牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛奶品中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 牛奶是最古老的天然飲料之一，也是現(xiàn)代人類生活中不可或缺的高營養(yǎng)價值食 品。目如，我國乳制品彳丁業(yè)發(fā)展迅速，2012年我國液態(tài)乳制品消費(fèi)量約達(dá)2200萬噸，乳品生 產(chǎn)技術(shù)和設(shè)備更新快，市場競爭激烈。同發(fā)達(dá)國家相比，我國在規(guī)模、技術(shù)、產(chǎn)品質(zhì)量方面都 存在較大差距，外國品牌進(jìn)入中國市場給本土產(chǎn)業(yè)造成很大沖擊。產(chǎn)品質(zhì)量方面的差距，宄 其根本原因是原料奶質(zhì)量參差不齊，我國目前80 %是手工擠奶，奶牛的散養(yǎng)和個體戶不注 意奶牛疫病防治，導(dǎo)致原料奶細(xì)菌超標(biāo)、抗生素含量過高等問題突出，嚴(yán)重制約著乳制品質(zhì) 量的提尚。
[0003] 對于依賴于市場的企業(yè)來說，乳品的質(zhì)量安全事關(guān)乳品企業(yè)的生死存亡。近年來， 食品變質(zhì)和食物中毒事件屢有發(fā)生，不斷有一些企業(yè)倒臺或者遭到重創(chuàng)，也嚴(yán)重削弱了消 費(fèi)者對國內(nèi)食品企業(yè)的信心，對整個行業(yè)造成不利影響。原料奶中細(xì)菌微生物的多少，直接 決定了后續(xù)加工保藏投入和產(chǎn)品的質(zhì)量，企業(yè)對原料奶的要求不斷提高，質(zhì)量差的原料奶 越來越難以進(jìn)入企業(yè)的生產(chǎn)線。
[0004] 目前我國現(xiàn)行的牛奶中微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)有食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗國家標(biāo)準(zhǔn) GB47892-2010和進(jìn)出口商品檢驗行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN0330-94，另外國際上的主流檢測標(biāo)準(zhǔn)有 A0AC990. 12和FDA BAM Chapter 3-2001。這些標(biāo)準(zhǔn)檢測方法都是基于平板培養(yǎng)和菌落計 數(shù)，需要時間48h左右，對于廠家收購生鮮牛奶和評價分級來說，檢測過程費(fèi)時費(fèi)力，浪費(fèi) 大量人力、物力、財力，大大提高了奶制品的生產(chǎn)成本，并且容易導(dǎo)致在原料奶的儲藏和運(yùn) 輸環(huán)節(jié)造成二次污染，難以進(jìn)行監(jiān)測和控制，影響了生鮮奶源的及時使用，對食品企業(yè)、國 家和社會造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，該 檢測方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測時間短（2h)，檢出限為20~106cfu/mL，可以應(yīng)用于實際檢 測。
[0006] 牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟1，將牛奶倒入無菌生理鹽水中，100~150prm震蕩2min，得混合液；
[0008] 步驟2,在步驟1所得混合液中加入二甲苯，攪拌，1000~1500rpm離心5~15min， 去除上層；
[0009] 步驟3,在步驟2所得下層留存液中加入含胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的混合酶液，40°C水浴5min ;
[0010] 步驟4,將步驟3所得酶解液用納濾膜濃縮；
[0011] 步驟5,取步驟4所得濃縮液，經(jīng)次甲基藍(lán)染色液染色后，用微生物檢測儀檢測計 數(shù)。
[0012] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟1中牛奶和無菌生理鹽水的體積比為5~15 : 50 ~100〇
[0013] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2中混合液和二甲苯的體積比為5~15 :2~7。
[0014] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3中下層留存液和混合酶液的體積比為50~ 100 :3 ~9〇
[0015] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3中混合酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝 乳蛋白酶的濃度分別為〇· 2~0· 6g/mL、0. 1~0· 7g/mL、0. 3~0· 9g/mL。
[0016] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟4中采用孔徑為0. 45 μ m、截流液體積為70 μ L 的聚醚砜微孔濾膜濃縮。
