本發(fā)明涉及一種藥物組合物，具體涉及抗耐藥真菌的藥物組合物。
背景技術：
白色念珠菌是臨床最常見的機會致病性真菌，約占所有醫(yī)院真菌感染的50-60％。系統(tǒng)性念珠菌感染死亡率高達38％。作為機會致病菌，白念珠菌感染主要發(fā)生在免疫功能低下的人群，如艾滋病患者、腫瘤放化療、糖尿病和使用免疫抑制劑的患者。氟康唑為廣譜抗真菌藥，因其生物利用度高、體內(nèi)分布廣、不良反應少、價格便宜，是臨床治療念珠菌感染的一線用藥。現(xiàn)在白念珠菌90％的菌株具有不同程度的耐藥性，成為臨床上治療失敗的主要原因。
來氟米特(1eflunormide，LEF)是一種具有抗增殖作用的異唑類免疫調(diào)節(jié)劑，它通過抑制嘧啶從頭合成途徑中二氫乳酸脫氫酶(DHODH)的活性從而影響嘧啶的合成，使增生活躍的T、B淋巴細胞等受到抑制，減少免疫球蛋白的產(chǎn)生，阻止IL-1、IL-6、TNF-α的釋放，抑制免疫性炎癥反應，防止骨破壞，改善患者的生活質(zhì)量。目前，來氟米特已經(jīng)在風濕病得到廣泛應用，療效肯定。最近的研究顯示，來氟米特是目前中國國內(nèi)治療類風濕關節(jié)炎使用率最高的抗風濕藥。
重癥細菌感染及系統(tǒng)性真菌感染是影響風濕病患者預后的重要因素，其感染高發(fā)與自身免疫功能紊亂、激素及免疫抑制劑使用等有關。所以，臨床上迫切需要找到一種能與抗真菌藥有協(xié)同抗菌作用的抗風濕藥，以期在真菌感染時與抗真菌藥聯(lián)合使用既能控制風濕病情，又能起到輔助抗真菌藥物的作用。
對于藥物間的協(xié)同作用可使用體外抗真菌藥敏實驗、棋盤式微量稀釋法聯(lián)合藥敏實驗以及時間-殺菌曲線實驗，發(fā)現(xiàn)并驗證兩藥協(xié)同作用。
參照1997年美國國家臨床試驗標準化委員會(NccLs)提出的標準J(M27-A方案)，棋盤式微量稀釋法(checkerboard microdilution assay)是體外藥敏實驗的延伸，具有操作過程簡單、重復性好等優(yōu)點，其不足之處為工作量較大，但此方法在抗生素間相互作用的研究中應用較多，也是目前研究抗真菌藥物間相互作用最常用的體外實驗方法。
部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)是評價聯(lián)合用藥的兩藥相互作用方式的主要參數(shù)。當FICI≤0.5時，兩藥的相互作用為協(xié)同，F(xiàn)ICI指數(shù)越小，協(xié)同作用越強。
時間-殺菌曲線(Time-kill curves)是常用的體外研究抗真菌藥物間相互作用的方法，它評價了RPMI1640培養(yǎng)液中各種藥物在特定時間內(nèi)的殺菌程度。根據(jù)時間-殺菌曲線，當菌濃度比起始菌濃度降低99.9％時，即相差≥3log10時確定為殺菌活性；當生長降低<99.9％時判定為抑菌活性。藥物作用24小時后，與兩種藥物中單用抗真菌活性最強者相比，兩藥合用后抗真菌活性的增強≥2log10CFU/ml時確認兩藥具有協(xié)同作用，至少聯(lián)合用藥中一種藥物的濃度在其單獨應用同一濃度時對生長曲線沒有影響。兩藥合用后抗真菌活性的降低≥2log10CFU/ml時則認為兩藥具有拮抗作用。當兩藥合用后與單用抗真菌活性較強者的活性差別<2log10CFU/ml時，兩藥的相互作用劃歸為無關。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有抗耐藥真菌藥物所存在的問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種具有協(xié)同抗耐藥真菌的藥物組合物，以提高抗菌效果。
在此基礎上，本發(fā)明還進一步提供該藥物組合物的制備方法，以及相應的應用。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下的技術方案：
方案1：一種具有協(xié)同抗耐藥真菌的藥物組合物，所述藥物組合物由來氟米特和抗真菌藥組成。
優(yōu)選的，所述來氟米特和抗真菌藥的配比為1:8-1:12。
優(yōu)選的，所述抗真菌藥為吡咯類抗真菌藥，優(yōu)選氟康唑、伊曲康唑或氟利康唑。
優(yōu)選的，所述藥物組合物呈液體形式、呈粉末形式、呈顆粒形式、呈固體形式、呈膠囊形式或呈片劑形式。
