本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒(HCV)的檢測。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于快速及靈敏地檢測丙型肝炎病毒(HCV)和鑒定丙型肝炎病毒(HCV)基因型的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎是一個重大的全球性公共健康問題，并且是引發(fā)慢性肝病如肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)的其中一個主要原因。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引致的一種肝臟疾病。丙型肝炎病毒一般透過接觸感染者的血液而傳播。據(jù)估計，有1.85億人受慢性HCV感染，每年有超過35萬人死于丙型肝炎相關(guān)的肝臟疾病。丙型肝炎流行于全球，其中慢性HCV感染在國家包括埃及、巴基斯坦和中國的感染率尤其高。病毒在肝臟中復(fù)制，攻擊并殺死肝細(xì)胞，并引起肝臟炎癥。一旦感染HCV，有高達(dá)75％的人可能成為慢性感染者；慢性感染是指感染者在六個月內(nèi)未能清除病毒。大多數(shù)的慢性HCV感染者并沒有癥狀，并過著正常的生活。然而，10-25％的慢性HCV感染者的病情可能在感染后10到40年之內(nèi)逐漸惡化，最后可能導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷、肝硬化(形成疤痕組織)和肝癌。目前，丙型肝炎是美國肝臟移植的主要原因。由于HCV有高度的變異性，所以目前尚未有有效的疫苗。然而，隨著醫(yī)學(xué)界對診斷、管理和治療HCV感染的認(rèn)識漸增，以及相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步，治療丙型肝炎的成功率可高達(dá)90％，并能減少副作用，及縮短治療時間。絕大多數(shù)HCV感染者，經(jīng)適當(dāng)?shù)闹委熀笕驕p緩其病情的惡化。目前已知有7個HCV基因型(基因型1-7)，每個基因型中再細(xì)分為不同亞型或病毒株。相近的HCV亞型之間大約有20-25％核苷酸序列上的差異，各個基因型之間的差異則有30％以上。基因型1、2和3分布在世界各地，其中大約60％的感染是由亞型1a和1b引起的?；蛐?主要在中東和非洲出現(xiàn)?；蛐?占南非地區(qū)的50％，并很少在南非以外地區(qū)出現(xiàn)。基因型6一般在中國南方和東南亞地區(qū)出現(xiàn)?；蛐?并不常見，主要盛行于泰國。實(shí)驗(yàn)室一般以病毒抗體檢測和病毒負(fù)荷量來檢測受試者樣品中是否存在HCV感染。在感染者體內(nèi)，可能需要長達(dá)50天才能產(chǎn)生HCV抗原，并且可能需要100天以上才能達(dá)到血清轉(zhuǎn)化(seroconversion),即產(chǎn)生足夠的抗體數(shù)量以獲得的病毒抗體檢測陽性結(jié)果。病毒負(fù)荷量檢測通過定性方法，如聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction-PCR)、分支鏈DNA技術(shù)(Branched-chainDNA-bDNA)或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法(TranscriptionMediatedAmplification-TMA)，以估計感染者體內(nèi)HCV病毒RNA的數(shù)量。病毒負(fù)荷量檢測可以在感染HCV幾天后檢測HCV,病毒抗體檢測在那時一般仍呈陰性。病毒負(fù)荷量檢測的結(jié)果通常指出受試者的病毒載量是低或高(即低于或高于8000000IU/mL)。HCV抗體檢測只能證實(shí)受試者是否曾經(jīng)被HCV感染，而病毒負(fù)荷量檢測則結(jié)果可以供醫(yī)生診斷受試者是否正受HCV感染。一般而言，陽的性抗體檢測結(jié)果及高病毒載量顯示受試者 正受HCV感染。一旦證實(shí)感染HCV，通常會在給予治療前測定病毒載量和基因型兩個指標(biāo)以評估HCV感染的類型和程度，從而為受試者安排適當(dāng)?shù)闹委?。病毒載量測量對預(yù)測和監(jiān)測治療的有效性十分有用。研究發(fā)現(xiàn)，治療前患者的病毒載量愈低，現(xiàn)有的HCV治法對患者的成效愈大。臨床觀察得知，治療開始前病毒載量低于400,000IU/mL的患者通常有更好的治療結(jié)果。此外，在療程期間測量病毒載量可以反映消除或抑制HCV的進(jìn)展，因此病毒載量是一個評估治療成效的有用指標(biāo)。另一方面，HCV基因型在決定療程時間和類型發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。已知不同基因型的HCV其毒力大致相等，但對藥物療法的反應(yīng)則有所不同。例如，一種施用聚乙烯二醇化干擾素α和抗病毒藥利巴韋林(ribavirin)的複合治療可以治愈70％-80％由基因型2和3引致的疾病，及治愈45-70％由其他基因型引致的疾病。由于相同藥物對于不同的HCV基因型的療效和副作用有顯著差異，所以治療方案(例如所用藥物、治療時間)通常會對應(yīng)特定的HCV基因型而設(shè)計。此外，HCV亞型1a在其非結(jié)構(gòu)基因NS3中展現(xiàn)Q80K多態(tài)性，即在NS3基因中，天然氨基酸殘基谷氨酰胺-80(Glutamine-80)突變?yōu)橘嚢彼?80(Lysine-80)。NS3基因負(fù)責(zé)編碼一個對病毒復(fù)制過程必需的蛋白酶。該蛋白酶是前線抗HCV藥物的目標(biāo),例如Simeprevir專門抑制NS3/4A蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn)，在感染了HCV亞型1a的患者中，發(fā)現(xiàn)NS3Q80K多態(tài)性與他們對Simeprevir,聚乙烯二醇化干擾素和利巴韋林的結(jié)合治療反應(yīng)較差有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，具有NS3Q80K多態(tài)性的HCV感染患者如接受Simeprevir治療，他們較少獲得持續(xù)性病毒反應(yīng)(SustainedVirologicresponse-SVR)。因此，強(qiáng)烈建議在治療之前測定HCV感染患者是否展現(xiàn)NS3Q80K多態(tài)性(WHO,2014)。因此，鑒定HCV基因分型對疾病的流行病學(xué)和臨床管理都是有用的。來自歐洲(EASL，2014年)、美國(AASLD，2014年)和世界衛(wèi)生組織(WHO，2014年)的三個最新HCV指南中，均建議進(jìn)行HCV基因型鑒定?；蚍中鸵话阃ㄟ^分子基因分型技術(shù)來鑒定，例如直接測序、實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和特異性等位基因雜交測定(或線性探針測定)。直接測序直接獲得有關(guān)物種的準(zhǔn)確序列。直接測序方法準(zhǔn)確并可靠，是鑒定HCV基因型的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，此方法的靈敏度有限，也相對昂貴和費(fèi)時。相比之下，實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)更靈敏，但是此方法涉及若干反應(yīng)樣本來確定基因型，所以需要闡釋復(fù)雜的結(jié)果。鑒定基因型亦可以使用特異性等位基因雜交測定，當(dāng)中僅需檢測目標(biāo)HCV的短核酸段而無需檢查大范圍的核酸序列。這種方法通常涉及使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)核酸，并用特異性寡核苷酸探針與擴(kuò)增子雜交以探測目標(biāo)核酸。此方法的結(jié)果容易闡釋，配合適當(dāng)?shù)囊?、探針和測定條件可以明確且靈敏的地檢測目標(biāo)核酸。然而，傳統(tǒng)的固定技術(shù)和雜交技術(shù)一般受膜面積的限制，并且涉及較長的溫育時間(至少4小時)?；谏鲜鰬?yīng)用技術(shù)的考慮，有必要發(fā)展出更先進(jìn)的方法以便快速、簡單而準(zhǔn)確及靈敏地檢測和鑒定HCV，從而為HCV感染者提供及時和優(yōu)化的治療。如能及早檢測HCV和鑒定HCV基因型，有望更迅速地排除潛在感染，預(yù)防感染者在感染期間傳播HCV，并在病毒載量變得過高之前給予治療以增加治療的成功率。另外，由于HCV的RNA基因組突變率高，HCV展現(xiàn)非常高的異質(zhì)性。傳統(tǒng)的基因分型方法大多用于檢測特定基因型的已知序列，未必能檢測罕見或新出現(xiàn)的HCV品種。因此,一種涵蓋各種不同基因型并包括HCV族群的亞型的嶄新型基因分型系統(tǒng)是非常有用的。本發(fā)明提供了用于多項(xiàng)檢測、辨認(rèn)或區(qū)分HCV的方法和試劑盒。本發(fā)明符合成本效益，易于操作，且允許簡易至僅需要肉眼觀察的結(jié)果闡釋。本發(fā)明提供更快速及有效的HCV檢測。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了可快速及靈敏地檢測、辨認(rèn)或區(qū)分各種不同HCV基因型的方法和試劑盒。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明結(jié)合一步法RT-PCR擴(kuò)增法和導(dǎo)流雜交技術(shù)，以快速地檢測人類樣本如血清和血漿中的HCV或HCV的核酸并鑒定其基因型。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種檢測、鑒定或區(qū)分不同HCV基因型的方法和試劑盒。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供對應(yīng)HCV基因型1-6的引物和探針。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種檢測、鑒定或區(qū)分HCV亞型1a和1b的方法和試劑盒。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供對應(yīng)編碼HCV亞型1a和1b的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)NS5B的核酸的引物和探針。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種檢測、鑒定或區(qū)分出HCV亞型1a中的NS3基因多態(tài)性的方法和試劑盒。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供對應(yīng)HCV亞型1aNS3蛋白中的氨基酸賴氨酸-80或谷氨酰胺-80的序列的引物和探針。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用來檢測HCV或其核酸的方法和試劑盒。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供適用于所有HCV品種且能捕獲HCV族群中的通用或共有核酸的引物和探針。