專利名稱：大豆總黃酮及其制備方法和藥物新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于大豆總黃酮制備方法及其藥物新用途的發(fā)明，具體講是從大豆坯中提取總黃酮，并將大豆總黃酮制備成治療高脂血癥的保健食品和藥物。
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，高脂血癥(hyperlipoproteinemia,HLP)是一種脂代謝疾病，是引發(fā)心腦血管疾病及脂肪肝的重要危險因素之一，只有采用科學(xué)、合理的策略，有效地控制血脂，才能預(yù)防相關(guān)疾病的發(fā)生。天然藥物治療高脂血癥具有應(yīng)用廣泛，療效確切，毒副作用小的優(yōu)勢，因而受到患者好評和臨床醫(yī)學(xué)專家的重視。
古今中外的醫(yī)學(xué)書籍常將大豆列為能使人類長壽健康的首要食品。明代李時珍認為“食服大豆令人長肌膚，益顏色、填骨髓，加氣力，補虛能食?！?；能“寬中益氣、和脾胃，消脹滿，下大腸濁氣”。
我國大豆年產(chǎn)量1380萬噸左右，占世界第三位，豆類及豆制品含有多種防癌、抗癌、預(yù)防和治療心血管疾病物質(zhì)，其中包括大豆黃酮、大豆皂苷、凝集素、蛋白酶抑制劑、纖維素、鈣、硒、植酸、葉酸等，利用豐富的大豆資源生產(chǎn)保健食品及藥物對提高我國人民身體健康素質(zhì)有其現(xiàn)實意義和巨大的經(jīng)濟效益。
本發(fā)明目的是提供大豆總黃酮提取方法及其藥物新用途，該新用途是大豆總黃酮在制備防治高脂血癥藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明運用現(xiàn)代科學(xué)方法，提取大豆總黃酮，并研究了其抗血脂升高的作用，發(fā)現(xiàn)大豆總黃酮能有效的抑制血脂的增高，減少肝內(nèi)的甘油三脂堆積，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂，降低血清和肝脂質(zhì)過氧化物的生成。其藥理作用與進口藥物諾衡相當(dāng)，但價格低廉，為防治高脂血癥提供了新的用藥依據(jù)，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的大豆總黃酮是從大豆坯中提取獲得的，該方法是以大豆坯為原料，將所有黃酮共軛物轉(zhuǎn)化為黃酮甙，并從所說的大豆坯原料中提取富含大豆黃酮的物質(zhì)。
本發(fā)明所述的從大豆坯中回收大豆黃酮的方法包括用乙醇從大豆坯中提取總黃酮，這里的總黃酮包括金雀黃素共軛物、金雀黃素甙、金雀黃素甙元、大豆甙共軛物、大豆甙、大豆甙元等化合物；將黃酮共軛物轉(zhuǎn)化為黃酮甙；然后用一種溶劑回收大豆黃酮，并制成大豆黃酮含量較高的保健品或藥品。
具體方法如下
用40-90％乙醇提取大豆坯兩次，合并兩次的提取液后，回收酒精。該法所得的提取液，可提取大豆黃酮總量的70-95％。
然后用NaOH調(diào)節(jié)上述所得的提取液，使pH為7-11，維持提取液在20-80℃ 1-12小時，該法可將95％的黃酮共軛物轉(zhuǎn)化為黃酮甙。
向上述所得的提取液中加入適量體積正丁醇，第一次萃取1-12小時；收集丁醇部分，再加入適量體積正丁醇，第二次萃取1-12小時；收集丁醇部分，合并二次丁醇萃取液，回收丁醇后，得干燥的棕黃色固體物，即為大豆總黃酮。
本發(fā)明的大豆總黃酮作為藥物活性成分，可以按照常規(guī)的制備方法，制備成適合于臨床使用的任何劑型藥物及其任何保健品，包括片劑、膠囊劑、顆粒劑、口服液、丸劑、膏劑等。
