殺蟲基因及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種殺蟲基因及其用途，所述殺蟲基因的核苷酸序列包括：（a）具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；或（b）與（a）的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQ?ID?NO:5；或（c）在嚴(yán)格條件下與（a）或（b）限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。本發(fā)明殺蟲基因特別適合在單子葉植物中表達(dá)，尤其是水稻，不僅顯著提高了PIC1-01殺蟲蛋白的表達(dá)量和穩(wěn)定性，而且還顯著增強(qiáng)了PIC1-01殺蟲蛋白對昆蟲害蟲的毒力，尤其是鱗翅目昆蟲害蟲。
【專利說明】殺蟲基因及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種殺蟲基因及其用途，特別是涉及一種改造的PICl-Ol殺蟲基因及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]植物蟲害是導(dǎo)致農(nóng)作物損失的主要因素，給農(nóng)民造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到當(dāng)?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治植物蟲害，人們通常使用廣譜化學(xué)殺蟲劑和生物殺蟲制劑，但二者在實(shí)際應(yīng)用中都具有局限性:化學(xué)殺蟲劑會帶來環(huán)境污染的問題，并導(dǎo)致抗藥性昆蟲的出現(xiàn)；而生物殺蟲制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加了生產(chǎn)成本。
[0003]為了解決化學(xué)殺蟲劑和生物殺蟲制劑在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲蛋白的抗蟲基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲害。PICl殺蟲蛋白是眾多殺蟲蛋白中的一種，是不溶性伴孢結(jié)晶蛋白。
[0004]PICl蛋白被昆蟲攝入進(jìn)入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲中腸的堿性環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲中腸上皮細(xì)胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲的消化過程，最終導(dǎo)致其死亡。
[0005]水稻是中國主要的糧食作物，每年因植物蟲害造成的糧食損失巨大，例如二化螟、三化螟、東方黏蟲或大螟等。已證明PICl蛋白可以抵擋多種鱗翅目昆蟲害蟲(如二化螟、大螟等)的侵害，且目前鮮有依據(jù)植物的偏好密碼子對PICl殺蟲蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列進(jìn)行改造的研究，尤其是針對單子葉植物(如水稻)以提高其在植物中的表達(dá)水平和效
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲基因及其用途，其是依據(jù)水稻的偏好密碼子而進(jìn)行的優(yōu)化改造，使得PICl-Ol殺蟲蛋白在植物中(尤其為水稻)具有較高的表達(dá)量和毒力。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲基因，其核苷酸序列包括:
[0008]Ca)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或
[0009](b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQ ID NO: 5 ;或
[0010](c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0011]所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0.5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0.1%SDS和I X SSC,0.1%SDS各洗膜I次。
[0012]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述殺蟲基因。
[0013]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒的重組載體。
[0014]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，包括:
[0015]獲得包含所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；
[0016]在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；
[0017]回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
[0018]進(jìn)一步地，所述轉(zhuǎn)基因宿主生物包括植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
[0019]優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0020]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于增加昆蟲靶范圍的方法，包括:將所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲核苷酸一起表達(dá)。
[0021]進(jìn)一步地，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過氧化物酶。
[0022]可選擇地，所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
[0023]在本發(fā)明中，PICl-Ol殺蟲蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個或多個Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過一種的殺蟲毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過遺傳工程操作表`達(dá)PICl-Ol殺蟲蛋白，第二種植物(第2親本)可以通過遺傳工程操作表達(dá)Cry類殺蟲蛋白質(zhì)和/或Vip類殺蟲蛋白質(zhì)。通過第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。
[0024]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。因此可以使用RNAi技術(shù)特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)。
[0025]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，包括:將所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。
[0026]優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0027]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保護(hù)植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，包括:將所述殺蟲基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
[0028]優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
[0029]將所述的殺蟲基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。
[0030]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制昆蟲害蟲的方法，包括:使昆蟲害蟲與抑制量的由所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。
[0031]優(yōu)選地，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。
[0032]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種由所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)控制昆蟲害蟲的用途。[0033]本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。
[0034]本發(fā)明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易認(rèn)識到，可以將本發(fā)明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的調(diào)控序列控制下。 [0035]本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，DNA典型的以雙鏈形式存在。在這種排列中，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。由于DNA在植物中復(fù)制產(chǎn)生了 DNA的其它互補(bǔ)鏈。這樣，本發(fā)明包括對序列表中示例的多核苷酸及其互補(bǔ)鏈的使用。本領(lǐng)域常使用的“編碼鏈”指與反義鏈結(jié)合的鏈。為了在體內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)，典型將DNA的一條鏈轉(zhuǎn)錄為一條mRNA的互補(bǔ)鏈，它作為模板翻譯出蛋白質(zhì)。mRNA實(shí)際上是從DNA的“反義”鏈轉(zhuǎn)錄的?！坝辛x”或“編碼”鏈有一系列密碼子(密碼子是三個核苷酸，一次讀三個可以產(chǎn)生特定氨基酸)，其可作為開放閱讀框(ORF)閱讀來形成目的蛋白質(zhì)或肽。本發(fā)明還包括與示例的DNA有相當(dāng)功能的RNA和PNA (肽核酸)。