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的引物和探針能夠捕獲來自罕見、未分類或未知的HCV基因型的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明結(jié)合其他等溫設(shè)備和/或?qū)Я麟s交設(shè)備一起使用。本發(fā)明提供用于快速及靈敏地檢測、辨認(rèn)或區(qū)分各種HCV類型和來自各種HCV基因型的核酸的方法和試劑盒，所述方法和試劑盒包含對應(yīng)HCV核酸的引物和探針。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種快速及靈敏地檢測HCV和鑒定HCV 基因型的方法和試劑盒。本發(fā)明并不需要昂貴的儀器和復(fù)雜的程序，并且與逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增法和導(dǎo)流雜交技術(shù)相容。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增法和導(dǎo)流雜交技術(shù)，以快速并靈敏地檢測不同樣品和人類樣本中的HCV及鑒定其HCV基因型。本發(fā)明可以快速、靈敏且高流量地進(jìn)行HCV檢測和基因型鑒定，從而允許醫(yī)生為患者盡早安排適當(dāng)?shù)闹委?，以提高治療的成功率。本發(fā)明提供了一組經(jīng)特殊設(shè)計、修飾的新穎核酸引物和探針，用于擴(kuò)增和檢測來自HCV的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針經(jīng)測試并確定能檢測和鑒定HCV基因型1-6的品種，且具有高的特異性和靈敏度。本發(fā)明亦提供用于通用檢測HCV族群的探針。本發(fā)明的引物和探針經(jīng)實(shí)驗(yàn)及臨床測試,証實(shí)能夠檢測血清和血漿樣品中90％以上的流行性HCV感染。本發(fā)明的引物和探針亦已被證實(shí)不會與人類基因組產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而保證HCV的檢測既特定又準(zhǔn)確。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物是涵蓋所有HCV基因型、亞型和株系的核酸的通用引物。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的探針對應(yīng)特定HCV基因型、亞型或株系的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的探針對應(yīng)HCV基因型1、2、3、4、5或6，且能夠檢測屬于HCV基因型1、2、3、4、5或6的任何已知或未知的亞型或株系。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明檢測HCV亞型1a的NS3基因的多態(tài)性，其中NS3基因的Q80K多態(tài)性被發(fā)現(xiàn)與抗病毒藥物simeprvir的抗藥性相關(guān)。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的探針對應(yīng)編碼HCV亞型1a的NS3中賴氨酸-80的自然序列。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明的探針對應(yīng)編碼HCV亞型1a的NS3中谷氨酰胺-80(Q80K多態(tài)性)的序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針能夠檢測和區(qū)分HCV亞型1a和1b。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針對應(yīng)HCV亞型1a和1b的NS5B基因。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明的探針對應(yīng)所有HCV基因型、亞型和株系，并且能夠捕獲來自HCV族群中的通用或共有核酸。結(jié)合使用通用探針以及對應(yīng)特定品種的品種探針，可以確定樣品或患者是否感染任何一種HCV，以及有關(guān)病原體屬于HCV基因型1-6、亞型1a或1b、或者任何其他或未知的HCV。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針是經(jīng)修飾的、非天然的寡核苷酸并帶有一個或多個化學(xué)標(biāo)記，所述化學(xué)標(biāo)記包括但不限于生物素、熒光標(biāo)記物和氨基。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針包含一個或多個非天然的核苷酸類 似物，包括但不限于肌苷(inosine/I)和熒光堿基類似物。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針與逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增法和導(dǎo)流雜交技術(shù)結(jié)合地使用。一步法逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增法(RT-PCR)在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物可同時用于逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增法，因而可以在單個試管中對病毒RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增由此產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA(complementaryDNA/cDNA)。相比于兩步法RT-PCR(即需要在完成逆轉(zhuǎn)錄之后再額外設(shè)置PCR反應(yīng)),一步法RT-PCR的程序更簡單，對試劑、引物和機(jī)件設(shè)備的需求亦較低，因此更有優(yōu)勢。因此，本發(fā)明與傳統(tǒng)方法和試劑盒相比更具成本效益及更易于操作。任何設(shè)備或系統(tǒng)，包括但不限于熱循環(huán)儀、恒溫箱以及能保持一定高溫或執(zhí)行RT-PCR擴(kuò)增的加熱板/加熱組，均可以與本發(fā)明結(jié)合使用。一般可使用能被偵測的標(biāo)記物標(biāo)記擴(kuò)增子，以便于隨后檢測和量化目標(biāo)核酸。在一個實(shí)施例中，可使用帶有適當(dāng)標(biāo)記物的引物擴(kuò)增目標(biāo)序列，以在隨后的雜交過程中生成信號。在一個實(shí)施例中，可通過引物5’端的共價鍵在引物對中的一個或兩個引物上加上標(biāo)記物。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物包含一個或多個標(biāo)記物如生物素。生物素可以結(jié)合抗生素及蛋白酶的結(jié)合物,產(chǎn)生顏色以供檢測。在另一個實(shí)施例中，可以標(biāo)記四種核苷酸dNTP的其中一個并在擴(kuò)增過程中使用，以標(biāo)記新生成的擴(kuò)增子。本發(fā)明可使用任何可被監(jiān)測并產(chǎn)生信號的標(biāo)記物。例如，本發(fā)明可以與其他標(biāo)記系統(tǒng)結(jié)合使用，包括但不限于膠狀金結(jié)合物和熒光標(biāo)記、磁顆粒結(jié)合物、量子點(diǎn)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子，或其他合適的系統(tǒng)。導(dǎo)流雜交導(dǎo)流雜交方法和設(shè)備可以準(zhǔn)確地控制雜交條件,不會有傳統(tǒng)雜交技術(shù)需時較長的問題。導(dǎo)流DNA雜交技術(shù)可將雜交時間從數(shù)小時或數(shù)天減至數(shù)分鐘(整個雜交測定可以在5-30分鐘內(nèi)完成，具體時間取決于用于產(chǎn)生檢測信號的方法)。導(dǎo)流雜交設(shè)備的制造成本低廉，并且使用比傳統(tǒng)雜交設(shè)備少10倍的試劑量，因此使DNA檢測技術(shù)比前更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。導(dǎo)流雜交技術(shù)提供更靈敏、準(zhǔn)確的檢測和鑒定結(jié)果，并普遍適用于各種不同技術(shù)例如傳統(tǒng)DNA印跡法(Southernblotting)、RNA印跡法(Northernblotting)、斑點(diǎn)印跡法、狹槽印跡法和反向斑點(diǎn)印跡法的雜交。PCT申請WO/2011/139750描述了一個連接到中央控制單元的多個橫向快速導(dǎo)流檢測設(shè)備。雜交設(shè)備包含一個連接到一個或多個橫流設(shè)備的中央控制單元。橫流設(shè)備進(jìn)行雜交過程和顯影程序，并由中央控制單元控制和供電。單個橫流設(shè)備或幾個設(shè)備可以同時測試若干反應(yīng)(或者若干樣品和/或分析物),并在獨(dú)立的控制下以不同條件進(jìn)行程序。橫流設(shè)備可以是“nxm”點(diǎn)陣(矩陣)的 形式，也可以是線陣的形式。更多有關(guān)于執(zhí)行導(dǎo)流雜交的方法和設(shè)備的描述可參見美國專利5,741,647、美國專利6,020,187和PCT申請WO/2011/139750。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以使用美國專利5,741,647或美國專利6,020,187中所述的類近導(dǎo)流雜交技術(shù)，或者能夠執(zhí)行導(dǎo)流雜交技術(shù)的任何新方法或設(shè)備來實(shí)踐本發(fā)明。雜交設(shè)備附有的成像系統(tǒng)，例如FT-Pro，可以將信號檢測數(shù)碼化。本發(fā)明所述的雜交設(shè)備可以是自動化的設(shè)備，可以使用其內(nèi)置的數(shù)碼化功能以進(jìn)行所有分析。導(dǎo)流雜交法比傳統(tǒng)雜交技術(shù)有更高的效率、準(zhǔn)確度和靈敏度。目標(biāo)核酸的檢測可以在幾秒鐘內(nèi)完成，其結(jié)果易于闡釋并可以直接用肉眼觀察，因此無需專門的儀器。有需要時可以使用如CapturePRO的設(shè)備捕獲和記錄信號。根據(jù)所得的圖像，可對目標(biāo)核酸進(jìn)行半定量的分析。HCV的類型特異性檢測和鑒定第1組：HCV基因型1-6在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供對應(yīng)特定HCV基因型1-6核酸的探針?；蚩赏ㄟ^適當(dāng)?shù)脑O(shè)計和優(yōu)化,務(wù)求使各個目標(biāo)核酸在相近的效率下擴(kuò)增及雜交。因此，對于引物和擴(kuò)增方案，必須仔細(xì)設(shè)計并優(yōu)化，以確保用于檢測的擴(kuò)增技術(shù)其結(jié)果可靠。對于基因型分析，首選HCV中共有但有一定差異的核酸區(qū)域作為目標(biāo)區(qū)域，以區(qū)分不同的HCV品種。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明選擇了HCV基因組內(nèi)的5’端的非翻譯區(qū)(5’-UTR)來設(shè)計引物和探針。