優(yōu)選的，所述藥物組合物中來氟米特和抗真菌藥協(xié)同抗真菌的部分抑菌濃度指數(shù)FICI<0.078。
方案2：一種具有協(xié)同抗耐藥真菌的藥物組合物的制備方法，由來氟米特和抗真菌藥按比例混合而成。
優(yōu)選的，來氟米特和抗真菌藥的配比為1:8-1:12。
方案3：來氟米特和抗真菌藥的組合在制備抗菌藥物中的應用。
優(yōu)選的，每天按比例口服來氟米特和抗真菌藥。
本發(fā)明中提供的方案通過來氟米特和抗真菌藥之間的協(xié)同作用有效提高抗耐藥真菌的效果。
再者，基于本方案能夠得到能與抗真菌藥有協(xié)同抗菌作用的抗風濕藥，以期在真菌感染時與抗真菌藥聯(lián)合使用既能控制風濕病情，又能起到輔助抗真菌藥物的作用。
附圖說明
以下結合附圖和具體實施方式來進一步說明本發(fā)明。
圖1為本發(fā)明實例中時間-殺菌曲線示意圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發(fā)明。
針對背景技術部分所闡述的問題，本發(fā)明人通過大量的實驗和創(chuàng)造性勞動，發(fā)現(xiàn)來氟米特與抗真菌藥具有很好的協(xié)同作用。
以下以來氟米特協(xié)同氟康唑抗耐藥白色念珠菌為例，具體說明一下兩藥協(xié)同作用。
本實例中主要采用棋盤式微量稀釋法進行來氟米特與氟康唑之間相互協(xié)同作用的體外研究。
其中，使用體外抗真菌藥敏實驗、棋盤式微量稀釋法聯(lián)合藥敏實驗發(fā)現(xiàn)來氟米特與氟康唑能夠協(xié)同抗耐藥白色念珠菌，使用時間-殺菌曲線實驗，驗證兩藥協(xié)同作用。
本實例中針對來氟米特協(xié)同氟康唑抗耐藥白色念珠菌實驗主要包括兩部分：體外藥敏試驗和時間-殺菌曲線實驗。
其中，體外藥敏試驗的過程如下：
一、藥物母液配制：
這里配置的藥物母液主要包括：基于DMSO配制的32mg/ml的氟康唑溶液，基于DMSO配制的20mg/ml的來氟米特溶液。
二、真菌懸液配制，其配置過程如下：
(1)將臨床耐藥白色念珠菌以1:100接種至1mlYEPD培養(yǎng)液，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，活化16h，使真菌處于指數(shù)生長期后期。
(2)取經(jīng)上述方式培養(yǎng)的菌液至1mlYEPD培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化，16h后，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，以RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×103～5×103cFu/m1。
三、單獨藥敏試驗
(1)取無菌96孔細胞培養(yǎng)板(后簡稱無菌96孔板)，于B～G排1號孔加RPMI-1640液體培養(yǎng)基100μl作空白對照；3～12號孔各加新鮮配制的真菌懸液(以下簡稱菌液)100μl；2號孔加入菌液196.8μl；12號孔不含藥物，只加菌液100μl作陽性生長對照。
(2)于無菌96孔板的B～D排第2孔加入20mg/ml的來氟米特母液3.2μl，E～G排第2孔加入32mg/ml的氟康唑母液3.2μl。對B～G排的2～11號孔進行二倍的倍比稀釋。
這里的倍比稀釋的具體方法是取2號孔藥物與菌液的混勻液100ul加入3號孔中，3號孔混勻后取100ul加入4號孔，4號孔混勻后取100ul加入5號孔，以此類推，最后每孔的藥物濃度是下一孔的2倍。
由此使得，B～D排各孔來氟米特的最終藥物濃度分別為320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml；
E～G排各孔氟康唑的最終藥物濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1μg/ml；
且各孔中DMSO含量均低于2％。
四、聯(lián)合藥敏試驗(棋盤式微量稀釋試驗)
(1)取8根無菌玻璃試管，依次編號為A、B、C、D、E、F、G，A試管加新鮮配制的真菌懸液3992μl和32mg/ml的氟康唑母液8ul，B～G試管各加入真菌懸液2000ul；對A～G試管進行二倍的倍比稀釋，使得氟康唑的終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml。
