異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌Hela細胞增殖上的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種具有式(Ⅰ)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌Hela細胞增殖上的應(yīng)用；本申請的異黃酮衍生物是一種異黃酮的羧酸鹽衍生物，其對人宮頸癌Hela細胞增殖具有較好的抑制能力，可以作為具有抗宮頸癌細胞增殖的黃酮類新藥的基礎(chǔ)。
【專利說明】
異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌He I a細胞増殖上的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及異黃酮衍生物，尤其涉及異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌Hela細胞增殖 上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 異黃酮是植物苯丙氨酸代謝過程中，由肉桂酰輔酶A側(cè)鏈延長后環(huán)化，形成以苯色 酮環(huán)為基礎(chǔ)的酚類化合物，其3-苯基衍生物即為異黃酮。異黃酮類衍生物屬于黃酮類化合 物，是眾多中草藥如黃芩、銀杏以及沙棘等的活性成分。
[0003] 異黃酮類化合物因其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而對哺乳動物細胞具有許多重要的生理、生 化作用。一方面，異黃酮類化合物具有較高的化學(xué)反應(yīng)性，實驗已經(jīng)證實：它們能清除生物 體內(nèi)過多的自由基，具有抗氧化作用；另一方面，異黃酮類化合物又具有很多重要的藥理作 用，對人類的許多疾病具有治療作用。研究異黃酮類化合物對人類的抗腫瘤和心血管疾病 具有重要意義。因此，異黃酮類化合物引起了國內(nèi)外藥學(xué)家們的廣泛重視，具有十分誘人的 應(yīng)用前景。
[0004] 近年來的研究表明，大豆異黃酮及其衍生物具有一定的抗癌活性，異黃酮衍生物 的種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，結(jié)構(gòu)不同的異黃酮衍生物對各類腫瘤細胞的生長抑制作用不 同，這表明異黃酮衍生物的抗腫瘤活性，有一定的專一性，不同的衍生物，針對不同種類的 癌細胞，能夠有效抑制它們的生長和擴散，但對正常細胞生長并無明顯的負面影響。但就目 前來說，對于異黃酮衍生物類抗癌藥物的研究還有待于進一步加強。本申請?zhí)峁┝艘环N異 黃酮衍生物在抑制Hela癌細胞增殖上的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌Hela細胞增殖上的應(yīng) 用。
[0006] 有鑒于此，本申請?zhí)峁┝艘环N具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌 He Ia細胞僧瑭卜的心田.
[0007]
[0008]其中，所述M為堿金屬或堿土金屬。
[0009] 優(yōu)選的，所述M為Na、Mg、K或Ca。
[0010] 優(yōu)選的，所述M為K。
[0011] 本申請還提供了一種具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物，
[0012]
[0013]其中，所述M為堿金屬或堿土金屬。
[0014]優(yōu)選的，所述具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物的制備方法包括以下步驟：
[0015] 將具有式（II)結(jié)構(gòu)的大豆甙元與溴乙酸乙酯在無水碳酸鉀的作用下反應(yīng)，得到具 有式(I II)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物；
[0016] 將所述具有式(III)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物與堿金屬或堿土金屬的氫氧化物在溶劑 中反應(yīng)，得到具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物；
[0017]
[0018]
[0019] 本申請還提供了一種具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在制備抑制人宮頸癌Hela細 胞增殖藥物上的應(yīng)用，
[0020]
[0021 ]其中，所述M為堿金屬或堿土金屬。
[0022] 本申請還提供了一種具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在制備預(yù)防和/或治療人宮 頸癌藥物和/或保健品上的應(yīng)用，
[0023]
[0024]其中，所述M為堿金屬或堿土金屬。
[0025]本申請還提供了一種制劑，包括具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物與藥學(xué)上可接受 的輔料，