通過精心設(shè)計和嚴(yán)緊的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)本發(fā)明的全部引物和探針均能夠特異地、靈敏地擴(kuò)增和檢測來自HCV基因型1-6的目標(biāo)核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供可以識別全部HCV基因型、亞型和株系的5’-UTR的通用引物，所述HCV包括但不限于HCV基因型1、2、3、4、5和6，以及其他已知或未分類的HCV品種。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的通用引物包含序列號1-7的序列，它們能夠結(jié)合到HCV的5’-UTR，繼而擴(kuò)增目標(biāo)序列。工具BasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)的檢索結(jié)果表明，本發(fā)明的通用引物可以檢測多種HCV基因型、亞型和株系。通用引物目標(biāo)5’-UTR引物ID引物序列(5'到3')5'修飾長度序列號正鏈HCV-C-1FGAGAGCCATAGTGGTCTGC蛋白生物素191正鏈HCV-C-6FCTTGCGAGTGCCCCGGGA-182反鏈HCV-C-6RCCACCCGGGAACTTAACGT蛋白生物素193反鏈HCV-C-7RCCGCCCGGGAACTTGACGT蛋白生物素194反鏈HCV-C-8RCCGCCCGGGAACTTAACGT蛋白生物素195反鏈HCV-C-9RCCACCCGGGAACTTGACGT蛋白生物素196反鏈HCV-C-10RAGGCCTTTCGCRACCCAAC蛋白生物素197Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)HCV品種特異性探針目標(biāo)基因型探針I(yè)D探針序列(5'到3')5'修飾長度序列號HCV1P43CTTGGATAACCCCGC胺基158HCV1,6P118GAATTGCCAGGACGACC胺基179HCV1,6P137GAGTTGCCAGGATGACCG胺基1810HCV1,4P29AACCAAACGTAACACCAAC胺基1911HCV2P55CCGGGAAGACTGGGT胺基1512HCV2P102TGGATAAACCCACTCTATG胺基1913HCV3,6P28TGAGCACACTTCCAAAAC胺基1814HCV3,6P110TGAGCACACTTCCTAAA胺基1715HCV3P13CGCGAGATCACTAGCC胺基1616HCV4P14CCGCCGCCCCATGGA胺基1517HCV4P71AACCGCCACCCCATGGA胺基1718HCV5P23GTCATCCCGGCAATTC胺基1619HCV5P50GCCCGGAGACTTGG胺基1420HCV5P60TGCCCGGAGATTTGG胺基1521HCV6P125AAAACCCCAAAGACAAAC胺基1822在一個實(shí)施例中，在RT-PCR反應(yīng)中共同使用包含序列號1-7序列的引物，以產(chǎn)生特定HCV的擴(kuò)增子。在另一個實(shí)施例中，在RT-PCR反應(yīng)中共同使用兩個或多個包含序列號1-7序列的引物，以產(chǎn)生特定HCV的擴(kuò)增子。在一個實(shí)施例中，包含序列號1的引物與一個或多個包含序列號3-7的引物配對使用。在另一個實(shí)施例中，包含序列號2的引物，與一個或多個包含序列號3-6的引物配對使用。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供用以檢測HCV基因型1-6的品種特異性探針，從而鑒定樣品中的HCV基因型。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的品種特異性探針包含序列號8-22，能夠與HCV基因型1-6的5’‐UTR結(jié)合。在一個實(shí)施例中，可以共同使用本發(fā)明不同的探針并將之分成一個或多個組別以檢測HCV。在另一個實(shí)施例中，可單獨(dú)地使用本發(fā)明的探針以檢測個別的HCV基因型。一般而言，基因型分析方法通常利用一個對應(yīng)特定核酸序列的探針就足夠。盡管如此，本發(fā)明設(shè)計的探針涵蓋每個HCV基因型其5’-UTR區(qū)內(nèi)的多個序列，以進(jìn)一步增加檢測的準(zhǔn)確度及靈敏度。在一個實(shí)施例中，可共同使用了兩個或多個對應(yīng)相同HCV基因型的探針以驗(yàn)證基因型分析的結(jié)果。如果任何一個目標(biāo)序列出現(xiàn)缺陷或降解，則其他序列可以彌補(bǔ)缺陷，從而減少假陰性結(jié)果并提高檢測準(zhǔn)確度。例如，共同使用包含序列號8-11的探針，可證實(shí)某個測試樣品或受試者是否被HCV基因型1感染。在另一個實(shí)施例中，共同使用包含序列號12-13的探針，可證實(shí)某個測試樣品或受 試者是否被HCV基因型2感染。類似的方法也適用于HCV基因型3、4、5和6。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可考慮測試的實(shí)際需要對雜交方案作出調(diào)整。觀察所得，如果對應(yīng)某個基因型的探針序列與其它基因型有基本同源性，很可能出現(xiàn)探針與非目標(biāo)的序列之間的非特異性結(jié)合(即交叉反應(yīng))。另一方面，每個基因型內(nèi)的亞型或株系之間的序列或有不同，因而專為為檢測某幾種亞型或株系而設(shè)計的探針可能不能檢測出已出現(xiàn)突變的亞型或株系。因此，有必要權(quán)衡檢測的靈敏度和特異性，以達(dá)到一個準(zhǔn)確、肯定的HCV檢測。基于上述情況，本發(fā)明既提供與已知HCV亞型完全同源的“天然”探針，亦提供與已知HCV亞型不完全同源的“人工”探針。所述人工探針的序列包括錯配的序列，從而只能檢測出那些與目標(biāo)序列充分同源的真正目標(biāo)序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明共同使用涵蓋同一區(qū)域的天然探針和人工探針，從而保證即使所測基因型內(nèi)不同亞型或株系之間的核酸有所變異，亦能檢測某個特定基因型，以提高檢測的靈敏度和特異性。例如，包含序列號9-10的探針用于檢測HCV基因型1和6。序列號9屬于天然序列，序列號10則是人工序列，后者與序列號9的天然序列相比有兩個錯配。在一個實(shí)施例中，如圖1所示,可以在陣列位置C1上共同使用包含序列號9-10序列的探針，以檢測HCV基因型1和6。在另一個實(shí)施例中，如圖1所示,可以在陣列位置B3上共同使用包含序列號17-18的探針以檢測HCV基因型4。序列號18是人工序列，與序列號17的天然序列相比有三個錯配。在一個實(shí)施例中，如圖1所示,可以在陣列位置E3上共同使用包含序列號19-20序列的探針以檢測HCV基因型5。在另一個實(shí)施例中，如圖1所示,可以在陣列位置E4上共同使用包含序列號20-21的探針以檢測HCV基因型5。序列號20是人工序列，與序列號19或21的天然序列相比有兩個錯配。第2組：HCV亞型1a和1b在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供的引物和探針對應(yīng)編碼HCV亞型1a和1b的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5B的核酸，并已經(jīng)證實(shí)這些引物和探針均能明確地并靈敏地擴(kuò)增和檢測來自HCV亞型1a和1b的目標(biāo)核酸。HCV亞型1a和1b(NS5B)的引物目標(biāo)NS5B引物ID引物序列(5'到3')5'修飾長度序列號正鏈HCV-NS5B-3FCAATTCCTGGCTAGGCAAYAT-2123反鏈HCV-NS5B-3RGCGCTAAGRCCRTGGAGTC生物素1924Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)HCV亞型1a和1b(NS5B)的探針Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)在一個實(shí)施例中，可分開使用包含序列號25-28的探針，以檢測個別的HCV亞型1a或1b。在另一個實(shí)施例中，在一個或多個組中共同使用兩個或多個包含序列號25-28的探針，以檢測HCV亞型1a和1b。在一個實(shí)施例中，包含序列號23-24的引物可以與兩個或多個包含序列號1-7的引物可以結(jié)合地使用，以產(chǎn)生特定于HCV基因型1的擴(kuò)增子。在另一個實(shí)施例中，可以在一個或多個組別中使用一個或共同使用多個包含序列號8-11和25-28的探針，以檢測HCV基因型1，或者區(qū)分亞型1a和1b。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)測試的實(shí)際需要，按照圖1中所示或類似的形式調(diào)整雜交方案并增加其他陣列位置。第3組：HCV亞型1a的NS3Q80K多態(tài)性在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供的引物和探針對應(yīng)可編碼HCV亞型1a非結(jié)構(gòu)蛋白NS3的特異性核酸。這些引物和探針能夠檢測與NS3蛋白質(zhì)的賴氨酸-80(NS3-K80)和谷氨酰胺-80(NS3-Q80)相關(guān)的多態(tài)性，并已經(jīng)證實(shí)這些引物和探針均能夠明確地并靈敏地檢測HCV亞型1a中NS3-K80或NS3-Q80的多態(tài)性。NS3-K80和NS3-Q80多態(tài)性的引物目標(biāo)NS3引物ID引物序列(5'到3')5'修飾長度序列號正鏈HCV-NS3-3FAAGGGTCCTGTCATYCARATGTA生物素2329反鏈HCV-NS3-2RCTCGTGACCAGGTARAGRTC生物素2030Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)NS3-K80和NS3-Q80多態(tài)性的探針目標(biāo)基因型探針I(yè)D探針序列(5'to3')5'修飾長度序列號K80(反鏈)NS3-P65AYRAGGTCTTTGTCCAC胺基1731K80NS3-P32AATGTRGACAAAGATCTYG胺基1932K80(反鏈)NS3-P55CRAGGTCTTTGTCTACITT胺基1933K80(反鏈)NS3-P69CAAGGTCCTTGTCYACR胺基1734Q80(反鏈)NS3-P57CRAGGTCTTGGTCYAC胺基1635Q80NS3-P20AAYGTRGACCAAGACCT胺基1736Q80NS3-P30CCAAYGTRGATCAAGACCT胺基1937Q80NS3-P21AAYGTRGATCAAGACCT胺基1738Q80NS3-P31CCAAYGTRGACCAGGACCT胺基1939Q80NS3-P22AAYGTRGACCAGGACCT胺基1740Y＝嘧啶(C/T)；R＝嘌呤(A/G)；W＝(A/T)；I＝肌苷在一個實(shí)施例中，可分開使用包含序列號31-40的探針以檢測HCV亞型1a中存在的個別NS3-K80或NS3-Q80多態(tài)性。在一個實(shí)施例中，可以在一個或多個組別中共同使用兩個或多個包含序列號31-40的探針，以檢測NS3-K80和NS3-Q80的多態(tài)性。在另一個實(shí)施例中，可以在一個或多個組別中使用一個或共同使用多個包含序列號31-34的探針，以檢測NS3-K80的多態(tài)性。