一種水稻微生物耐藥性基因的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種水稻微生物耐藥性基因的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗生素類藥物廣泛應用于防治水稻病害，目前水稻病害在防治過程中，濫用抗生 素類藥物現(xiàn)象十分普遍，導致病原微生物進化出耐藥性基因，產(chǎn)生耐藥性，使得抗生素類藥 物在防治水稻病害時失效。因此，需要針對水稻中微生物耐藥性基因針對性地用藥，W避免 病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時，減少農(nóng)藥用量，降低成本。
[0003] 現(xiàn)有的檢測耐藥性基因的方法包括:預估待測樣品上攜帶的需要檢測的耐藥性基 因的病原菌，分離并純化該病原菌，通過PCR(Polymease化ain Reaction,聚合酶鏈式反 應）引物擴增該耐藥性基因，利用電泳或?qū)崟r定量PCR方法逐一判斷待測樣品中是否存在需 要檢測的耐藥性基因。
[0004] 在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在W下問題中的一種：
[0005] 需要培養(yǎng)、分離和純化病原菌，使得檢測的時間較長，延誤治療時機;無法檢測不 可培養(yǎng)的耐藥菌中的耐藥性基因；一次只能針對一種或少數(shù)幾種病原菌進行檢測；一次只 能檢測一種或少數(shù)幾種耐藥性基因，不能檢測到待測樣品中所有的耐藥性基因，不能給予 用藥所需的全面信息;不能實現(xiàn)耐藥性基因的定量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測耐藥性基因的方法有待提高的問題，本發(fā)明實施例提供 了一種水稻微生物耐藥性基因的檢測方法。所述技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明實施例提供了一種水稻微生物耐藥性基因的檢測方法，所述方法包括：
[000引確定待測樣品中需要檢測的微生物的耐藥性基因、所述待測樣品中的內(nèi)源標準基 因和所述待測樣品的外源標準基因，所述待測樣品為整株水稻植株或部分所述水稻植株；
[0009] 制備用于擴增所述耐藥性基因、所述內(nèi)源標準基因和所述外源標準基因的測試區(qū) 域的多重擴增引物；
[0010] 提取所述待測樣品的基因組；
[0011] 向所述待測樣品的基因組中加入所述外源標準基因，獲得混合核酸；
[0012] 利用所述多重擴增引物對所述混合核酸進行擴增，得到擴增產(chǎn)物，利用所述擴增 產(chǎn)物構(gòu)建高通量測序文庫；
[0013] 對所述高通量測序文庫進行高通量測序，得到測序片段組；
[0014] 分析所述測序片段組，獲得所述待測樣品中所述耐藥性基因的測序片段的數(shù)量、 所述內(nèi)源標準基因的測序片段的數(shù)量和所述外源標準基因的測序片段的數(shù)量；
[0015] 根據(jù)所述外源標準基因的測序片段的數(shù)量和所述內(nèi)源標準基因的測序片段的數(shù) 量，判斷實驗是否成功；
[0016] 若所述實驗成功，則計算所述待測樣品中所述耐藥性基因的含量；
[0017] 根據(jù)所述耐藥性基因的含量判定所述待測樣品是否含有耐藥性基因。
[0018] 具體地，所述耐藥性基因至少為1個，所述內(nèi)源標準基因至少為1個，所述外源標準 基因至少為1個。
[0019] 具體地，所述內(nèi)源標準基因為所述待測樣品的微生物中的基因。
[0020] 具體地，所述外源標準基因不存在于已知基因組的生物中。
[0021] 具體地，用于擴增所述耐藥性基因的引物的設(shè)計區(qū)域或擴增區(qū)域與所述待測樣品 中的生物的基因組的其它區(qū)域的所有生物的基因組上除耐藥性基因外的其它區(qū)域的同源 性低于98%。
[0022] 具體地，所述判斷實驗是否成功的方法為：當所述外源標準基因的測序片段的數(shù) 量和所述內(nèi)源標準基因的測序片段的數(shù)量均含α1時，則實驗成功；當所述外源標準基因的 測序片段的數(shù)量或所述內(nèi)源標準基因的測序片段的數(shù)量<α1時，則實驗失敗;其中，α1為判 定闊值。
[0023] 具體地，計算所述待測樣品中所述耐藥性基因的含量的方法為:第m種所述耐藥性 基因的含量的計算公式關(guān)
其中，i為第m種所述耐藥性基因的第i 個測試區(qū)域，nl為所述第m種所述耐藥性基因的測試區(qū)域的個數(shù)，bi為所述第m種耐藥性基 因的第i個測試區(qū)域的測序片段的數(shù)量，k為第k種所述內(nèi)源標準基因，n3為所述內(nèi)源標準基 因的個數(shù)，j為第k種所述內(nèi)源標準基因的第j個測試區(qū)域，n2為第k種所述內(nèi)源標準基因的 測試區(qū)域的個數(shù)，aj為第k種所述內(nèi)源標準基因的第巧巾測試區(qū)域的測序片段的數(shù)量;N為所 有所述內(nèi)源標準基因的測試區(qū)域的總數(shù)。
