技術(shù)特征：

1.一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP引物，其特征在于包括：

正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；

反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；

正向內(nèi)引物FIP：

5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；

其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：

F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；

F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；

反向內(nèi)引物BIP：

5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；

其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：

其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；

B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’。

2.一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：

其中所述引物包括：

正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；

反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；

正向內(nèi)引物FIP：

5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；

其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：

F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；

F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；

反向內(nèi)引物BIP：

5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；

其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：

其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；

B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；

其中該試劑盒的產(chǎn)品規(guī)格：40次。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP試劑盒，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP試劑盒，其特征在于所述熒光染料為鈣黃綠素；所述酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。

5.一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

A、提取樣品RNA；

B、建立LAMP反應(yīng)體系：

按檢測所需的反應(yīng)量從權(quán)利要求2所述的試劑盒中分別取各種試劑，放入滅菌試管中，在冰上配制預(yù)混液；輕彈擊滅菌試管使其混勻，瞬時離心數(shù)秒使溶液集中在滅菌試管底部；20μL LAMP反應(yīng)體包括：

C、加樣：

在三個裝有20μL LAMP反應(yīng)體的滅菌試管中分別加入待檢測的待檢測樣品RNA、陰性對照反應(yīng)樣品、陽性對照反應(yīng)樣品各5μL，使各自的總量達到25μL，蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時離心使反應(yīng)溶液集中在滅菌試管底部；其中陰性對照反應(yīng)使用黃瓜花葉病毒CGMMV的RNA，陽性對照反應(yīng)使用帶有CGMMVRNA的陽性對照，

D、擴增：

將步驟C中的滅菌試管放置在恒溫器中，在60-65℃下保持恒溫1小時，然后在80℃下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)；

E、檢測：

使用紫外線照射裝置從滅菌試管底部向上進行照射，佩戴紫外防護眼鏡從試管側(cè)面進行觀查；如果與陽性對照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對照一樣沒有發(fā)出熒光，而判定為陰性。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測方法，其特征在于步驟A中所述提取樣品RNA，具體按以下步驟提?。?/p>

a1、取0.1g的CGMMV和CMV感病組織加入1mL抽提緩沖液進行研磨；

a2、清洗納米磁珠：取出納米磁珠到PCR管中，用ddH₂O反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH₂O；

a3、結(jié)合：加入100μL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；

a4、清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；

a5、裂解：加入50μL ddH₂O到PCR管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；

a6、取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為CGMMV和CMV的RNA。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測方法，其特征在于步驟E中紫外線照射裝置的紫外線范圍：波長240－260nm或350-370nm。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測方法，其特征在于所述引物中外引物與內(nèi)引物的比例為1:2-1:10。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測方法，其特征在于所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向內(nèi)引物FIP、0.2μl反向內(nèi)引物BIP。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測方法，其特征在于步驟D中擴增溫度優(yōu)選為63℃。