在另一個實(shí)施例中，可以在一個或多個組別中使用一個或共同使用多個包含序列號35-40的探針，以檢測NS3基因中的NS3-Q80的多態(tài)性。在一個實(shí)施例中，包含序列號29-30的引物可以與兩個或多個包含序列號1-7和23-24序列的引物共同使用，以產(chǎn)生特定于HCV基因型1的擴(kuò)增子。在另一個實(shí)施例中，可以在一個或多個組別中使用一個或共同使用多個包含序列號8-22、25-28和31-40的探針,以檢測或區(qū)分HCV基因型1的各種亞型或株系。HCV的通用檢測和鑒定第4組：HCV的通用檢測在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供對應(yīng)所有HCV的通用探針，可以捕獲HCV族群的通用或共有核酸。通過使用通用探針，本發(fā)明可以檢測樣品中是否存在HCV，可作為HCV感染的快速及初步篩選。如上所述，每個緊密相關(guān)的HCV亞型在其核苷酸序列上有大約20-25％的差異，而不同基因型之間則有30％以上的差異。本發(fā)明比較并分析了HCV族群品種間的共有和可變性核酸序列，并設(shè)計了足以檢測大部分HCV品種的引物和探針。經(jīng)過精心設(shè)計并嚴(yán)緊控制的實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的通用引物和探針能夠檢測并識別眾多不同的HCV物種，并且不會與人類基因組產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而保證一個檢測的特異性及準(zhǔn)確度。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明結(jié)合品種特異性探針和通用探針，以確定所測樣品是否包含HCV核酸，以及相關(guān)病原體屬于HCV基因型1、2、3、4、5或6,或是其他已知、未知或未分類的基因型、亞型或株系。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的通用探針包含序列號41-43，并能夠與大部分HCV的5’-UTR結(jié)合,從而允許檢測和確認(rèn)由任何一種HCV基因型、亞型或株系引起的HCV感染。檢索工具BLAST的檢索結(jié)果表明本發(fā)明的通用探針可以檢測眾多HCV亞型和株系。通用探針在一個實(shí)施例中，使用一個或多個包含序列號41-43的探針，可檢測是否存在HCV的核酸。在另一個實(shí)施例中，可在同一陣列位置上共同使用包含序列號41-43的探針，以通用檢測HCV核酸。共同使用序列號41-43的三個探針可以涵蓋來自絕大多數(shù)已知HCV物種的核酸，從而大大提高檢測的靈敏度。此外，使用品種特異性探針的方法或現(xiàn)有的基因型分析方法(例如實(shí)時PCR)一般依賴目標(biāo)序列與用來檢測目標(biāo)序列的寡核苷酸之間的高度互補(bǔ)性。如果HCV品種是新出現(xiàn)的或者是高度突變的，這些方法或未能檢測出來,導(dǎo)致假陰性的情況。本發(fā)明的通用檢測系統(tǒng)則能有效地降低假陰性的發(fā)生率。如上所述，可以選擇并結(jié)合使用本發(fā)明特定的引物和探針，以進(jìn)行特定的基因型分析。例如，如圖1中所示，可同時使用序列號8-22的品種特異性探針和序列號41-43的通用探針，以檢測HCV基因型1-6及HCV基因型1-6以外的HCV基因型。在另一個實(shí)施例中，如圖6中所示，可在陣列中共同使用序列號8-22,25-28和31-40的品種特異性探針以及序列號41-43的通用探針，以檢測HCV基因型1-6及HCV基因型1-6以外的HCV基因型，并進(jìn)一步識別HCV亞型1a中NS3-K80和NS3-Q80的多態(tài)性。本發(fā)明中所示陣列格式僅用于說明性目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)測試的實(shí)際需要，調(diào)整雜交方案并增加其他陣列位置。以下為用于設(shè)計本發(fā)明的引物和探針的某些基因組序列。5’-非翻譯區(qū)(5’-UTR)下劃線：引物序列；粗體：品種特異性探針序列；灰色和下劃線：通用探針序列a.HCV基因型1a[基因庫：EU155310.2](序列號44)[引物：HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-6R；探針:P118,P43,P29；通用探針:P113]b.HCV基因型1b[基因庫：AB049090.1](序列號45)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-7R；探針：P118,P29；通用探針:P113]c.HCV基因型2a[基因庫：AB047639.1](序列號46)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-8R；探針:P55,P102；通用探針:P113]d.HCV基因型3a[基因庫：D28917.1](序列號47)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探針:P13,P110；通用探針:P114]e.HCV基因型4a[基因庫：D1418782.1](序列號48)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探針:P29,P14；通用探針:P113]f.HCV基因型5a[基因庫：AF064490.1](序列號49)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-7R；探針:P23(負(fù)鏈),P60；通用探針:P113]g.HCV基因型6a[基因庫：AY859526.1](序列號50)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探針:P118,P28；通用探針:P113]h.HCV基因型6a[基因庫：HQ639936.1](序列號51)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-6F,HCV-C-9R；探針:P28；通用探針:P117]i.HCV基因型6g[基因庫：D63822.1](序列號52)[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-7R；探針:P118,P125；通用探針:P113]NS5B區(qū)下劃線：引物序列；粗線：品種特異性探針序列(i)HCV亞型1a[基因庫：KP668776.1](序列號53)[引物:HCV-NS5B-3F,HCV-NS5B-3R；探針:NS5B-P25](i)HCV亞型1b[基因庫:AB989387.1](序列號54)[引物:HCV-NS5B-3F,HCV-NS5B-3R；探針:NS5B-P15]NS3區(qū)下劃線：引物序列；粗線：類型特異性探針序列；灰色和粗線：多態(tài)性區(qū)域(a)HCV亞型1a,K80[基因庫:KP668008.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT(序列號55)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P65](b)HCV亞型1a,K80[基因庫:KJ682984.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT(序列號56)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P32](c)HCV亞型1a,K80[基因庫:KM591981.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT(序列號57)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P55](d)HCV亞型1a,K80[基因庫:KM591978.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT(序列號58)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P69](e)HCV亞型1a,Q80[基因庫:KP667530.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCAATTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT(序列號59)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P57](f)HCV亞型1a,Q80[基因庫:KP668635.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCTGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGTAGGTCCTGGTCNACNTT(序列號60)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P20](g)HCV亞型1a,Q80[基因庫:KM591971.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATATGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT(序列號61)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P30](h)HCV亞型1a,Q80[基因庫:KP667508.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCTGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGTAGGTCCTGGTCNACNTT(序列號62)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P21](i)HCV亞型1a,Q80[基因庫:KP668211.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATATGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT(序列號63)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P31](j)HCV亞型1a,Q80[基因庫:KP667454.1]ACCATCGCATCACCCAAGGGTCCTGTCATCCAGATGTATACCTGTGGGCTGGCCCGCTCCTCAAGGTTCCCGCTCATTGACACCCTGCACCTGCGGCTCCTCGGACCTTTACCTGGTCACGAGGCACGCCGATGTCATTCCCGTGCGCCGGCGAGGTGATAGCAGGGGT AGGTCCTGGTCNACNTT(序列號64)[引物:HCV-NS3-3F,HCV-NS3-2R；探針:NS3-P22]質(zhì)量控制和陣列設(shè)計陽性對照(PositiveControl-PC)和陰性對照(NegativeControl-NTC)在每次檢測中是很重要的。對于擴(kuò)增，需要陽性對照(PC)來證明擴(kuò)增反應(yīng)的效率和特異性，亦需要陰性對照(NTC)來確定擴(kuò)增試劑是否被污染。