[0026]
[0027] 其中，所述M為堿金屬或堿土金屬。
[0028] 優(yōu)選的，所述制劑的劑型為顆粒劑、片劑、膠囊劑或丸劑。
[0029] 本申請?zhí)峁┝艘环N具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌Hela細胞增殖 上的應(yīng)用。本申請?zhí)峁┑漠慄S酮類衍生物對人宮頸癌Hela細胞增殖具有良好的抑制作用。 實驗結(jié)果表明，本申請?zhí)峁┑漠慄S酮衍生物，僅對人宮頸癌Hela細胞具有增殖抑制作用，而 對人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-I，在實驗濃度范圍內(nèi)，沒有明顯作用。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明異黃酮化合物在不同濃度下對CCC-HPF-I和Hela細胞的抑制率的曲 線圖。
[0031] 圖2為本發(fā)明異黃酮化合物在不同濃度和不同時間段對Hela細胞體外存活率的作 用關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0032] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明優(yōu)選實施方案進行描述，但是 應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點，而不是對本發(fā)明權(quán)利要求的 限制。
[0033] 本申請?zhí)峁┝艘环N具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物，
[0034]
[0035]其中，所述M為堿金屬或堿土金屬，優(yōu)選為Na、Mg、K或Ca，更優(yōu)選為K。
[0036] 本發(fā)明提供的具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物當(dāng)M為K時，可以命名為4S7-二甲氧 基羧酸鉀異黃酮。
[0037] 按照本發(fā)明，所述具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物的制備方法包括以下步驟：
[0038] 將具有式（II)結(jié)構(gòu)的大豆甙元與溴乙酸乙酯在無水碳酸鉀的作用下反應(yīng)，得到具 有式(I II)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物；
[0039] 將所述具有式(III)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物與堿金屬或堿土金屬的氫氧化物在溶劑 中反應(yīng)，得到具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物；
[0040]
[0041]
[0042] 按照本發(fā)明，在制備具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物即4S7-二甲氧基羧酸鉀異黃 酮的過程中，首先將具有式（II)結(jié)構(gòu)的大豆甙元與溴乙酸乙酯在無水碳酸鉀質(zhì)子吸收劑的 作用下，在丙酮中加熱回流，反應(yīng)后得到具有式（III)結(jié)構(gòu)的4'，7_二氧乙酸乙酯異黃酮。為 了得到純凈的4S7-二氧乙酸乙酯異黃酮，本申請在反應(yīng)之后優(yōu)選進行了提純，所述提純?yōu)?本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)手段，此處不再進行特別的限制。
[0043]本申請然后以異黃酮的酯類衍生物4S7-二氧乙酸乙酯異黃酮與堿金屬或堿土金 屬的氫氧化物為原料，在乙醇溶劑中反應(yīng)，得到具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物。其中，所述 堿金屬與堿土金屬均同上所述，在此不再贅述。在上述過程中，反應(yīng)后優(yōu)選對得到的反應(yīng)物 進行提純，以保證異黃酮衍生物的純度。所述提純的過程為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，此處不 進行特別的限制。當(dāng)M為K時，V，7_二氧乙酸乙酯異黃酮與氫氧化鉀為原料，在乙醇溶劑中 的反應(yīng)按照如下所述反應(yīng)式進行：
[0044]
[0045] 本申請還提供了所述具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在抑制人宮頸癌Hela細胞增 殖上的應(yīng)用。