[0017] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟5中次甲基藍(lán)染色液濃度為0.0 lwt%。
[0018] 本發(fā)明的檢測方法與國標(biāo)方法進(jìn)行比較不存在顯著性差異，其相關(guān)性高，檢測結(jié) 果準(zhǔn)確，檢測時間短（2h)，檢出限為20~106cfu/mL，可以應(yīng)用于實際檢測。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1
[0020] 牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，包括以下步驟：
[0021] 步驟1，將牛奶倒入無菌生理鹽水中，IOOprm震蕩2min，得混合液；
[0022] 步驟2,在步驟1所得混合液中加入二甲苯，攪拌，1000 rpm離心15min，去除上層；
[0023] 步驟3,在步驟2所得下層留存液中加入含胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的混合酶液，40°C水浴5min ;
[0024] 步驟4,將步驟3所得酶解液用納濾膜濃縮；
[0025] 步驟5,取步驟4所得濃縮液，經(jīng)次甲基藍(lán)染色液染色后，用微生物檢測儀檢測計 數(shù)。
[0026] 步驟1中牛奶和無菌生理鹽水的體積比為5 :50。
[0027] 步驟2中混合液和二甲苯的體積比為5 :2。
[0028] 步驟3中下層留存液和混合酶液的體積比為50 :3。
[0029] 步驟3中混合酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的濃度分別為0. 2g/ mL、0. lg/mL、0. 3g/mL〇
[0030] 步驟4中采用孔徑為0. 45 μ m、截流液體積為70 μ L的聚醚砜微孔濾膜濃縮。
[0031] 步驟5中次甲基藍(lán)染色液濃度為0.0 lwt%。
[0032] 實施例2
[0033] 牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，包括以下步驟：
[0034] 步驟1，將牛奶倒入無菌生理鹽水中，IlOprm震蕩2min，得混合液；
[0035] 步驟2,在步驟1所得混合液中加入二甲苯，攪拌，1050rpm離心10min，去除上層；
[0036] 步驟3,在步驟2所得下層留存液中加入含胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的混合酶液，40°C水浴5min ;
[0037] 步驟4,將步驟3所得酶解液用納濾膜濃縮；
[0038] 步驟5,取步驟4所得濃縮液，經(jīng)次甲基藍(lán)染色液染色后，用微生物檢測儀檢測計 數(shù)。
[0039] 步驟1中牛奶和無菌生理鹽水的體積比為9 :75。
[0040] 步驟2中混合液和二甲苯的體積比為10 :6。
[0041] 步驟3中下層留存液和混合酶液的體積比為85 :7。
[0042] 步驟3中混合酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的濃度分別為0. 4g/ mL、0. 3g/mL、0. 6g/mL〇
[0043] 步驟4中采用孔徑為0. 45 μ m、截流液體積為70 μ L的聚醚砜微孔濾膜濃縮。
[0044] 步驟5中次甲基藍(lán)染色液濃度為0· Olwt%。
[0045] 實施例3
[0046] 牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，包括以下步驟：
[0047] 步驟1，將牛奶倒入無菌生理鹽水中，HOprm震蕩2min，得混合液；
[0048] 步驟2,在步驟1所得混合液中加入二甲苯，攪拌，1250rpm離心8min，去除上層；
[0049] 步驟3,在步驟2所得下層留存液中加入含胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的混合酶液，40°C水浴5min ;
[0050] 步驟4,將步驟3所得酶解液用納濾膜濃縮；
[0051] 步驟5,取步驟4所得濃縮液，經(jīng)次甲基藍(lán)染色液染色后，用微生物檢測儀檢測計 數(shù)。
[0052] 步驟1中牛奶和無菌生理鹽水的體積比為14 :95。
[0053] 步驟2中混合液和二甲苯的體積比為13 :6。
[0054] 步驟3中下層留存液和混合酶液的體積比為65 :8。
[0055] 步驟3中混合酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的濃度分別為0. 5g/ mL、0. 4g/mL、0. 7g/mL〇
[0056] 步驟4中采用孔徑為0. 45 μ m、截流液體積為70 μ L的聚醚砜微孔濾膜濃縮。
[0057] 步驟5中次甲基藍(lán)染色液濃度為0.0 lwt%。
[0058] 實施例4
[0059] 牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，包括以下步驟：
[0060] 步驟1，將牛奶倒入無菌生理鹽水中，150prm震蕩2min，得混合液；