對于雜交，需要陽性對照(PC)和陰性對照(NTC)來確定成功的信號顯影。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明包含一種內(nèi)部擴(kuò)增對照(InternalAmplificationControl-IAC)和雜交對照(HybridizationControl-HC)，以監(jiān)測擴(kuò)增和雜交反應(yīng)。這對于正確地解釋結(jié)果是很重要的，同時亦可以確保結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可改編陣列格式以增加更多的孔，從而快速且廉價地分析更大數(shù)量的核苷酸序列?？梢詫?shí)踐本發(fā)明的陣列可以采取任何格式，例如線性格式或“nxm”格式。根據(jù)測定的實(shí)際需要，可以將同一類型的探針固定在兩個或多個陣列位置上以同時進(jìn)行兩個或以上同樣的檢測。另一方面，不同類型的探針可以被固定在相同的陣列位置上以同時檢測不同的特定目標(biāo)。圖1的上部份顯示了本發(fā)明陣列格式的一個實(shí)施例，其中品種特異性探針和通用探針被固定同一個陣列上，以同時檢測個別HCV品種及HCV族群。在一個實(shí)施例中，一個或多個探針被固定在相同的陣列位置上，以共同地檢測一個或多個HCV基因型。例如，如圖1的下圖中所示，探針P118(序列號9)和P137(序列號10)被放在相同的陣列位置C1上，以共同HCV基因型1和6。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以將本發(fā)明的探針劃分成不同組合，以進(jìn)行不同的檢測。本發(fā)明的方法可以同時檢測特定的HCV品種和HCV族群.因此,除了檢測樣品是否感染HCV以及鑒定HCV基因型1-6之外，本發(fā)明還可以確定患者是否被未知或未發(fā)現(xiàn)的HCV基因型、亞型或株系感染。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的通用探針已被證實(shí)能夠在血清和血漿樣品中檢測超過90％的流行性HCV感染。與目前相大部分旨在檢測已知HCV品種的方法相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于能夠檢測HCV的共同核酸(即HCV族群)，進(jìn)而提供了一種具有更高覆蓋率的檢測方法。圖1-2顯示了本發(fā)明所述的陣列格式的一個實(shí)施例以及其預(yù)期結(jié)果。如陣列位置U、IAC和HC出現(xiàn)陽性信號，但不存在于其他品種特異性陣列位置中，則表示樣品包含來自未知的HCV基因型或未被品種特異性探針涵蓋的HCV基因型 的核酸。內(nèi)部擴(kuò)增對照(InternalAmplificationControl-IAC)內(nèi)部擴(kuò)增對照(IAC)可以用來監(jiān)測擴(kuò)增過程或作為一個內(nèi)部對照以測試擴(kuò)增反應(yīng)是否存在抑制擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)。用來設(shè)置內(nèi)部擴(kuò)增對照(IAC)的核酸模板包括并不涵蓋人類或HCV基因組的人工序列，或者在測試樣品中并不存在的人工序列，從而確保測試樣品的質(zhì)量或數(shù)量不會影響IAC的測定結(jié)果。例如，可以將IAC核酸模板和引物添加到樣品中，從而在擴(kuò)增反應(yīng)中同時制造目標(biāo)核酸的擴(kuò)增子和內(nèi)部對照的擴(kuò)增子。然后，將對應(yīng)IAC序列的檢測試劑放在陣列或膜上的IAC區(qū)中，以檢測內(nèi)部對照擴(kuò)增子的存在。IAC信號出現(xiàn)表示擴(kuò)增反應(yīng)成功。IAC信號和測試樣品信號不存在時則表示抑制擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)或存在并阻礙擴(kuò)增反應(yīng)的正常運(yùn)作。IAC亦可以用于監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)的效率。另外，IAC信號的強(qiáng)度可以用來顯示是隨后的雜交和信號顯影步驟是否成功或充分。IAC信號太弱可能表示雜交和/或信號顯影的程序不佳，繼而需要調(diào)整雜交條件或更換信號顯影試劑。在一個實(shí)施例中，IAC引物包含序列號65-66以擴(kuò)增IAC序列，以及包含序列號67的探針以檢測IAC序列，所述IAC引物及探針對應(yīng)包含序列號68的IAC序列。在另一個實(shí)施例中，其他不與人類和HCV基因組出現(xiàn)交叉反應(yīng)的其他核酸序列亦可被設(shè)計并與本發(fā)明的引物和探針結(jié)合使用。內(nèi)部擴(kuò)增對照(IAC)引物和探針目標(biāo)引物ID引物序列(5'到3')5'修飾長度序列號IACIAC-R-F2CGAGTTCCCGCCCATAACC-1965IACIAC-R-R2GGAAGTTGCAACGCCGTCC生物素1966目標(biāo)探針I(yè)D探針序列(5'到3')5'修飾長度序列號IACIAC-R-P2CTCGAATGCCTCGTATCAT胺基1967IAC克隆序列(在載體pUC57中克隆)(下劃線＝引物序列；粗體＝探針序列)(序列號68)：雜交對照(HybridizationControl-HC)本發(fā)明亦可在測試陣列加入雜交對照(HC)，以驗(yàn)證信號顯影的過程。在一個實(shí)施例中，雜交對照(HC)包含與信號顯影系統(tǒng)兼容的分子或試劑(例如酶結(jié)合物)，用來產(chǎn)生陽性信號。HC信號不存在時可能表示信號顯影試劑有問題，或者信號顯影程序不適當(dāng)。本發(fā)明可通過設(shè)置一個或多個陽性對照(Positivecontrol,PC)和陰性對照(Negativecontrol,NTC)以驗(yàn)證測試結(jié)果。陽性對照(PC)由可以與任何非IAC引物和探針發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生陽性信號的核酸模板設(shè)置,用來確保測定程序適當(dāng)。陰性對照(NTC)則不含有任何核酸,以確定擴(kuò)增和雜交試劑有否被污染。陽性對照(PC)在一個實(shí)施例中，一個來自HCV品種的核酸，例如HCV亞型1a可被用作陽性克隆以設(shè)置陽性對照(PC)。在陽性對照中,所測試的為陽性克隆而非測試樣品。在一個實(shí)施例中，陽性克隆對應(yīng)HCV亞型1a5’-UTR的DNA,并包含序列號69的DNA，所述序列號69的DNA被克隆到載體pUC57中。在一個實(shí)施例中，陽性克隆能夠被包含序列號1-2和6-7的引物擴(kuò)增，并可以被包含序列號9和11的品種特異性探針以及包含序列號41的通用探針檢測。陽性對照克隆序列(在載體pUC57中)(下劃線：引物序列；粗體：品種特異性探針序列；灰體和下劃線：通用探針序列)(序列號69)：[引物:HCV-C-1F,HCV-C-10R,HCV-C-6F,HCV-C-6R；探針:P118,P29；通用探針:P113]如果測試程序正常，陽性信號應(yīng)出現(xiàn)在相應(yīng)的陣列位置上。例如，如圖2中所示，樣品“陽性對照”應(yīng)在陣列位置B1(HCV1)、C1(HCV1/6)、U、IAC和HC顯示陽性信號，這表示測試程序正常。在另一個實(shí)施例中，陽性對照是一個對應(yīng)于其他已知HCV物種其5’-UTR的DNA。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以設(shè)計其他兼容的陽性對照系統(tǒng)與本發(fā)明結(jié)合使用。陰性對照(NTC)在一個實(shí)施例中，可以將來自患者的核酸換成合適的緩沖液，以設(shè)置陰性對照(NTC)。由于不存有任何測試樣品/核酸或陽性克隆，陰性對照(NTC)預(yù)期只產(chǎn)生IAC和HC信號。例如，如圖2中所示，樣品“陰性對照”只顯示IAC和HC信號。如陰性對照(NTC)中存在IAC和HC信號以外的信號，則可能顯示試劑已被污染。本發(fā)明的應(yīng)用本發(fā)明提供一系列專門設(shè)計的核酸引物和探針，可以與逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增法和導(dǎo)流雜交技術(shù)相兼容,并可以快速及靈敏地檢測、辨認(rèn)或區(qū)分各種HCV基因型、亞型和株系。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用來檢測、辨認(rèn)或區(qū)分HCV或來自HCV的核酸的方法和試劑盒。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種檢測、辨認(rèn)或區(qū)分各種HCV基因型、亞型和株系的方法和試劑盒。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的方法和測試劑可以檢測或鑒定HCV基因型1、2、3、4、5和6，或者區(qū)分這些HCV物種。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明可以檢測其他已知或未知的HCV基因型、亞型或株系。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明可以檢測或鑒定HCV基因型1、2、3、4、5和6的5’端的非翻譯區(qū)(5’-untranslatedregion,5’-UTR)，或者其他已知或未知HCV基因型、亞型或株系的5’-UTR.在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的探針以表1及圖1的下圖所示的陣列格式排列，或以其他陣列格式排列。表1-本發(fā)明的一種陣列格式陣列位置序列號探針I(yè)DB18P43C19,10P118,P137D111P29E112P55F113P102B317,18P14,P71C314,15P28,P110D316P13E318,20P23,P50F322P125E420,21P50,P60U(B5)41,42,43P113,P114,P117IAC(E5)67IAC‐R‐P2HC(F5)//在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針用于檢測和區(qū)分HCV亞型1a和1b。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明的引物和探針用于檢測和區(qū)分HCV亞型1a的NS3基因中K80和Q80多態(tài)性。圖6-7顯示了本發(fā)明的陣列格式的另一種實(shí)施例，以及其預(yù)期結(jié)果。如陽性信號出現(xiàn)在陣列位置U、IAC和HC但不存在于任何對應(yīng)HCV品種的陣列位置上，則可能表示樣品包含來自未知HCV基因型或未被品種特異性探針涵蓋的HCV基因型的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的探針以表2及圖6的上圖所示的陣列格式排列。圖7顯示數(shù)個HCV基因型所得的預(yù)期陣列結(jié)果。表2-本發(fā)明的一種陣列格式在一個實(shí)施例中，本發(fā)明可與逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增法和導(dǎo)流雜交技術(shù)結(jié)合使用，以檢測、辨認(rèn)或區(qū)分各種HCV。