(2)取無菌96孔細胞培養(yǎng)板，A排2號孔加入A試管懸液198.4ul，3～11號孔各加A試管懸液100ul；B排2號孔加入A試管懸液198.4ul，3～11號孔各加B試管懸液100ul；C排2號孔加入A試管懸液198.4ul，3～11號孔各加C試管懸液100ul；剩余D～G排的2～11號孔亦按上述方法加入相應試管的懸液；每排2號孔各加20mg/ml的來氟米特母液1.6μl；每排1號孔各加RPMI-1640液體培養(yǎng)基100μl作空白對照，每排12號孔各加新鮮配制的真菌懸液100μl作陽性生長對照。對A～G排的2～11號孔進行二倍的倍比稀釋；至此，在96孔板上氟康唑與來氟米特以二維棋盤的縱(A排至H排)、橫(2號孔至11號孔)兩方向分別進行二倍的倍比稀釋，使得氟康唑的終濃度為64、32、16、8、4、2、1、0.5μg/ml，來氟米特的終濃度為160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/ml，各孔中DMSO含量均低于2％。
五、每次配制藥敏板(包括單獨藥敏試驗和聯(lián)合藥敏試驗形成的藥敏板)的同時均配制一質(zhì)控菌藥敏板。這里的質(zhì)控菌藥敏板配制方法同上，只使用敏感菌，用于鑒定藥物是抗真菌藥，對敏感菌有效。
六、將各藥敏板(每次配制藥敏板和對應的質(zhì)控菌藥敏板)于35℃恒溫箱，培養(yǎng)48小時后，用酶標分析儀于600nm測各孔OD值。
七、最低抑菌濃度(MIC值)的判定：與陽性對照孔比，以OD值下降80％以上的最低濃度孔中的藥物濃度為MIC80(真菌生長80％被抑制時的藥物濃度)。
八、計算部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)：FICI＝CMI氟康唑(聯(lián)合)/CMI氟康唑(單藥)+CMI來氟米特(聯(lián)合)/CMI來氟米特(單藥)。當FICI≤0.5時，兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用，且FICI指數(shù)越小，協(xié)同作用越強；0.5<FICI≤4時認為兩藥之間作用無關；當FICI>4時兩藥產(chǎn)生拮抗作用。
參見表1，其所示為基于上述的體外藥敏試驗方案進行多項的試驗實例和結果。
表1
該表表明來氟米特聯(lián)合氟康唑?qū)Χ喾N耐藥白念菌有效,且FICI非常小，即表示協(xié)同作用非常強。
對此，本實例進一步使用時間-殺菌曲線實驗，驗證兩藥協(xié)同作用。
其中，時間-殺菌曲線實驗過程如下：
1、將臨床耐藥白色念珠菌以1:100接種至1mlYEPD培養(yǎng)液，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，活化16h，使真菌處于指數(shù)生長期后期。
2、取該菌液至1mlYEPD培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化，16h后以RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋并調(diào)整菌液濃度至1×103～5x103cFu/m1的菌液。
3、將得到的1×103～5x103cFu/m1的菌液各分四份，每份20ml菌液，分別加入氟康唑16μg/ml、來氟米特80μg/ml、16μg/ml氟康唑合用來氟米特80μg/ml、空白對照加入相同體積的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5％。于30℃孵箱中，以200rpm振蕩培養(yǎng)。
4、分別于0、12、24、36和48小時后，所有菌液中各取100μl液體，再以0.9％生理鹽水10倍系列稀釋之，從不同稀釋倍數(shù)的菌液中各取100μl均勻涂鋪于含SDA固體培養(yǎng)基表面。
5、SDA平皿于30℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后計數(shù)菌落數(shù)目，以平皿上生長菌落數(shù)達20個為最低限。計算菌落形成單位(CFU)，以log10CFU/ml對時間作曲線。