[0024] 具體地，判定所述待測樣品中是否含有所述耐藥性基因的方法為:所述耐藥性基 因的含量含α2時，判定所述待測樣品含有所述耐藥性基因；當所有所述耐藥性基因的含量< 口 2時，判定所述待測樣品不含有所述耐藥性基因；其中，α2為判定闊值。
[0025] 具體地，所述方法還包括：向所述待測樣品中加入所述多重擴增引物不能擴增的 外源核酸，將所述外源核酸與所述待測樣品的基因組一同提取。
[0026] 具體地，所述外源標準基因的質(zhì)量與所述待測樣品的基因組的總質(zhì)量的比例大于 1/100000。
[0027] 本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明實施例提供的方法可W 在不需要培養(yǎng)與純化的前提下，一次性的、定量的、快速的、準確的檢測任意數(shù)量和類型的 微生物中的任意多種希望檢測的耐藥性基因，可W給予用藥所需的全面信息。
【具體實施方式】
[0028] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施方式作進一 步地詳細描述。
[0029] 實施例
[0030] 水稻微生物的耐藥性基因檢測
[0031] 待測樣品可W為整株水稻植株或部分水稻植株，本實施例中待測樣品為水稻葉 片，本實施例中使用的水稻葉片取自武漢濁口開發(fā)區(qū)的水稻田，檢測其中的微生物的耐藥 性基因是為了針對性地對水稻病害用藥，避免耐藥性的產(chǎn)生，同時，減少不必要的用藥，節(jié) 約成本。本實施例包括如下步驟：
[0032] 步驟1、確定待測樣品中需要檢測的微生物的耐藥性基因、待測樣品中的內(nèi)源標準 基因和待測樣品的外源標準基因，具體方法如下：
[0033] 其中，耐藥性基因至少為1個，內(nèi)源標準基因至少為1個，外源標準基因至少為1個。 內(nèi)源標準基因為待測樣品的微生物中的基因。外源標準基因不存在于已知基因組的生物 中。
[0034] 本實施例中的耐藥性基因抗青霉素、β-內(nèi)酷胺酶、頭抱菌素酶、卡那霉素和新霉 素，其中，耐藥性基因 APH(3'）-Ia同時抗卡那霉素和新霉素。本實施例中內(nèi)源標準基因為1 種，具體地，內(nèi)源標準基因為核糖體rRNA基因，該核糖體rRNA基因存在于絕大部分生物中且 具有保守區(qū)域。在本實施例中，外源標準基因為巧巾，具體地，外源標準基因為邸CC-00004基 因，其在NCBKht化://www.ncbi .nlm.nih.gov)上進行同源比對時，未發(fā)現(xiàn)其在已知生物參 考基因組中存在同源序列，即外源標準基因不存在于已知的生物基因組中。表1為本實施例 中被檢測基因相關(guān)信息與檢測結(jié)果，在表1中耐藥性基因名稱與序列編號與抗生素耐藥性 數(shù)據(jù)庫（CRAD:The Comprehensive Antibiotic Resistance Datab ase，網(wǎng)址為 a巧card.mcmaster. ca/)中的名稱與序列編號一致。
[0035] 表1為本實施例中被檢測基因相關(guān)信息與檢測結(jié)果
[0036]
[0037]
[003引表1中'7'表示無。
[0039] 步驟2、制備用于擴增耐藥性基因、內(nèi)源標準基因和外源標準基因的測試區(qū)域的多 重擴增引物，具體方法如下：
[0040] 選擇耐藥性基因的保守區(qū)域設(shè)計多重擴增引物；用于擴增耐藥性基因的引物的設(shè) 計區(qū)域或擴增區(qū)域與待測樣品中的生物的基因組的其它區(qū)域的同源性低于98%，運一要求 確保了耐藥性基因的檢測不受待測樣品中的生物的基因組的其它區(qū)域的干擾。具體地，耐 藥性基因的引物的設(shè)計區(qū)域在不同變體間是保守的，運樣才能保證用相同的引物可W擴增 出相同的耐藥性基因的不同變體，若耐藥性基因的引物的設(shè)計區(qū)域與待測樣品中的生物的 基因組的其它區(qū)域的同源性低于98%，則該引物不會擴增其它區(qū)域，因此，不會干擾耐藥性 基因的檢測。否則，要求耐藥性基因的引物的擴增區(qū)域與待測樣品中的生物的基因組的其 它區(qū)域的同源性低于98%，運樣，獲得的擴增產(chǎn)物可W與耐藥性基因相區(qū)分，同樣不會干擾 耐藥性基因的檢測。同時，多重擴增引物中每對引物的擴增效率均在95%~105%之間。
[0041] 具體地，在抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫中下載表