本發(fā)明不需要分開逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增法(即不需使用兩步法RT-PCR),亦不需使用需時較長和繁瑣程序的雜交設(shè)備。本發(fā)明能夠更快速檢測來自樣品和人類標(biāo)本的HCV及提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，有利于管理和治療HCV感染者。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以檢測樣品是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的一個或多個核酸序列。此方法包含以下步驟：a)獲得一個包含模板核酸的樣品；b)用引物從模板核酸擴(kuò)增一個或多個選定的核酸，從而得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物；以及c)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針雜交，其中獲得的雜交結(jié)果顯示樣品是否存在所述核酸序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以檢測一名受試者或一個樣品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)。此方法包含以下步驟：a)獲得一個包含模板核酸的樣品；b)用引物從模板核酸擴(kuò)增一個或多個選定的核酸，從而得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物；以及c)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針雜交，其中獲得的雜交結(jié)果顯示受試者或樣品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以區(qū)分受試者或樣品中的丙型肝炎病毒(HCV)，其中所述HCV具有的基因型選自基因型1、2、3、4、5或6。此方法包含以下步驟：a)獲得一個包含模板核酸的樣品；b)用引物從模板核酸擴(kuò)增一個或多個選定的核酸，從而得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物；以及c)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針雜交，其中獲得的雜交結(jié)果顯示受試者或樣品中的丙型肝炎病毒(HCV)的基因型。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以區(qū)分受試者或樣品中的丙型肝炎病毒(HCV)的亞型1a和1b。此方法包含以下步驟：a)獲得一個包含模板核酸的樣品；b)用引物從模板核酸擴(kuò)增一個或多個選定的核酸，從而得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物；以及c)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針雜交，其中獲得的雜交結(jié)果顯示受試者或樣品中丙型肝炎病毒(HCV)的基因型。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以檢測受試者或樣品中丙型肝炎病毒(HCV)的非結(jié)構(gòu)基因NS3的多態(tài)性。此方法包含以下步驟：a)獲得一個包含模板核酸的樣品；b)用引物從模板核酸擴(kuò)增一個或多個選定的核酸，從而得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物；以及c)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物與固定的寡核苷酸探針雜交，其中獲得的雜交結(jié)果顯示受試者或樣品中丙型肝炎病毒(HCV)NS3基因的多態(tài)性。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以確定受試者是否被HCV感染。在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法，確定受試者是否被一種或多種HCV類型感染。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以評估HCV感染者對治療的反應(yīng)。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以確定受試者的HCV感染是否復(fù)發(fā)。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以檢測樣品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的核酸。所述方法包含以下步驟：a)獲得一個包含模板核酸的樣品；b)使用兩個或多個包含選自序列號為1-7的引物擴(kuò)增模板核酸，從而得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物；以及c)將擴(kuò)增產(chǎn)物與一個或多個包含選自序列號8-22和41-43的寡核苷酸探針雜交，從而獲得雜交結(jié)果。其中，包含序列號8-22的寡核苷酸探針能夠捕獲來自一個或多個HCV基因型的核酸，包含序列號41-43的寡核苷酸探針能夠捕獲來自HCV的共有核酸。所得的雜交結(jié)果顯示樣品中是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的丙型肝炎病毒(HCV)基因型可以是HCV基因型1、2、3、4、5或6。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的檢測HCV方法可以額外使用包含序列號23-24的引物及序列號25-28的探針來檢測HCV亞型1a和HCV亞型1b的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的檢測HCV方法可以額外使用包含序列號29-30的引物及序列號31-40的探針來檢測丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)基因NS3的多態(tài)性。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的檢測HCV方法進(jìn)一步包含一個在樣品中加入一內(nèi)部對照的步驟,以及使用內(nèi)部對照引物和內(nèi)部對照探針以擴(kuò)增和雜交所述內(nèi)部對照的步驟,其中所述內(nèi)部對照不包含HCV的核酸序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的內(nèi)部對照包含序列號68，內(nèi)部對照引物包含序列號65-66，內(nèi)部對照探針包含序列號67。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的引物和探針可以與一種或多種作用劑結(jié)合,所述作用劑選自生物素、胺基或信號生成標(biāo)記。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的檢測HCV方法的擴(kuò)增步驟包括逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增過程。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的檢測HCV方法使用導(dǎo)流雜交技術(shù)進(jìn)行雜交步驟。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種方法以檢測樣品中丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)基因NS3的多態(tài)性。所述方法包含以下步驟：a)獲得一個包含模板核酸的樣品；b)使用包含序列號29-30的引物擴(kuò)增模板核酸，從而得到目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物；以及c)將擴(kuò)增產(chǎn)物與包含序列號31-40的寡核苷酸探針雜交，從而獲得雜交結(jié)果。其中，包含序列號31-40的寡核苷酸探針能夠檢測編碼NS3蛋白中賴氨酸-80的核苷酸序列,包含序列號35-40的寡核苷酸探針能夠檢測編碼NS3蛋白中谷氨酰胺-80的核苷酸序列。所得的雜交結(jié)果顯示樣品中丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)基因NS3的多態(tài)性。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的檢測HCVNS3多態(tài)性的方法可以額外使用包含序列號23-24的引物和序列號25-28的探針，以檢測HCV亞型1a和HCV亞型1b的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的檢測HCVNS3多態(tài)性的方法進(jìn)一步包含一個在樣品中加入一內(nèi)部對照的步驟,以及使用內(nèi)部對照引物和內(nèi)部對照探針以擴(kuò)增和雜交所述內(nèi)部對照的步驟,其中所述內(nèi)部對照不包含HCV的核酸序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的內(nèi)部對照包含序列號68，內(nèi)部對照引物包含序列號65-66，內(nèi)部對照探針包含序列號67。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種使用寡核苷酸以檢測樣品中來自丙型肝炎病毒(HCV)的核酸的應(yīng)用，所述寡核苷酸包含一個或多個選自序列號為1-7的序列，以及一個或多個選自序列號為8-22和41-43的序列。在一個實(shí)施例中，包含序列號8-22的寡核苷酸能夠捕獲來自一個或多個HCV基因型的核酸，以及包含序列號41-43的寡核苷酸能夠捕獲HCV的共有核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的丙型肝炎病毒(HCV)基因型可以是HCV基因型1、2、3、4、5或6。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的應(yīng)用可以額外使用包含序列號23-28的寡核苷酸來檢測HCV亞型1a和HCV亞型1b的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的應(yīng)用可以額外使用包含序列號29-40的寡核苷酸來檢測丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)基因NS3的多態(tài)性。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的應(yīng)用中的寡核苷酸進(jìn)一步包含一內(nèi)部對照序列，和用于擴(kuò)增和雜交所述內(nèi)部對照序列的內(nèi)部對照引物和內(nèi)部對照探針,所述內(nèi)部對照序列不包含HCV的核酸序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的內(nèi)部對照序列包含序列號為68的序列，所述內(nèi)部對照引物包含序列號為65-66的序列，以及所述內(nèi)部對照探針包含序列 號為67的序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的引物和探針可以與一種或多種作用劑結(jié)合,所述作用劑選自生物素、胺基或信號生成標(biāo)記。