本發(fā)明涉及一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP引物、本發(fā)明還涉及一種包括上述引物的試劑盒；本發(fā)明還涉及一種采用上述試劑盒檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病的方法。
背景技術(shù)：
黃瓜綠斑駁花葉病毒Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV是煙草花葉病毒屬Tobamovirus成員，為單鏈RNA病毒,病毒粒體桿狀300nm×18nm。黃瓜綠斑駁花葉病毒是典型的種傳病毒,且穩(wěn)定強(qiáng),主要分布地區(qū)在歐洲的英國、德國、荷蘭、丹麥、俄羅斯、希臘、奧地利、捷克斯洛伐克、芬蘭、南斯拉夫、羅馬尼亞、波蘭、匈牙利、西班牙、瑞典、烏克蘭、拉托維亞；南美洲的巴西；亞洲的日本、印度、韓國、巴基斯坦、以色列、沙特阿拉伯、伊朗、中國大陸局部地區(qū)及臺(tái)灣省等。隨著世界經(jīng)濟(jì)貿(mào)易往來頻繁,各國和地區(qū)間的引種及種質(zhì)交換,使得該病毒不斷擴(kuò)散,在一些葫蘆作物種植區(qū)廣泛發(fā)生。我國2005年在遼寧中部地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染西瓜,且發(fā)生嚴(yán)重,感病西瓜果肉呈過熟狀,使作物品質(zhì)和產(chǎn)量大幅度下降,以致造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。該病毒自然侵染主要是葫蘆科植物的黃瓜、西瓜、甜瓜、瓠子、南瓜、葫蘆、絲瓜、苦瓜等，黃瓜癥狀表現(xiàn)為葉片斑駁并凸起、畸形,造成植株矮化,果實(shí)上可產(chǎn)生黃或銀色條斑,果實(shí)嚴(yán)重受損，產(chǎn)量可下降15％；受侵染西瓜葉片輕型葉斑駁,植株矮化,果實(shí)成熟期癥狀嚴(yán)重,果實(shí)表面濃綠色圓斑,內(nèi)部出現(xiàn)果肉變色和腐爛。
帶毒種子和機(jī)械傳播是CGMMV的主要傳播途徑，如葫蘆種苗嫁接的西瓜生產(chǎn)方式是該病發(fā)生擴(kuò)散的重要因素,用作砧木的感病種子也是主要侵染來源。目前這些葫蘆科作物也無抗該病毒品種。因此,加強(qiáng)對(duì)引進(jìn)葫蘆科種子的檢疫,特別是對(duì)病區(qū)引進(jìn)的西瓜、甜瓜,南瓜等種子的病毒檢疫是阻斷或抑制該病毒發(fā)生擴(kuò)散的最好措施。
目前植物病毒的檢測(cè)方法主要有生物學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)三種，生物學(xué)方法就是用病毒指示植物來檢測(cè)病毒的存在與否，一般需要7-10天；血清學(xué)方法是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合來檢測(cè)病毒，一般只需要4-6小時(shí)左右，但是它需要特異性的抗血清，而且檢測(cè)靈敏度不高，還存在有非特異性問題；分子生物學(xué)方法主要是指PCR方法，該方法快且準(zhǔn)確性也比較高，但是需要昂貴的檢測(cè)儀器和相關(guān)設(shè)備，而且對(duì)于像CGMMV這個(gè)病毒，病毒粒子非常穩(wěn)定，即使高倍稀釋，也具有侵染力，故需要靈敏度非常高的檢測(cè)方法才能將潛在的CGMMV檢測(cè)出來，以上三種方法靈敏度都難以達(dá)到，這樣必將存在漏檢的可能，所以急需研究新的檢測(cè)方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP引物；
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種包含上述引物的試劑盒；
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種采用上述試劑盒檢測(cè)黃瓜綠斑駁花葉病的方法，該檢測(cè)方法具有：引物特異性強(qiáng)，設(shè)備簡單，快速、檢測(cè)靈敏度高、閉管檢測(cè)、操作簡單、結(jié)果直接可以判讀等特點(diǎn)。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP引物，其特征在于包括：
正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；
反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；
正向內(nèi)引物FIP：
5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：
F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；
F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
反向內(nèi)引物BIP：
5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；
B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’。
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；
反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；
正向內(nèi)引物FIP：
5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：
F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；
F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
反向內(nèi)引物BIP：
5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；
B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中該試劑盒的產(chǎn)品規(guī)格：40次。
如上所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP試劑盒，其特征在于所述的LAMP反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
如上所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP試劑盒，其特征在于所述熒光染料為鈣黃綠素；所述酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟：
A、提取樣品RNA；
B、建立LAMP反應(yīng)體系：
按檢測(cè)所需的反應(yīng)量從權(quán)利要求2所述的試劑盒中分別取各種試劑，放入滅菌試管中，在冰上配制預(yù)混液；輕彈擊滅菌試管使其混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒使溶液集中在滅菌試管底部；20μL LAMP反應(yīng)體包括：
C、加樣：