實驗例 大豆總黃酮對實驗性大鼠高脂血癥的治療作用一．實驗材料1動物Wister雄性大鼠，6-8周，體重150-180g/只，共60只。由中醫(yī)研究院動物室提供。2藥物1)大豆提取物每毫升含總黃酮5mg；2)陽性對照藥諾衡，美國派德藥廠生產(chǎn)，900mg/片；3)膽酸鈉海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠生產(chǎn)；4)丙基硫氧嘧啶5)試劑及藥盒(1)甘油三酯(TG)試劑盒，由北京化工廠臨床試劑分廠生產(chǎn)，編號990319；(2)總膽固醇測定試劑盒(TC)，由北京化工廠臨床試劑分廠生產(chǎn)，編號990408；(3)血清高密度脂蛋白試劑盒，北京化工廠臨床試劑分廠生產(chǎn)，編號990522。二．實驗方法1、制備高脂飼料1％膽固醇，10％豬油，0.2％甲基硫氧嘧啶，0.5％膽酸，5％蔗糖，83.3％基礎(chǔ)飼料。各物混勻，加水?dāng)嚢?，弄平切塊，放入烘干箱中烘干，溫度100℃左右。2、動物分組，喂養(yǎng)與給藥取大鼠60只，隨機分為正常組，模型組，陽性藥諾恒組(各10只)以及總黃酮組(30只)正常組每日給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組每日給予高脂飼(20g/只)，待全部吃完后再補給足量正常基礎(chǔ)飼料。陽性對照組每日每只給諾衡16.76mg，治療組分大，中，小三個劑量組每日每只分別給總黃酮2ml/100g體重，1ml/100g體重和0.5ml/100g體重，以上均灌胃給藥，每日一次。正常組，模型組均給予生理鹽水，每日每只2ml/100g體重。所有動物自由飲水，共飼養(yǎng)15或30日。3、標本采集所有大鼠于取材前一天停高脂飼料，并禁食12小時。斷頭取血及肝臟，制備血清及肝勻漿，儲存于-20℃?zhèn)溆谩?、觀察項目及測定方法膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，HDL-C)，采用酶法，用724型可見光分光光度計測定，試劑盒由北京化工廠臨床試劑分廠生產(chǎn)；肝組織中TC、TG的提取采用法，測定用酶法；蛋白含量測定用酚試劑法；MDA用改良八木國夫法測丙二醛(malondiadehycle,MDA)。5、統(tǒng)計學(xué)處理采用t檢驗三．結(jié)果本實驗用高脂飼料飼喂大鼠造成高脂血癥模型，進食高脂飼料后，高脂大鼠與正常組相比體重上升緩慢，但模型組與治療組體重并無明顯差異。高脂飼料飼喂后兩周，模型組TC已有明顯升高，但TG仍然正常，當(dāng)飼喂時間增至四周，血清TG、TC兩項均高于正常，兩組數(shù)據(jù)比較有顯著意義(P＜0.005)(表1)。故實驗時間定為四周。動物飼喂四周后，大豆總黃酮大、中劑量組大鼠血清TG.TC較模型組明顯降低，差別有顯著意義(P＜0.05)；陽性對照藥(諾衡)組大鼠血清TC也較模型組明顯降低，差別有顯著意義(P＜0.05)，但對TG作用不明顯。大豆總黃酮與諾衡組比較，中藥大、中劑量降低TG作用強于陽性對照藥，降低TC差別無意義(P＞0.05)。為進一步觀察肝組織中甘油三酯堆集，本實驗還測定了肝組織中的TG。結(jié)果顯示，大豆總黃酮中、小劑量組能明顯降低其水平，與模型組比較有顯著意義(P＜0.05)(表2)。
大豆總黃酮大中劑量組能明顯升高血清高密度脂蛋白，與模型組數(shù)據(jù)比較有顯著意義(P＜0.05)，諾恒組及大豆總黃酮小劑量組升高高密度脂蛋白，但無統(tǒng)計學(xué)意義。模型組血清低密度脂蛋白較正常組有顯著增高，兩組數(shù)據(jù)比較有顯著意義(P＜0.001)，諾恒組及大豆總黃酮大、中劑量組降低低密度脂蛋白有極顯著意義(P＜0.001)(表3)。血清MDA測定數(shù)據(jù)顯示，諾恒組、大劑量組、中劑量組均能明顯降低MDA水平，與模型組比較均有顯著意義(P＜0.005)；肝組織MDA測定數(shù)據(jù)顯示，諾恒組、大劑量組均能明顯降低MDA水平，與模型組比較均有顯著意義(P＜0.05)(表4)。
表1大豆總黃酮對大鼠血清甘油三脂及膽固醇的影響(X±SE) *與正常組比較P＜0.05；#與模型組比較p＜0.05.