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種檢測樣品中丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)基因NS3的多態(tài)性的應(yīng)用,所述的寡核苷酸包含序列號為29-30和31-40的序列。在一個實(shí)施例中，包含序列號31-34檢測編碼NS3蛋白中賴氨酸-80的核苷酸序列，以及包含序列號35-40的寡核苷酸能夠檢測編碼NS3蛋白中谷氨酰胺-80的核苷酸序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的應(yīng)用可以額外使用包含序列號23-28的寡核苷酸來檢測HCV亞型1a和HCV亞型1b的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的應(yīng)用中的寡核苷酸進(jìn)一步包含一內(nèi)部對照序列，和用于擴(kuò)增和雜交所述內(nèi)部對照序列的內(nèi)部對照引物和內(nèi)部對照探針,所述內(nèi)部對照序列不包含HCV的核酸序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述的內(nèi)部對照序列包含序列號為68的序列，所述內(nèi)部對照引物包含序列號為65-66的序列，以及所述內(nèi)部對照探針包含序列號為67的序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一個用來檢測樣品是否存在丙型肝炎病毒(HCV)的測試劑,測試劑包含序列號為1-7，8-22和41-43的寡核苷酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑進(jìn)一步包含序列號為23-24的寡核苷酸，和一個或多個包含選自序列號25-28的寡核苷酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑進(jìn)一步包含序列號為29-30的寡核苷酸，和一個或多個包含選自序列號31-40的寡核苷酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑進(jìn)一步包含對應(yīng)于內(nèi)部對照序列的內(nèi)部對照引物和內(nèi)部對照探針，所述內(nèi)部對照序列不包含HCV核酸序列的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑的內(nèi)部對照引物包含序列號為65-66的序列，所述內(nèi)部對照探針包含序列號為67的序列，所述內(nèi)部對照序列包含序列號為68的序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑的一個或多個寡核苷酸被修飾或與一個或多個作用劑結(jié)合,所述作用劑選自生物素、胺基或信號生成標(biāo)記。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一個用來檢測(HCV)非結(jié)構(gòu)基因NS3的多態(tài)性的測試劑,測試劑包含序列號為29-30的寡核苷酸，和一個或多個包含選自序列號31-40的寡核苷酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑進(jìn)一步包含序列號為23-24的寡核苷酸，和一個或多個包含選自序列號25-28的寡核苷酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑進(jìn)一步包含對應(yīng)于內(nèi)部對照序列的內(nèi)部對照引物和內(nèi)部對照探針，所述內(nèi)部對照序列不包含HCV核酸序列的核酸。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑的內(nèi)部對照引物包含序列號為65-66的序列，所述內(nèi)部對照探針包含序列號為67的序列，所述內(nèi)部對照序列包含序列號為68的序列。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的測試劑的一個或多個寡核苷酸被修飾或與一個或多個作用劑結(jié)合,所述作用劑選自生物素、胺基或信號生成標(biāo)記。通過引用以下的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解所提供的實(shí)施例僅作為說明作用，而非限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍將由隨后的權(quán)利要求所界定。在本申請中的，引用了不同的參考文獻(xiàn)或出版物。這些參考或出版物的全文和公開都結(jié)合到本申請中,從而更全面地描述本發(fā)明的情況。應(yīng)當(dāng)指出的是，過渡語“包含”與‘包括’﹑‘含有’或‘以…為特征’是同義的，是包括性或開放式的，當(dāng)中并不排除有另外未列舉的元素或方法步驟。附圖說明圖1顯示了一個用于檢測、辨認(rèn)或區(qū)分HCV基因型1-6的檢測陣列,其中固定有本發(fā)明的通用探針和對應(yīng)特定HCV的品種探針。圖的上部分為陣列中每個測定位置的名稱。圖的下部分為每個測定位置中所用的寡核苷酸探針。圖2顯示了本發(fā)明的陣列的一個實(shí)施例，以及測試各種HCV基因型和對照組的預(yù)期測試結(jié)果。圖3顯示了測試8個載有HCV基因型1-6的核苷酸的合成克隆的實(shí)際測試結(jié)果。其中提供了預(yù)期結(jié)果以作參考。圖4顯示了測試本發(fā)明其中一個實(shí)施例其檢測極限的實(shí)際結(jié)果,并提供預(yù)期結(jié)果以作參考。該實(shí)驗(yàn)測試了4個載有HCV基因型1-4的核苷酸的合成克隆其連續(xù)稀釋樣本，其中濃度范圍為2.5x102IU/mL到2.3x104IU/mL。圖5顯示了測試35個臨床樣品的實(shí)際測試結(jié)果。其中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)實(shí)時PCR和直接測序法驗(yàn)證。圖6顯示了一個用于鑒定HCV基因型1-6和HCV亞型1a的NS3Q80K多 態(tài)性的檢測陣列,其中固定有本發(fā)明的品種探針和通用探針。圖的上部分為每個測定位置中所用的寡核苷酸探針。圖的下部分為陣列中每個測定位置的名稱。圖7顯示了本發(fā)明的一個陣列，以及測試展現(xiàn)NS3Q80K多態(tài)性的HCV亞型1a和1b的預(yù)期測試結(jié)果。圖8顯示了測試載有相應(yīng)于HCV亞型1a的NS3和NS5B基因的核酸的合成克隆所得的實(shí)際測試結(jié)果。克隆1-6載有NS3基因(K80)的自然序列，克隆7-10則載有包含NS3Q80K多態(tài)性的序列。圖9顯示了測試本發(fā)明的引物和探針其交叉反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)測試了一個陰性對照以及9個載有HCV基因型1-6、HCV亞型1a和1b或人類DNA核酸的合成克隆。具體實(shí)施方式實(shí)施例1核算擴(kuò)增本實(shí)施例描述本發(fā)明的一個實(shí)施方案，其中本發(fā)明與逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合使用。RNA制備本發(fā)明使用的RNA可以使用任何市售或適當(dāng)?shù)姆椒ɑ蛟噭┖校瑥臉悠分刑崛』蛑苽?。本發(fā)明的樣品可以是任何類型的樣品，包括來自任何受試者或來源的核酸。在一個實(shí)施例中，樣品是生物樣品，如血液、血清、血漿、唾液、痰、精液、淋巴液或其他體液。在另一個實(shí)施例中，樣品包括已從生物樣品中粗略純化的核酸。一步法RT-PCR擴(kuò)增(RT-PCR)在一個實(shí)施例中，可使用以下方案設(shè)置RT-PCR：反應(yīng)混合液成分容量(μL)HCVPCR預(yù)混合13.4IAC0.1酶混合液1.5RNA模板多達(dá)10.0*無核酸酶水可變總計25.0溫度設(shè)置階段步驟溫度(℃)時間放置逆轉(zhuǎn)錄5030分鐘放置初始變性9515分鐘變性9430秒42個循環(huán)退火6130秒延伸7230秒放置最終延伸7210分鐘放置最終放置4∞在一個實(shí)施例中，使用RNA模板的陽性克隆作為陽性對照。在另一個實(shí)施例中，使用水或ddH2O而非RNA模板，來設(shè)置陰性對照(NTC)。任何內(nèi)部或市售系統(tǒng)，包括但不限于適用于提取RNA、對目標(biāo)核酸進(jìn)行的處理、逆轉(zhuǎn)錄和/或PCR擴(kuò)增的酶、試劑、材料和設(shè)備，均可以與本發(fā)明結(jié)合使用。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可以調(diào)整任何相關(guān)參數(shù)來實(shí)踐本發(fā)明。實(shí)施例2快速導(dǎo)流雜交本實(shí)施例描述本發(fā)明的一個實(shí)施方案，其中本發(fā)明與導(dǎo)流雜交技術(shù)結(jié)合使用。在一個實(shí)施例中，檢測、辨認(rèn)或區(qū)分HCV的方法包含以下步驟：a)將含有目標(biāo)核酸的溶液變性并與膜接觸；b)用洗滌溶液洗滌膜；以及c)顯色，并以目視檢測或光譜測量。一般而言，與本發(fā)明一起使用的檢測試劑可以是任何已知可用于檢測核酸的試劑。檢測試劑包括但不限于酶、抗體、蛋白質(zhì)、熒光化學(xué)試劑、發(fā)色團(tuán)和視覺染料。在一個實(shí)施例中，目標(biāo)核酸在RT-PCR擴(kuò)增期間被生物素標(biāo)記(例如使用生物素標(biāo)記的目標(biāo)特異性引物)，并被鏈霉親和素辣根過氧化物酶組成的交聯(lián)酶捕獲，從而在陣列上產(chǎn)生信號，指示目標(biāo)核酸的存在。對于定量測量，可以使用掃描儀/光譜成像儀和成像軟件來執(zhí)行分析。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明使用一步法RT-PCR的雜交過程，其中目標(biāo)核酸被熒光標(biāo)簽、量子點(diǎn)、膠體金顆?；蚱渌m用標(biāo)記物標(biāo)記，因此不需要使用與酶交聯(lián)的底物進(jìn)行顯色步驟。這些設(shè)計可以使技術(shù)人員在較短時間內(nèi)并使用較少量的試劑完成整個雜交過程。對于定量測量，可以在洗滌步驟之后，立即使用掃描儀/光譜成像儀分析經(jīng)熒光染料標(biāo)記的目標(biāo)核酸。本發(fā)明可使用任何能固定核酸的膜。上述的膜包括但不限于硝化纖維素、尼龍和NytranTM。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以改編陣列格式以增加更多的孔，以快速且廉價地分析更大量的核苷酸序列。