在三個(gè)裝有20μL LAMP反應(yīng)體的滅菌試管中分別加入待檢測(cè)的待檢測(cè)樣品RNA、陰性對(duì)照反應(yīng)樣品、陽性對(duì)照反應(yīng)樣品各5μL，使各自的總量達(dá)到25μL，蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時(shí)離心使反應(yīng)溶液集中在滅菌試管底部；其中陰性對(duì)照反應(yīng)使用去離子水作為樣品，陽性對(duì)照反應(yīng)使用帶有CGMM VRNA的陽性對(duì)照，
D、擴(kuò)增：
將步驟C中的滅菌試管放置在恒溫器中，在60-65℃下保持恒溫1小時(shí)，然后在80℃下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)；
E、檢測(cè)：
使用紫外線照射裝置從滅菌試管底部向上進(jìn)行照射，佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn)行觀查；如果與陽性對(duì)照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對(duì)照一樣沒有發(fā)出熒光，而判定為陰性。
如上所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，其特征在于步驟A中所述提取樣品RNA，具體按以下步驟提?。?/p>
a1、取0.1g的CGMMV和CMV感病組織加入1mL抽提緩沖液進(jìn)行研磨；
a2、清洗納米磁珠：取出納米磁珠到PCR管中，用ddH2O反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH2O；
a3、結(jié)合：加入100μL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；
a4、清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；
a6、取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為CGMMV和CMV的RNA。
如上所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，其特征在于步驟E中紫外線照射裝置的紫外線范圍：波長240－260nm或350-370nm。
如上所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述引物中外引物與內(nèi)引物的比例為l:2-1:10。
如上所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向內(nèi)引物FIP、0.2μl反向內(nèi)引物BIP。
如上所述的黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，其特征在于步驟D中擴(kuò)增溫度優(yōu)選為63℃。
綜上所述，本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)其有益效果是：
本發(fā)明采用磁珠法提取CGMMV的RNA并根據(jù)CGMMV主要株系的外殼蛋白編碼基因設(shè)計(jì)了檢測(cè)CGMMV的LAMP擴(kuò)增的通用型引物，且建立了CGMMV LAMP檢測(cè)的體系，通過本體系可以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)高靈敏度的檢測(cè)出CGMMV病毒的存在，檢測(cè)靈敏度達(dá)到10fg，比普通PCR要高出一千倍，且具有較好的特異性。另外本方法不要昂貴的儀器和設(shè)備，只需要一個(gè)保溫箱即可，操作簡單，檢測(cè)結(jié)果可以直接通過顏色的反應(yīng)來判讀，非常適合基層一線的使用，在種苗、花卉等繁殖材料病毒檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景和非常好的實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明引物特異性較好，靈敏度高；本發(fā)明檢測(cè)方法耗時(shí)短。需要昂貴的檢測(cè)儀器，檢測(cè)成本低。操作簡便
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：
本發(fā)明以下實(shí)施例中所采用材料：
1.材料
1.1黃瓜綠斑駁病毒(CGMMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)購自美國AGDIA公司。
1.2主要試劑和耗材
(1)RNA擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒Loopamp RNA Amplification kit；
(2)熒光目視檢測(cè)試劑盒；
(3)Fluorescence Detection Reagent；
(4)反應(yīng)試管等均購置于北京藍(lán)譜生物科技有限公司；
1.3主要儀器設(shè)備
(1)－80℃冷凍冰箱；
(2)Labofuge400R高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)；
(3)微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，2.5μL，；
(4)超純水系統(tǒng)，Milli－Q Academic，Millipore公司；
(5)超凈工作臺(tái)；
(6)漩渦混合器；
(7)LAMP實(shí)時(shí)濁度儀，LA－320C，日本榮研生物公司。
實(shí)施例1
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP引物，包括：
正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；
反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；
正向內(nèi)引物FIP：
5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：
F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；
F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
反向內(nèi)引物BIP：
5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；
B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’。
實(shí)施例2
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP試劑盒，該試劑盒包括有：
其中所述引物包括：
正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；
反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；
正向內(nèi)引物FIP：
5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：
F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；
F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