[0046] 按照本發(fā)明，將具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物用于抑制人宮頸癌Hela細胞增殖 的實驗過程中，所述人宮頸癌Hela細胞的獲得按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進行，即將 人宮頸癌Hela細胞依次經(jīng)過復(fù)蘇、傳代與接種。為了考察本申請的異黃酮衍生物的作用，則 將本申請?zhí)峁┑木哂惺剑↖)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在不同濃度下考察其對細胞系的作用。為 了確定本申請?zhí)峁┑?'，7_二甲氧基羧酸鉀異黃酮是否只對人宮頸癌Hela細胞具有抑制效 果，本申請還將CCC-HPF-I以同樣的條件進行接種，并在不同濃度下進行檢測。試驗結(jié)果表 明，本申請?zhí)峁┑膄，7_二甲氧基羧酸鉀異黃酮只對人宮頸癌Hela細胞增殖具有抑制作用， 且對濃度具有一定的依賴性。本申請下所述異黃酮衍生物的濃度優(yōu)選為2X l(T7m〇l/L~5.0 X 10-4moI/L，優(yōu)選為0 · 05 X 10-6mo I/L~1 · 0 X 10-4moI/L，更優(yōu)選為0 · 5 X 10-6mo I/L~1 · 0 X 10一4mol/L，示例的，所述異黃酮衍生物的濃度優(yōu)選為0.5 X 10_6mol/L、I X 10_6mol/L、5 X 10- 6mol/L、10 X 10-6mol/L、15 X 10-6mol/L、30 X 10-6mol/L、50 X 10-6mol/L、70 X 10-6mol/L和 10 Λιο?/L。實驗樣品用細胞實驗專用的DMSO溶解，實驗時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
[0047] 本申請還提供了具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在制備抑制人宮頸癌Hela細胞增 殖藥物上的應(yīng)用。
[0048] 本申請還提供了具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物在制備預(yù)防和/或治療人宮頸癌 藥物和/或保健品上的應(yīng)用。
[0049] 本申請還提供了一種制劑，其包括具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酮衍生物與藥學(xué)上可接 受的輔料。本申請所述制劑中的輔料為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的輔料，此處不再進行贅述。
[0050] 按照本發(fā)明，所述制劑的劑型為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的劑型，此處不再進行詳細 說明，作為優(yōu)選方案，本申請所述制劑的劑型優(yōu)選為顆粒劑、片劑、膠囊劑或丸劑。
[0051] 本申請?zhí)峁┝艘环N異黃酮衍生物及其應(yīng)用，所述異黃酮衍生物僅對人宮頸癌Hela 細胞具有增殖抑制作用，而對人胚肺成纖維細胞CCC-HPF-I，在實驗濃度范圍內(nèi)，幾乎沒有 作用；換言之，異黃酮衍生物，對人宮頸癌Hela細胞具有選擇性增殖抑制作用，這對于靶向 性的抗腫瘤新藥研究有著積極的意義。
[0052]為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的異黃酮類衍生物的應(yīng)用 進行詳細說明，本發(fā)明的保護范圍不受以下實施例的限制。
[0053] 實施例1
[0054] V，7_二氧乙酸乙酯異黃酮的制備
[0055] 在250mL圓底燒瓶中，加入3.3g(13mmol)大豆戒元，8.3g(60mmol)干燥的無水碳酸 鉀，120mL無水丙酮，室溫攪拌45min，用移液管移取5.6mL(34mmol)溴乙酸乙酯逐滴加入反 應(yīng)瓶中，常溫攪拌15min，以使其完全溶解，之后加熱回流。TLC檢測反應(yīng)進程(展開劑為乙酸 乙酯：石油醚=1:1.8)，直至原料大豆甙元基本消失時，停止加熱，繼續(xù)攪拌直至自然冷卻 至室溫;然后減壓旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑丙酮，將得到的固體用蒸餾水洗至中性，除去碳酸鉀，抽濾 得白色固體;將此白色固體加入到45mL 3M的氫氧化鈉溶液中充分攪拌洗滌，抽濾得淡黃色 固體;將此淡黃色固體用水洗至中性，得到白色固體，室溫真空干燥，得到粗產(chǎn)品5.3g，將粗 產(chǎn)品用無水乙醇重結(jié)晶，得到白色片狀晶體4.3g，產(chǎn)率為83.1%。
[0056] V，7_二甲氧基羧酸鉀異黃酮的制備
[0057] 取步驟I中所得的白色固體3g投入到20mL 5mol/L的KOH溶液中，50°C恒溫攪拌3小 時，固體逐漸溶解，溶液變成淺黃色，將此反應(yīng)物緩慢傾倒入300mL冰水中，攪拌，過濾，然后 在濾液中加入固體NaCl，劇烈攪拌，直到加入的NaCl不再溶解，靜置3小時，生成白色絮狀沉 淀，過濾，用飽和NaCl溶液洗滌。用5 %NaCl溶液重結(jié)晶，得到2.45g目標(biāo)產(chǎn)物，產(chǎn)率約為 78%〇M.p.>300〇C ；IR(KBr,u,cm_1) :2956(CH2),1765(0C = 0) ,1615(C = 0) ,1183(C-0-C)； 1H-NMR(400MHz,D20,5) ：4.69(s,2H) ；4.74(s,2H) ；6.39(d,J = 2.2,1H) ；6.46(d,J = 2.2, lH)；7.04(d ,J = 8.7,2H)；7.46(d ,J = 8.7,2H)；7.86(s,lH)；9.78(s,lH)〇