[0061] 步驟2,在步驟1所得混合液中加入二甲苯，攪拌，1500rpm離心5min，去除上層；
[0062] 步驟3,在步驟2所得下層留存液中加入含胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的混合酶液，40°C水浴5min ;
[0063] 步驟4,將步驟3所得酶解液用納濾膜濃縮；
[0064] 步驟5,取步驟4所得濃縮液，經(jīng)次甲基藍(lán)染色液染色后，用微生物檢測儀檢測計 數(shù)。
[0065] 步驟1中牛奶和無菌生理鹽水的體積比為15 :100。
[0066] 步驟2中混合液和二甲苯的體積比為15 :7。
[0067] 步驟3中下層留存液和混合酶液的體積比為100 :9。
[0068] 步驟3中混合酶液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的濃度分別為0. 6g/ mL、0. 7g/mL、0. 9g/mL〇
[0069] 步驟4中采用孔徑為0. 45 μ m、截流液體積為70 μ L的聚醚砜微孔濾膜濃縮。
[0070] 步驟5中次甲基藍(lán)染色液濃度為0.0 lwt%。
[0071] 將實施例1至4所得結(jié)果與國標(biāo)GB/T4789. 2-2010檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果如下：
[0072]
[0073] 由上表可知，本發(fā)明提供的牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法與國標(biāo)GB/T4789. 2-2010 的檢測方法不存在顯著差異。
【主權(quán)項】
1. 牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟： 步驟1，將牛奶倒入無菌生理鹽水中，100~150prm震蕩2min，得混合液； 步驟2,在步驟1所得混合液中加入二甲苯，攪拌，1000~1500rpm離心5~15min，去 除上層； 步驟3,在步驟2所得下層留存液中加入含胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混 合酶液，40°C水浴5min; 步驟4,將步驟3所得酶解液用納濾膜濃縮； 步驟5,取步驟4所得濃縮液，經(jīng)次甲基藍(lán)染色液染色后，用微生物檢測儀檢測計數(shù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，其特征在于：步驟1中牛奶和 無菌生理鹽水的體積比為5~15 :50~100。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，其特征在于：步驟2中混合液 和二甲苯的體積比為5~15 :2~7。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，其特征在于：步驟3中下層留 存液和混合酶液的體積比為50~100 :3~9。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，其特征在于：步驟3中混合酶 液中胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的濃度分別為0. 2~0. 6g/mL、0. 1~0. 7g/mL、 0? 3 ~0? 9g/mL。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，其特征在于：步驟4中采用孔 徑為0.45ym、截流液體積為70yL的聚醚砜微孔濾膜濃縮。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，其特征在于：步驟5中次甲基 藍(lán)染色液濃度為0.Olwt%。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種牛奶中細(xì)菌總數(shù)的檢測方法，先將牛奶倒入無菌生理鹽水中，100～150prm震蕩2min，在所得混合液中加入二甲苯，攪拌，1000～1500rpm離心5～15min，去除上層；然后在所得下層留存液中加入含胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的混合酶液，40℃水浴5min，所得酶解液用納濾膜濃縮，濃縮液經(jīng)次甲基藍(lán)染色液染色后，用微生物檢測儀檢測計數(shù)。本發(fā)明的檢測方法與國標(biāo)方法進(jìn)行比較不存在顯著性差異，其相關(guān)性高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測時間短（2h），檢出限為20～106cfu/mL，可以應(yīng)用于實際檢測。
【IPC分類】C12Q1/06
【公開號】CN104928346
【申請?zhí)枴緾N201510368785
【發(fā)明人】熊開勝, 張海防, 謝建庭
【申請人】蘇州東辰林達(dá)檢測技術(shù)有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年6月29日