表2大豆總黃酮對大鼠血清脂蛋白的影響(X±SE) *與正常組比較P＜0.05；#與模型組比較p＜0.05.
表3大豆總黃酮對大鼠肝組織甘油三脂及膽固醇的影響(X±SE) *與正常組比較P＜0.05；#與模型組比較p＜0.05.
表4大豆總黃酮對大鼠血清和肝組織MDA的影響(X+SE) *與正常組比較P＜0.05；#與模型組比較p＜0.05.四．討論本研究結(jié)果顯示大豆提取物(總黃酮)有明顯的對抗實驗性高脂血癥、脂肪在肝臟中蓄積的作用。
復(fù)制動物高脂血癥模型是研究動脈粥樣硬化的疾病的重要方法。大鼠雖然對高脂飲食較耐受，但價廉，來源廣，取血方便，血量較小鼠多，有易飼喂，易灌胃，抵抗力強，食性與人相近。加入膽酸鹽和甲基硫氧嘧啶后，能形成滿意效果。因此用大鼠制造高血脂模型仍受到人們的重視，近來有文獻報道，如果高脂飼料加上VitD3，四周后，除血脂和膽固醇高于正常外，可見到大鼠主動脈內(nèi)膜增厚，中膜平滑肌細胞增生，有些部位中層有明顯鈣化斑，初步造成動脈粥樣硬化模型。
本實驗采用高脂飼料飼喂大鼠2周后，血膽固醇明顯升高，但血甘油三酯升高不明顯。飼喂大鼠高脂飼料4周后，與正常大鼠相比，TC升高近16倍，TG升高約2倍，因此實驗時間定為4周。
本實驗表明，大豆總黃酮對高脂血癥大鼠有明顯的調(diào)節(jié)改善作用，可顯著降低大鼠血清TC、TG，抑制率分別為29.03±9.1％-40.34±8.6％。同時顯著降低大鼠血清LDL-C，升高HDL-C水平，降低肝組織中TG水平，以達到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂的作用。傳統(tǒng)上認為HDL是冠心病的保護因素，具有抗動脈粥樣硬化作用。單獨升高HDL水平可以降低冠心病發(fā)生率。HDL具有調(diào)節(jié)體內(nèi)組織膽固醇庫的作用，它能將周圍組織和動脈壁上的膽固醇吸收下來，并把它運輸?shù)礁闻K中代謝，從膽汁排出。因此HDL可防止脂質(zhì)在動脈壁上沉積，防止脂肪在肝內(nèi)堆積，具有抗動脈硬化和抗脂肪肝的作用。
生物膜中的不飽和脂肪酸(FFA)能與氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物(如MDA等)以及新的氧自由基，引起細胞損傷及代謝障礙。肝臟是脂質(zhì)及脂蛋白代謝的主要器官，肝細胞受損，脂質(zhì)及脂蛋白代謝紊亂可引起血脂升高。肝組織MDA含量反映了肝組織脂質(zhì)過氧化程度，間接反映了肝細胞損傷及代謝障礙的程度。而血MDA含量反映了全身組織脂質(zhì)過氧化程度，間接對應(yīng)整體脂質(zhì)代謝障礙的程度。本實驗表明，模型組大鼠肝組織及血中MDA含量上升，提示高脂血癥模型確實存在脂質(zhì)過氧化的發(fā)病機制?？傸S酮組大鼠MDA含量下降提示總黃酮的抗氧化作用，拮抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而保護了肝細胞的正常代謝功能。
本實驗的陽性對照藥諾衡為安妥明衍生物，是臨床上常用的藥物。本實驗表明，大豆總黃酮確有良好的降血脂作用，其降低TC、TG.、MDA，升高HDL和降低LDL作用與均諾衡相當(dāng)。但諾衡有明顯的消化道反應(yīng)等副作用和價值昂貴。
實施例1用4-15倍量體積的40-90％乙醇提取大豆坯2-4小時，再用4-15倍體積40-90％乙醇提取大豆坯2-4小時。合并兩次的提取液后，回收酒精。該法可提取大豆黃酮總量的70-95％。
實施例2將實施例1所得提取液，用NaOH調(diào)節(jié)使pH為7-11，維持提取液在20-80℃ 1-12小時，該法可將95％的黃酮共軛物轉(zhuǎn)化為黃酮甙。
實施例3將實施例2所得提取液，加入1-5倍量體積的正丁醇，第一次萃取1-12小時；收集丁醇部分，再加1-5倍量體積的正丁醇，第二次萃取1-12小時；收集丁醇部分，合并二次丁醇萃取液，回收丁醇后，得干燥的棕黃色固體物，即為大豆總黃酮。