[0058] 實施例2
[0059] 來自實施例1制備的f，7-二甲氧基羧酸鉀異黃酮對人胚肺成纖維細胞(CCC-HPF-1)和人宮頸癌Hela細胞的增殖的影響實驗。
[0060] (1)細胞復(fù)蘇
[0061 ]實驗操作前，將水浴鍋調(diào)至37°C，從液氮罐中取出凍存好的細胞系（CCC-HPF-1與 Hela)放入水浴鍋l-2min，融化后移至超凈工作臺，采用酒精棉球擦拭凍存管口，采用移液 槍將細胞移至離心管，離心(4°(：、1000印111、51^11)，棄上清液，加11^?83將細胞吹散，離心(4 °C、1000rpm、5min)，棄上清液，加ImL完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素/ 鏈霉素)將細胞吹散移至培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中加2~5mL完全培養(yǎng)基(根據(jù)培養(yǎng)皿大小決定 體積），做好標(biāo)記放置37 °C含5 %二氧化碳的培養(yǎng)箱(后簡稱培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)。
[0062] (2)細胞傳代
[0063]當(dāng)培養(yǎng)皿中細胞達到80%~90%時就要進行細胞傳代，否則細胞生長會因接觸抑 制而停止。具體為:將長滿細胞的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)后， 移至超凈工作臺，棄培養(yǎng)基，向其中加2mL 0.05 %胰蛋白酶(后簡稱胰酶），在37°C培養(yǎng)箱中 消化2min，棄胰酶后加入2mL完全培養(yǎng)基將消化后的細胞吹散分散成單個細胞，將分散好的 細胞分裝兩個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿再加入2~5mL完全培養(yǎng)基，做好標(biāo)記放置在37 °C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)。
[0064] (3)細胞接種
[0065]細胞傳至第3代或第4代時細胞狀態(tài)較好，可用于接種。當(dāng)培養(yǎng)皿中細胞達到80% ~90% (處于對數(shù)期增長)時，用2mL 0.05%胰酶在37°C培養(yǎng)箱中消化2min，棄胰酶后加2mL 完全培養(yǎng)基將消化后的細胞吹散分散成單個細胞后再加2mL完全培養(yǎng)基成細胞懸液，然后 進行細胞計數(shù)，步驟如下：
[0066]酒精棉擦拭計數(shù)板，取細胞懸液少許(約25uL)滴在細胞計數(shù)板中央，將蓋玻片從 細胞計數(shù)板的邊緣緩緩蓋上，避免出現(xiàn)氣泡，在倒置顯微鏡下找到計數(shù)區(qū)域進行計數(shù)并計 算細胞濃度(公式如下）：
[0067] 細胞濃度(個/mL)=計數(shù)區(qū)細胞個數(shù)/4*104
[0068] 根據(jù)細胞計數(shù)得到細胞濃度將細胞進行稀釋，得到細胞濃度為IO4個/mL的細胞懸 液。
[0069] 細胞懸液制備好后，輕輕混勻。注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的 過程中要反復(fù)多次混勻，本實驗每加6個孔(就混勻一次，以確保接種的細胞密度在各孔之 間完全相同），向96孔板每孔加入100uL(邊緣孔用無菌PBS填充），對照組加相同量的細胞懸 浮液，空白組不加。將接種好細胞的96孔板放置37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0070] (4)加藥
[0071] 當(dāng)細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的異黃酮衍生物（0.5 X UT 6mol/L、I X 10-6mol/L、5 X 10-6mol/L、10 X 10-6mol/L、15 X 10-6mol/L、30 X 10-6mol/L、50 X 10-6mol/L、100 X 10-6mol/L，用無血清培養(yǎng)基配制），每孔加IOOuL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。 [0072]將加好樣品的96孔板放置在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，倒置顯微鏡下觀察樣品的 作用效果。
[0073] (5)細胞染色
[0074] 取出96孔板，棄培養(yǎng)基，每孔加IOOuL PBS洗滌，棄PBS后每孔加入IOuL MTT溶液 (5mg/mL，即0.5 % MTT)，再向每孔加90uL無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0075] (6)終止培養(yǎng)，溶解結(jié)晶