6、聯(lián)合用藥的效果評價：根據(jù)時間-殺菌曲線，當菌濃度比起始菌濃度降低99.9％時，即相差≥3log10時確定為殺菌活性；當生長降低<99.9％時判定為抑菌活性。
藥物作用24小時后，與兩種藥物中單用抗真菌活性最強者相比，兩藥合用后抗真菌活性的增強≥2log10CFU/ml時確認兩藥具有協(xié)同作用，至少聯(lián)合用藥中一種藥物的濃度在其單獨應用同一濃度時對生長曲線沒有影響。
兩藥合用后抗真菌活性的降低≥2log10CFU/ml時則認為兩藥具有拮抗作用。
當兩藥合用后與單用抗真菌活性較強者的活性差別<2log10CFU/ml時，兩藥的相互作用劃歸為無關。
參見圖1，其所是基于103菌株進行時間-殺菌曲線實驗得到的時間-殺菌曲線，其中菌液起始濃度103CFU/ml，LEF(來氟米特80ug/ml)，F(xiàn)CZ(氟康唑16ug/ml)。
由圖可知，菌濃度比起始菌濃度降低99.9％時，即相差≥3log10，可確定為殺菌活性。藥物作用24小時后，與兩種藥物中單用抗真菌活性最強者氟康唑相比，兩藥合用后抗真菌活性的增強≥2log10CFU/ml，可確認兩藥具有協(xié)同作用。
本方案中通過使用體外抗真菌藥敏實驗、棋盤式微量稀釋法聯(lián)合藥敏實驗發(fā)現(xiàn)來氟米特與氟康唑能夠協(xié)同抗耐藥白色念珠菌，在此基礎上進一步使用時間-殺菌曲線實驗，驗證兩藥協(xié)同作用。
其中，棋盤式微量稀釋法(checkerboard microdilution assay)是體外藥敏實驗的延伸，以此來進行來氟米特與氟康唑之間相互作用的體外研究。
本方案中通過部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)作為評價聯(lián)合用藥的兩藥相互作用方式的主要參數(shù)，當FICI≤0.5時，兩藥的相互作用為協(xié)同，F(xiàn)ICI指數(shù)越小，協(xié)同作用越強。
本方案中進一步采用時間-殺菌曲線(Time-kill curves)來進一步體外研究抗真菌藥物間相互作用，由此評價RPMI1640培養(yǎng)液中各種藥物在特定時間內(nèi)的殺菌程度。根據(jù)時間-殺菌曲線，當菌濃度比起始菌濃度降低99.9％時，即相差≥3log10時確定為殺菌活性；當生長降低<99.9％時判定為抑菌活性。藥物作用24小時后，與兩種藥物中單用抗真菌活性最強者相比，兩藥合用后抗真菌活性的增強≥2log10CFU/ml時確認兩藥具有協(xié)同作用，至少聯(lián)合用藥中一種藥物的濃度在其單獨應用同一濃度時對生長曲線沒有影響。兩藥合用后抗真菌活性的降低≥2log10CFU/ml時則認為兩藥具有拮抗作用。當兩藥合用后與單用抗真菌活性較強者的活性差別<2log10CFU/ml時，兩藥的相互作用劃歸為無關。
基于上述的實驗實例，可以確定來氟米特與氟康唑具有協(xié)同抗耐藥白色念珠菌的效果。
在此實驗方案的基礎上，這里的氟康唑可以由其它吡咯類抗真菌藥替換，如伊曲康唑或氟利康唑等。
在此基礎上，本發(fā)明方案可進一步形成具有協(xié)同抗耐藥真菌的藥物組合物，該藥物組合物由來氟米特和氟康唑等吡咯類抗真菌藥組成。
其中，抗真菌藥可根據(jù)實際需求而定，且來氟米特和抗真菌藥的在1:8-1:12之間，優(yōu)選1:10，以期達到最優(yōu)的協(xié)同效果。
另外，在此基礎上進一步研究確定，由來氟米特與抗真菌藥形成的具有協(xié)同抗耐藥真菌的藥物組合物，其針對的抗耐藥真菌除上述實例中的白色念珠菌外，對其它的系統(tǒng)性真菌同樣也具有協(xié)同作用。
由此形成的藥物組合物根據(jù)需要可呈液體形式、呈粉末形式、呈顆粒形式、呈固體形式、呈膠囊形式或呈片劑形式。
針對該藥物組合物在具體制備時，由來氟米特與氟康唑等吡咯類抗真菌藥按照配比直接混合而成。
由于這兩種藥物都是用于治療風濕病及真菌感染的藥物，由這兩種形成的具有協(xié)同抗耐藥真菌的藥物組合物，在風濕病基礎上罹患真菌感染時使用，既能控制風濕病情，又能起到輔助抗真菌藥物的作用。
由此形成的藥物組合物在使用時，按照臨床治療劑量使用，來氟米特20mg1/日、氟康唑200mg1/日口服，通過來氟米特與氟康唑協(xié)同作用，既能控制風濕病情，又能起到輔助抗真菌。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。