材料和方法在一個實(shí)施例中，可使用以下方案設(shè)置雜交：雜交前準(zhǔn)備(1)使用前，將雜交溶液(如2×SSC或任何市售的溶液/產(chǎn)品+0.05％tween20)在水浴中預(yù)熱至49℃。如果封閉溶液中有沉淀物，將封閉溶液在49℃下溫育直至沉淀溶解。在整個雜交過程中保持溫度在49℃，以保持設(shè)定的嚴(yán)格性。(2)配置顯色溶液,例如將一片NBT/BCIP片劑溶解在10毫升的顯色溶液或PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)中。稀釋好的顯色溶液避光保存，未使用的溶液儲存在4℃。(3)將雜交溶液(2×SSC+0.05％tween20)平衡至室溫。(4)將所有含核酸的樣品在95℃下加熱5分鐘以變性，然后立即放在冰上冷卻至少兩分鐘。雜交設(shè)置對于導(dǎo)流雜交，技術(shù)人員可以使用美國專利號6,020,187中描述的直接導(dǎo)流設(shè)備或者橫向流動設(shè)備。接通雜交裝置電源，加入蒸餾水以洗滌雜交室。將已固定有探針的膜放入雜交室內(nèi)并用蓋子或其他方法固定膜。已擴(kuò)增核酸產(chǎn)物的雜交加入500μL預(yù)熱的雜交溶液覆蓋全膜，以進(jìn)行預(yù)雜交。孵育至少2分鐘，蓋上蓋子，防止在預(yù)雜交過程中熱量散失。確保溫度在設(shè)定值達(dá)到平衡。加入500μL預(yù)熱的雜交溶液至每個變性的核酸的樣品中,然后將核酸樣品加到指定的孔中。將每個核酸樣品輸送到膜表面，直到膜被完全覆蓋，在49℃下溫育5分鐘，然后讓核酸樣品在整個膜上流動。雜交通常在5-30秒內(nèi)完成。5分鐘的溫育時間是為了保證DNA樣品的溫度達(dá)到設(shè)定的溫度。用500μL的雜交溶液洗膜3次。顯色溫度設(shè)定為25℃，將500μL封閉溶液分散在膜上，并溫育5分鐘，然后抽空溶液。關(guān)閉泵，并加入500μL酶交聯(lián)物。讓膜靜置8分鐘。啟動泵。溫度設(shè)定為36℃。用500μL溶液A或洗滌緩沖液如pH7.4的PBS緩沖液，徹底洗滌膜三次。關(guān)閉泵，向每個孔中注入500μL封閉溶液，蓋上蓋子，溫育1分鐘，然后抽空溶液。當(dāng)溫度達(dá)到36℃時，關(guān)閉泵，向每個孔中注入500μL檢測溶液(例如NBT/BCIP溶液)。蓋上蓋子，溫育5分鐘，但是少于10分鐘，或者直到顯色。打開泵，移走檢測溶液。關(guān)閉泵，注入500μL停止溶液，并溫育約1分鐘。打開泵，移走停止溶液。用500μLdH2O漂洗膜一到兩次最好在一個小時以內(nèi)，盡快檢查結(jié)果?？梢灾苯佑萌庋塾^察，或者掃描圖像以進(jìn)行半定量檢測(即通過樣品之間的相對信號強(qiáng)度來定量)。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明一次處理眾多樣品，并需要大約4個小時完成整個基因型分析(從RNA制備到結(jié)果解釋)，與傳統(tǒng)基因分型技術(shù)相比，本發(fā)明是非常高產(chǎn)量且高效的。結(jié)果解釋和驗(yàn)證在一個實(shí)施例中，本發(fā)明的探針被配置成如圖1所示陣列格式，技術(shù)人員可以如下表3中的概述，辨認(rèn)或區(qū)分各種不同的HCV基因型。只有當(dāng)測試陣列上存在IAC和HC信號時，并且陰性對照(NTC)僅顯示IAC和HC信號的情況下， 測試結(jié)果才是有效的。表3—本發(fā)明一個實(shí)施例的結(jié)果及解釋應(yīng)指出的是，表3中所列結(jié)果解釋只是說明性的，而非排他性的，也并不意味著限制本發(fā)明的其他可能出現(xiàn)的其他結(jié)果及解釋。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明可以區(qū)分HCV亞型1a和1b，其中HCV亞型1a是通過品種特異性探針I(yè)DP43,P118和P29(序列號8,9和11)檢測，而HCV亞型1b是通過品種特異性探針I(yè)DP118和P29(序列號9和11)檢測。在另一個實(shí)施例中，還可以使用序列號25-26探針來檢測HCV亞型1a，及使用序列號27-28引物來檢測HCV亞型1b，從而提高檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度。在特殊的情況下，如果病毒核酸的拷貝數(shù)量非常高，極弱的信號可能會出現(xiàn)在不相關(guān)陣列位置上。例如，在高拷貝量的HCV基因型1、4或6中，可能會出現(xiàn)來自探針I(yè)DP50和P60(序列號20-21，陣列位置E4)的微弱信號；在高拷貝量的HCV基因型2中，可能會出現(xiàn)來自探針I(yè)DP23和P50(序列號19-20，陣列位置E3)的微弱信號；在高拷貝量的HCV基因型5中，可能會出現(xiàn)來自探針I(yè)DP118和P137(序列號9-10，陣列位置C1)的微弱信號；在高拷貝量的HCV 基因型6中，可能會出現(xiàn)來自探針I(yè)DP14和P71(序列號17-18，陣列位置B3)的微弱信號。然而，與真正的陽性信號相比，這些非不相關(guān)的信號的強(qiáng)度通常是非常低的。因此，如果在上述情況下觀察到一個極弱的不相關(guān)性信號，測試結(jié)果仍然是有效的。在這情況下，可以嘗試稀釋樣品(例如稀釋10倍)并重復(fù)測試，以證實(shí)結(jié)果。實(shí)施例3使用合成克隆的驗(yàn)證本實(shí)施例說明使用本發(fā)明檢測和辨認(rèn)來自各種HCV基因型的核酸的一個實(shí)施方案。本實(shí)施例使用戴有來自各種HCV基因型的5’-UTR相應(yīng)序列的克隆以評估本發(fā)明所述引物和探針的特異性和靈敏度。圖3顯示載有來自HCV基因型1、2、3、4、5或6的核酸序列的8個合成克隆的測試結(jié)果。使用本發(fā)明以擴(kuò)增來自八個克隆的目標(biāo)核酸。然后，按照上文所述的程序，將所生成的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交。測試結(jié)果顯示，本發(fā)明能夠擴(kuò)增且檢測來自全部8個克隆的目標(biāo)核酸，并且與預(yù)期結(jié)果和驗(yàn)證對照組的結(jié)果一致。圖4顯示載有來自HCV基因型1、2、3或4的核酸序列的4個合成克隆的測試結(jié)果。用緩沖液稀釋克隆，并用本發(fā)明測試稀釋物。在一個實(shí)施例中，制備克隆連續(xù)稀釋液，濃度范圍從最低2.5x102IU/mL到最高2.3x104IU/mL，以評估本發(fā)明的靈敏度。圖4的結(jié)果顯示，本發(fā)明能夠檢測和鑒定目標(biāo)核酸，核酸的檢測極限低至2.5x102IU/mL。實(shí)施例4臨床樣品的基因分型本實(shí)施例說明使用本發(fā)明并采取圖1陣列格式鑒定臨床樣品的HCV基因型的一個實(shí)施方案。圖5顯示從被HCV基因型1、3或6感染的35份臨床樣品獲得的測試結(jié)果。由于沒有合適的臨床樣品，本實(shí)施例沒有測試其他基因型。使用直接測序方法可確認(rèn)每個樣品中HCV的基因型，直接測序方法的結(jié)果與本發(fā)明的測試結(jié)果相一致。本實(shí)施例亦使用實(shí)時PCR以評估每個樣品中目標(biāo)病毒RNA的數(shù)量，并以IU/ml表示。表4總結(jié)了測試所得的結(jié)果。表4-來自35份臨床樣品的測試結(jié)果*樣品中病毒RNA量降至檢測下限(LOD)以下。本發(fā)明的品種特異性探針可以檢測目標(biāo)HCV的基因型，上述全部35個臨床樣品的檢測結(jié)果均合符預(yù)期，并經(jīng)直接測序結(jié)果證實(shí)。另一方面，陣列位置U(B5)上的通用探針可以在全部35個樣品中檢測HCV。另外，除了IAC和HC信 號，也可以根據(jù)陽性對照(PC)(即使用來自HCV基因型1的克隆)的結(jié)果，以及的陰性對照(NTC)(即使用使用緩沖液)的結(jié)果(數(shù)據(jù)未在此提供)，以驗(yàn)證本測試的結(jié)果。值得注意的是，被基因型6感染的樣品10號在檢測基因型4的陣列位置B3上觀察到一個微弱信號。如上所述，在高拷貝數(shù)量的HCV基因型6中，可能會額外出現(xiàn)來自探針I(yè)DP14和P71(序列號17-18，陣列位置B3)的微弱不相關(guān)信號。如圖5中所示，B3上的不相關(guān)信號非常弱，并不會影響測試結(jié)果的有效性。實(shí)施例5基因分型和基因亞型分型本實(shí)施例說明了使用本發(fā)明的引物和探針鑒定HCV基因型1-6并區(qū)分HCV亞型1a和1b的一個實(shí)施方案。在一個實(shí)施例中，本發(fā)明所述探針被設(shè)置成如圖6所示陣列格式，技術(shù)人員可以如下表5中所述，辨認(rèn)或區(qū)分各種HCV基因型。只有當(dāng)測試陣列上存在IAC和HC信號時，并且陰性對照(NTC)僅顯示IAC和HC信號的情況下，測試結(jié)果才是有效的。圖7顯示了陰性對照以及NS3-K80或NS3-Q80多態(tài)性的HCV亞型1a或1b的預(yù)期結(jié)果。表5-本發(fā)明一個實(shí)施例的結(jié)果及解釋(如圖7所示)圖8顯示載有對應(yīng)于HCV亞型1aNS3和NS5B基因的核酸的10個合成克隆的結(jié)果。本發(fā)明用于擴(kuò)增來自10個克隆的靶核酸。按照上文所述的程序，將所生成的擴(kuò)增產(chǎn)物與探針雜交。測試結(jié)果顯示，本發(fā)明能夠檢測在全部10個克隆中的目標(biāo)NS5B基因、NS3-K80或NS3-Q80多態(tài)性，并且與預(yù)期結(jié)果和驗(yàn)證對照組的結(jié)果一致。表6總結(jié)了測試所得的結(jié)果。表6-載有NS3基因K80或Q80的10個合成克隆的測試結(jié)果(如圖8所示)(下劃線為多態(tài)密碼子)克隆基因型克隆中的多態(tài)序列序列號#1K80TGTGGACAAAGACCTTGT70#2K80CGTGGACAAAGACCTTGT71#3K80AATGTAGACAAAGATCTTG72#4K80AATGTGGACAAAGATCTTG73#5K80AATGTAGACAAAGACCTTG74#6K80AACGTAGACAAAGACCTCG75#7Q80AATGTGGACCAAGACCT76#8Q80AATGTGGACCAGGACCT77#9Q80CCAATGTAGATCAAGACCT78#10Q80CCAATGTGGATCAAGACCT79圖9顯示一個測試本發(fā)明的引物和探針其交叉反應(yīng)性的實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)測試了包含緩沖液的陰性對照，以及載有對應(yīng)于HCV基因型1-6、HCV亞型1a和1b或者人類DNA的核酸的9個合成克隆。表7總結(jié)了測試所得結(jié)果。表7-本發(fā)明的引物和探針的特異性樣品基因型#1HCV1b,NS3-K80#2HCV1b,NS3-Q80#3HCV2#4HCV3#5HCV4#6HCV5#7HCV6#8HCV6#9人類DNA#10陰性(NTC)圖9的結(jié)果顯示，本發(fā)明的引物和探針并不會與人類核酸或非目標(biāo)的核酸產(chǎn)生交叉反應(yīng)，并且能夠明確地及準(zhǔn)確地鑒定HCV基因型，并與預(yù)期結(jié)果一致。綜上所述，本發(fā)明所測試的結(jié)果明確闡明，本發(fā)明的引物和探針可以在一個或多個組別中共同使用，以擴(kuò)增和檢測來自各種不同HCV基因型的核酸，并能快速、靈敏、及準(zhǔn)確地區(qū)分HCV基因型。當(dāng)前第1頁1 2 3