[0076] MTT加入培養(yǎng)4h后，將上層清液去掉。每孔加入IOOuL DMSO(變?yōu)樽仙糜?7°C 培養(yǎng)箱中20min，然后在酶標(biāo)儀上檢測490nm處的OD值。
[0077] (7)細胞抑制率的計算按照下述公式進行：
[0078] 根據(jù)OD值按照以下公式，計算細胞抑制率S=(對照組(OD)-實驗組(0D))/(對照組 (OD)-空白組(OD)) X 100%。如表1和表2所示，表1與表2分別為異黃酮衍生物對Hela細胞與 CCC-HPF-I細胞的抑制率與濃度關(guān)系的數(shù)據(jù)表。
[0079]表1異黃酮衍生物對Hela細胞抑制率與濃度關(guān)系數(shù)據(jù)表
[0083] 將上述表1與表2數(shù)據(jù)進行整理，得到如圖1所示的曲線圖，圖1中參曲線為異黃酮 衍生物在不同濃度下對CCC-HPF-I細胞的抑制率曲線，曲線為異黃酮衍生物在不同濃度 下對He I a細胞的抑制率的曲線，由該圖可以看出，所合成的異黃酮化合物對人宮頸癌He I a 細胞有選擇性，且細胞生長抑制率與化合物有濃度依賴性，而在相同條件下，化合物對CCC-HPF-I細胞生長幾乎沒什么影響;得到圖2所示的柱形圖，其為本發(fā)明異黃酮化合物在不同 濃度不同時間段對Hela細胞體外存活率的作用關(guān)系圖。
[0084] 以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對 于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行 若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
[0085] 對所公開的實施例的上述說明，使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。 對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的 一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明 將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一 致的最寬的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物在抑制人宮頸癌化la細胞增殖上的應(yīng)用；其中，所述Μ為堿金屬或堿±金屬。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Μ為化、Mg、K或化。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Μ為K。4. 一種具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物，其中，所述Μ為堿金屬或堿±金屬。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的異黃酬衍生物，其特征在于，所述具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍 生物的制備方法包括W下步驟： 將具有式(II)結(jié)構(gòu)的大豆武元與漠乙酸乙醋在無水碳酸鐘的作用下反應(yīng)，得到具有式 (III)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物； 將所述具有式（III)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物與堿金屬或堿±金屬的氨氧化物在溶劑中反 應(yīng)，得到具有式(I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物；6. -種具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物在制備抑制人宮頸癌化la細胞增殖藥物上的應(yīng) 用，其中，所述Μ為堿金屬或堿±金屬。7. -種具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物在制備預(yù)防和/或治療人宮頸癌藥物和/或保健 品上的應(yīng)盧其中，所述Μ為堿金屬或堿±金屬。8. -種制劑，其特征在于，包括具有式（I)結(jié)構(gòu)的異黃酬衍生物與藥學(xué)上可接受的輔 料，其中，所述Μ為堿金屬或堿±金屬。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其特征在于，所述制劑的劑型為顆粒劑、片劑、膠囊劑或 丸劑。
【文檔編號】A61K31/352GK105963290SQ201610344939
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】延璽, 劉紅
【申請人】北京師范大學(xué), 北京師大科技園科技發(fā)展有限責(zé)任公司