反向內(nèi)引物BIP：
5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；
B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中該試劑盒的產(chǎn)品規(guī)格：40次。
所述的LAMP反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
所述熒光染料為鈣黃綠素；所述酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向內(nèi)引物FIP、0.2μl反向內(nèi)引物BIP。
實(shí)施例3
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟：
A、提取樣品RNA；
B、建立LAMP反應(yīng)體系：
按檢測(cè)所需的反應(yīng)量試劑盒中分別取各種試劑，放入滅菌試管中，在冰上配制預(yù)混液；輕彈擊滅菌試管使其混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒使溶液集中在滅菌試管底部；20μL LAMP反應(yīng)體包括：
C、加樣：
在三個(gè)裝有20μL LAMP反應(yīng)體的滅菌試管中分別加入待檢測(cè)的待檢測(cè)樣品RNA、陰性對(duì)照反應(yīng)樣品、陽性對(duì)照反應(yīng)樣品各5μL，使各自的總量達(dá)到25μL，蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時(shí)離心使反應(yīng)溶液集中在滅菌試管底部；其中陰性對(duì)照反應(yīng)使用去離子水作為樣品，陽性對(duì)照反應(yīng)使用帶有CGMM VRNA的陽性對(duì)照，
D、擴(kuò)增：
將步驟C中的滅菌試管放置在恒溫器中，在60-65℃下保持恒溫1小時(shí)，然后在80℃下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)；
E、檢測(cè)：
使用紫外線照射裝置從滅菌試管底部向上進(jìn)行照射，佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn)行觀查；如果與陽性對(duì)照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對(duì)照一樣沒有發(fā)出熒光，而判定為陰性。
實(shí)施例4
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟：
A、提取樣品RNA；
a1、取0.1g的CGMMV和CMV感病組織加入1mL抽提緩沖液進(jìn)行研磨；
a2、清洗納米磁珠：取出納米磁珠到PCR管中，用ddH2O反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH2O；
a3、結(jié)合：加入100μL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；
a4、清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；
a6、取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為CGMMV和CMV的RNA；
B、建立LAMP反應(yīng)體系：
取-20℃下保存的試劑盒中國各種試劑在室溫下解凍，解凍后立即置于冰上保存；
按檢測(cè)所需的反應(yīng)量試劑盒中分別取各種試劑，放入滅菌試管中，在冰上配制預(yù)混液；輕彈擊滅菌試管使其混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒使溶液集中在滅菌試管底部；20μL LAMP反應(yīng)體包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向內(nèi)引物FIP、0.2μl反向內(nèi)引物BIP。
所述的LAMP反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
所述熒光染料為鈣黃綠素；所述酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；
反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；
正向內(nèi)引物FIP：
5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：
F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；
F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
反向內(nèi)引物BIP：
5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；
B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
C、加樣：
在三個(gè)裝有20μL LAMP反應(yīng)體的滅菌試管中分別加入待檢測(cè)的待檢測(cè)樣品RNA、陰性對(duì)照反應(yīng)樣品、陽性對(duì)照反應(yīng)樣品各5μL，使各自的總量達(dá)到25μL，蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時(shí)離心使反應(yīng)溶液集中在滅菌試管底部；其中陰性對(duì)照反應(yīng)使用去離子水作為樣品，陽性對(duì)照反應(yīng)使用帶有CGMM VRNA的陽性對(duì)照，
D、擴(kuò)增：
將步驟C中的滅菌試管放置在恒溫器中，在60℃下保持恒溫1小時(shí)，然后在80℃下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)；
E、檢測(cè)：
使用紫外線照射裝置從滅菌試管底部向上進(jìn)行照射，波長240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn)行觀查；如果與陽性對(duì)照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對(duì)照一樣沒有發(fā)出熒光，而判定為陰性。
實(shí)施例5
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟：
A、提取樣品RNA；
a1、取0.1g的CGMMV和CMV感病組織加入1mL抽提緩沖液進(jìn)行研磨；
a2、清洗納米磁珠：取出納米磁珠到PCR管中，用ddH2O反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH2O；
a3、結(jié)合：加入100μL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；
a4、清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；
a6、取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為CGMMV和CMV的RNA；
B、建立LAMP反應(yīng)體系：