實施例4取大豆總黃酮1000克，加入藥用淀粉500克，混合均勻，乙醇造粒，制粒，壓片，制得片劑。
實施例5取大豆總黃酮1000克，加入藥用淀粉500克，混合均勻，裝膠囊，即得。
權(quán)利要求
1.一種大豆黃酮提取物，其特征在于該總黃酮是下述方提取獲得用40-90％乙醇提取大豆坯兩次，合并兩次的提取液后，回收酒精即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆總黃酮，其特征在于所述的提取方法中進一步用NaOH調(diào)節(jié)上述所得的提取液，使PH為7-11，維持提取液在20-80℃ 1-12小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大豆總黃酮，其特征在于所述的提取方法中進一步向上述所得的提取液中加入1-5倍量正丁醇，第一次萃取1-12小時；收集丁醇部分，再加入1-5倍量正丁醇，第二次萃取1-12小時；收集丁醇部分，合并二次丁醇萃取液，回收丁醇后，得干燥的棕黃色固體物。
4.大豆總黃酮的提取方法，其特征在于該方法為用40-90％乙醇提取大豆坯兩次，合并兩次的提取液后，回收酒精即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的提取方法，其特征在于所述的提取方法中進一步用NaOH調(diào)節(jié)上述所得的提取液，使PH為7-11，維持提取液在20-80℃ 1-12小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的提取方法，其特征在于所述的提取方法中進一步向上述所得的提取液中加入1-5倍量正丁醇，第一次萃取1-12小時；收集丁醇部分，再加入1-5倍量正丁醇，第二次萃取1-12小時；收集丁醇部分，合并二次丁醇萃取液，回收丁醇后，得干燥的棕黃色固體物。
7.大豆總黃酮在制備治療高脂血癥的藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物用途，其特征在于所說的應(yīng)用是大豆總黃酮在制備降低血中、肝內(nèi)甘油三脂和膽固醇的藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物用途，其特征在于所說的應(yīng)用是大豆總黃酮在制備調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂的藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物用途，其特征在于所說的應(yīng)用是大豆總黃酮在制備降低脂質(zhì)過氧化物的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于大豆總黃酮及其提取工藝和藥物新用途的發(fā)明,本發(fā)明公開了大豆總黃酮的提取工藝,還公開了大豆總黃酮在制備治療高脂血證的藥物中的應(yīng)用,大豆總黃酮在制備降低肝內(nèi)甘油三脂的藥物中的應(yīng)用,大豆總黃酮在制備調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂的藥物中的應(yīng)用,以及大豆總黃酮在制備降低脂質(zhì)過氧化物的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/352GK1288006SQ9911934
公開日2001年3月21日 申請日期1999年9月10日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月10日
發(fā)明者王繼峰 申請人:王繼峰