近的多態(tài)標(biāo)記來選擇該基因或基因座，且使用更遠(yuǎn)的多態(tài)標(biāo)記來對(duì)著該基因或基因座進(jìn)行選擇。在漸滲程序中，這允許選擇在更近的多態(tài)標(biāo)記處的rcg1基因或rcg1基因座基因型，和選擇在更遠(yuǎn)多態(tài)標(biāo)記處的回歸親本基因型。如上面實(shí)施例5中更詳細(xì)地描述的，該方法允許有效地選擇包含rcg1基因座的截短的染色體區(qū)段。上述方法需要在雜交中使用的親本基因型的知識(shí)。任選地，可以使用單元型，從而無需首先基因型分析在雜交中使用的特定親本，選擇rcg1基因或rcg1基因座。這是選擇rcg1基因座的高效方式，尤其在不使用在rcg1基因或rcg1基因座內(nèi)的標(biāo)記時(shí)。用標(biāo)記篩選要用于育種程序(例如基因漸滲程序)的所有植物?？梢允褂迷谙嗤旧w區(qū)段上的本文公開的標(biāo)記或等價(jià)標(biāo)記。注意到植物單元型(連鎖不平衡的一系列snp或其它標(biāo)記)。將在rcg1基因座周圍的抗性植物的單元型與要使用的不包含rcg1基因座的其它植物的單元型相對(duì)比。然后，將在rcg1基因座周圍的抗性植物特有的單元型用于選擇，且該單元型將特異性地鑒別來自含有rcg1基因座的抗性植物的染色體區(qū)段?；趍p305和數(shù)百個(gè)玉米系(包括表18所示的50個(gè)公開可得的玉米系)的不同集合的分析，鑒別出含有rcg1基因座的mp305染色體區(qū)段的特有snp單元型。該snp單元型獨(dú)特地鑒別出在mza3434、mza2591和mza11123中延伸的mp305染色體區(qū)段。參見圖22，seqidno：140、141和142，和表8、9和10。首先，將表2所述的這3個(gè)mza的引物對(duì)用于鑒別單元型。引物對(duì)mza3434e正向和反向用于擴(kuò)增玉米系集合的基因組dna。通過用mza3434i正向和反向引物對(duì)擴(kuò)增，進(jìn)一步純化pcr片段。對(duì)于mza2591和mza11123，重復(fù)該過程。在正向和反向方向測(cè)序得到的pcr片段，并比對(duì)序列，以產(chǎn)生共有序列(參見seqidno：140、141和142所述的序列)。在表8、9和10中，顯示了在這些共有序列內(nèi)的snp和插入/缺失。在基因型集合中，對(duì)比這些snp和插入/缺失。關(guān)于mza3434，單元型8是罕見的單元型等位基因，且是mp305和僅一個(gè)其它玉米系特有的。對(duì)于mza2591，重復(fù)該過程，且發(fā)現(xiàn)mp305在mza2591處具有單元型2，僅2個(gè)其它玉米系共有它。mp305是具有在mza3434處的單元型8和在mza2591處的單元型2的唯一玉米系，且因此，這2個(gè)單元型(在mza3434處的單元型8和在mza2591處的單元型2)的組合，獨(dú)特地鑒別包含rcg1基因座的mp305染色體區(qū)域。mp305也具有在mza11123處的可提供信息的單元型。發(fā)現(xiàn)mp305具有單元型7，它是66個(gè)其它玉米系共有的，但是這些玉米系都不具有在mza3434處的單元型8或在mza2591處的單元型2。因此，在mza3434、mza2591或mza11123處的2個(gè)單元型的任意組合，可以用于獨(dú)特地鑒別這些基因型中的mp305。然后，可以通過對(duì)片段測(cè)序或通過設(shè)計(jì)片段內(nèi)的每個(gè)snp或插入/缺失的標(biāo)記，查詢單元型。單元型內(nèi)的多態(tài)性可以用于標(biāo)記單元型。所謂的‘標(biāo)記-snp’或‘單元型-標(biāo)記’在植物育種中是非常有用的，因?yàn)橥ㄟ^外推到單元型，可以確定比多態(tài)性本身更多的信息。單元型也可以定義為序列之間的一系列多態(tài)性，且它們可以稱作‘大范圍單元型’。在可以用作‘單元型標(biāo)記’的單元型內(nèi)，觀察到了罕見的多態(tài)性。例如，snpmza2591.32(等位基因c)或mza2591.35(等位基因t)可以用于標(biāo)記在mza2591處的單元型2，且與單元型2一樣，二者都是mp305和2個(gè)其它玉米系獨(dú)有的。snpmza2591.32(等位基因c)和與mza3434.17(等位基因c)相組合的mza2591.35(等位基因t)的組合，產(chǎn)生‘大范圍’單元型，其可以用于區(qū)分mp305和研究中的所有其它基因型。另外，其它標(biāo)記mza15842、mza11455、mza8761和mza1851也表現(xiàn)出與mp305的多態(tài)性。對(duì)于mza15842，其它玉米系中僅有18個(gè)共有與mp305相同的單元型；對(duì)于mza11455，其它玉米系中僅有43個(gè)共有與mp305相同的單元型；對(duì)于mza8761，其它玉米系中僅有約一半共有與mp305相同的單元型；且對(duì)于mza1851，其它玉米系中僅有約一半共有與mp305相同的單元型。開發(fā)這些標(biāo)記的共有序列，且如seqidno：143-146所述。這些共有序列內(nèi)的snp和插入/缺失如表11-14所示。使用mza標(biāo)記的獨(dú)特單元型的4個(gè)實(shí)例是：mza11123(單元型7)mza15842(單元型3)mza8761(單元型1)和mza11123(單元型7)mza15842(單元型3)mza1851(單元型1)和mza11455(單元型6)mza11123(單元型7)mza15842(單元型3)mza16510(單元型4)和mza11455(單元型6)mza11123(單元型7)mza15842(單元型3)mza11394(單元型6)。本文公開的所有標(biāo)記的多個(gè)組合、或該區(qū)域內(nèi)的其它標(biāo)記，也含有鑒別rcg1基因座的獨(dú)特單元型。表16：包含在定義的染色體區(qū)間內(nèi)的可以用于選擇rcg1的標(biāo)記公開可得的標(biāo)記取自ibm2相鄰4圖，而通過作圖到相同遺傳學(xué)圖上，和通過在物理圖上的位置，確定pioneer標(biāo)記(前綴‘mza’)的相對(duì)位置。表18：用于單元型分析的公開可得系的列表38-11co109mp305a165d02n28a188d146oh07a509f2oh40ba556f252oh43a619f257oh45a632f283os420bf7os426b14gt119pa91b37h84r159b42h99sc213rb64hato4sd105b73hysrs303b84indianah60t232b89k187-11217tr9-1-1-6b94k55tx601c103l1546v3c106l317w153rc166minn49wf9cm49mo13cm7mo17當(dāng)前第1頁12