取-20℃下保存的試劑盒中國各種試劑在室溫下解凍，解凍后立即置于冰上保存；
按檢測(cè)所需的反應(yīng)量試劑盒中分別取各種試劑，放入滅菌試管中，在冰上配制預(yù)混液；輕彈擊滅菌試管使其混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒使溶液集中在滅菌試管底部；20μL LAMP反應(yīng)體包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向內(nèi)引物FIP、0.2μl反向內(nèi)引物BIP。
所述的LAMP反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
所述熒光染料為鈣黃綠素；所述酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；
反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；
正向內(nèi)引物FIP：
5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：
F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；
F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
反向內(nèi)引物BIP：
5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；
B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
C、加樣：
在三個(gè)裝有20μL LAMP反應(yīng)體的滅菌試管中分別加入待檢測(cè)的待檢測(cè)樣品RNA、陰性對(duì)照反應(yīng)樣品、陽性對(duì)照反應(yīng)樣品各5μL，使各自的總量達(dá)到25μL，蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時(shí)離心使反應(yīng)溶液集中在滅菌試管底部；其中陰性對(duì)照反應(yīng)使用去離子水作為樣品，陽性對(duì)照反應(yīng)使用帶有CGMM VRNA的陽性對(duì)照，
D、擴(kuò)增：
將步驟C中的滅菌試管放置在恒溫器中，在65℃下保持恒溫1小時(shí)，然后在80℃下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)；
E、檢測(cè)：
使用紫外線照射裝置從滅菌試管底部向上進(jìn)行照射，波長240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn)行觀查；如果與陽性對(duì)照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對(duì)照一樣沒有發(fā)出熒光，而判定為陰性。
實(shí)施例6
本發(fā)明一種黃瓜綠斑駁花葉病LAMP檢測(cè)方法，包括以下步驟：
A、提取樣品RNA；
a1、取0.1g的CGMMV和CMV感病組織加入1mL抽提緩沖液進(jìn)行研磨；
a2、清洗納米磁珠：取出納米磁珠到PCR管中，用ddH2O反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH2O；
a3、結(jié)合：加入100μL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；
a4、清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
a5、裂解：加入50μL ddH2O到PCR管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；
a6、取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為CGMMV和CMV的RNA；
B、建立LAMP反應(yīng)體系：
取-20℃下保存的試劑盒中國各種試劑在室溫下解凍，解凍后立即置于冰上保存；
按檢測(cè)所需的反應(yīng)量試劑盒中分別取各種試劑，放入滅菌試管中，在冰上配制預(yù)混液；輕彈擊滅菌試管使其混勻，瞬時(shí)離心數(shù)秒使溶液集中在滅菌試管底部；20μL LAMP反應(yīng)體包括：
其中所述引物包括1.6μl正向外引物F3，1.6μl反向外引物B3，0.2μl正向內(nèi)引物FIP、0.2μl反向內(nèi)引物BIP。
所述的LAMP反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
所述熒光染料為鈣黃綠素；所述酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
所述引物序列：
正向外引物F3：5’TTTCCGCGAGTCCCTGTC3’；
反向外引物B3：5’AGTACGCTTTACGGCGTTAA3’；
正向內(nèi)引物FIP：
5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG-TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)1c和F2：
F1c：5’ACAGGACCGTTGAGGAAAGCG3’；
F2：5’TGCGTTACCCTCGTCTGTC3’；
反向內(nèi)引物BIP：
5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG-CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
其中所述反向內(nèi)引物BIP包括含B1c和B2：
其中B1c：5’CGTTTCGCTTCTCAGCTCCACG3’；
B2:5’CGACTCAGCAGTCGTAGGA3’；
C、加樣：
在三個(gè)裝有20μL LAMP反應(yīng)體的滅菌試管中分別加入待檢測(cè)的待檢測(cè)樣品RNA、陰性對(duì)照反應(yīng)樣品、陽性對(duì)照反應(yīng)樣品各5μL，使各自的總量達(dá)到25μL，蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時(shí)離心使反應(yīng)溶液集中在滅菌試管底部；其中陰性對(duì)照反應(yīng)使用去離子水作為樣品，陽性對(duì)照反應(yīng)使用帶有CGMM VRNA的陽性對(duì)照，
D、擴(kuò)增：
將步驟C中的滅菌試管放置在恒溫器中，在63℃下保持恒溫1小時(shí)，然后在80℃下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)；
E、檢測(cè)：
使用紫外線照射裝置從滅菌試管底部向上進(jìn)行照射，波長240－260nm或350-370nm。佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn)行觀查；如果與陽性對(duì)照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對(duì)照一樣沒有發(fā)出熒光，而判定為陰性。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征以及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。