[0036]本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明殺蟲基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明殺蟲基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說這兩個核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱其中一個核酸分子是另一個核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個核酸分子的每一個核苷酸都與另一個核酸分子的對應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時，則稱這兩個核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在至少常規(guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類似地，如果兩個核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們在常規(guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱這兩個核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。
[0037]本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45°C條件下用6.0X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用
2.0XSSC洗滌，這些條件對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0父55(:、501:到高度嚴(yán)格條件的約0.2\55(:、501:。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65°C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個保持不變而另一個變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC、0.5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO:1發(fā)生特異性雜交，然后用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS 各洗膜 I 次。
[0038]因此，具有抗蟲活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明序列I雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。
[0039]本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，前述序列的長度可存在變化，但長度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲毒素。
[0040]當(dāng)核酸序列編碼的多肽與參照核酸序列編碼的多肽有相同的氨基酸序列時，該核酸序列與參照核酸序列是本發(fā)明所述的“同類編碼”。[0041]本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子，增強(qiáng)子，前導(dǎo)序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述殺蟲基因的調(diào)節(jié)序列。
[0042]所述啟動子為植物中可表達(dá)的啟動子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動子。植物中可表達(dá)的啟動子可為組成型啟動子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米u(yù)bi啟動子、水稻G0S2基因的啟動子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測定)，如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達(dá)的啟動子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲啃食引起的創(chuàng)傷時，啟動子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(Pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0043]所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱分泌信號序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對受體蛋白質(zhì)來說，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。
[0044]所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。
[0045]所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV)增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強(qiáng)子、夜香樹黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強(qiáng)子。
[0046]對于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子1、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-1內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級泛素”內(nèi)含子。
[0047]所述終止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號序列，包括但不限于，來源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號序列、來源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號序列和來源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號序列。[0048]本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對相連序列來說需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時“有效連接”表示:啟動子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于:提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識別位點(diǎn)、整合酶識別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。
[0049]本發(fā)明中所述的“殺蟲”是指對農(nóng)作物害蟲是有毒的。更具體地，目標(biāo)昆蟲是害蟲，例如，但不限于，大部分鱗翅目害蟲，如玉米螟、三化螟、東方黏蟲、二化螟或大螟等。
[0050]本發(fā)明中，所述殺蟲基因?yàn)镻ICl-Ol基因序列，如序列表中SEQ ID N0:1所示。所述殺蟲基因?yàn)橛糜谥参铮貏e是玉米轉(zhuǎn)化的DNA序列，除了包含由PICl-Ol基因序列編碼的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)、編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。
[0051]本發(fā)明中PICl-Ol基因序列對危害玉米的大多數(shù)鱗翅目害蟲具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含PICl-Ol基因序列，通過表達(dá)抑制量的該蛋白而保護(hù)其免受害蟲的威脅或控制害蟲。抑制量是指致死的或亞致死的劑量。同時，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對化學(xué)或生物殺蟲劑的需要(所述化學(xué)或生物殺蟲劑為針對由PICl-Ol基因序列編碼的蛋白質(zhì)所靶向的昆蟲的殺蟲劑)。
[0052]植物材料中殺蟲晶體蛋白(ICP)的表達(dá)水平可通過本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進(jìn)行檢測，例如通過應(yīng)用特異引物對組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量，或直接特異性檢測產(chǎn)生的殺蟲蛋白質(zhì)的量。
[0053]可以應(yīng)用不同的試驗(yàn)測定植物中ICP的殺蟲效果。本發(fā)明中目標(biāo)昆蟲主要為鱗翅目害蟲，更具體地為大螟或二化螟等。
[0054]此外，包含本發(fā)明殺蟲基因(PIC1-01基因)序列的表達(dá)盒在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達(dá)，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對除草劑茅草枯的抗性基因、對氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。[0055]本發(fā)明提供了一種殺蟲基因及其用途，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0056]1、表達(dá)量高。本發(fā)明殺蟲基因PICl-Ol為依據(jù)水稻的偏好密碼子對殺蟲蛋白質(zhì)PICl-Ol進(jìn)行的優(yōu)化，同時去除了使mRNA不穩(wěn)定的序列、PolyA加尾信號和內(nèi)含子剪切類似位點(diǎn)，且提高了 GC含量，完全符合水稻基因的特性，使得本發(fā)明殺蟲基因特別適合在單子葉植物中表達(dá)，尤其是玉米，其表達(dá)量高且穩(wěn)定性好。
[0057]2、毒力強(qiáng)。本發(fā)明殺蟲基因PICl-Ol為依據(jù)水稻的偏好密碼子對殺蟲蛋白質(zhì)PICl-Ol進(jìn)行的優(yōu)化，同時去除了使mRNA不穩(wěn)定的序列、PolyA加尾信號和內(nèi)含子剪切類似位點(diǎn)，且提高了 GC含量，使得本發(fā)明殺蟲基因不僅特別適合在單子葉植物中表達(dá)，尤其是水稻，而且還顯著增強(qiáng)了 PICl-Ol殺蟲蛋白對昆蟲害蟲的毒力，尤其是鱗翅目昆蟲害蟲。
[0058]3、殺蟲譜廣。本發(fā)明殺蟲蛋白質(zhì)PICl-Ol蛋白不僅對二化螟表現(xiàn)出較高的抗性，而且對大螟也具有較高的活性，因此在植物上應(yīng)用前景廣闊。
[0059]下面通過附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0060]圖1為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的含有PICl-Ol核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；
[0061]圖2為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的含有PICl-Ol核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100074構(gòu)建流程圖；
[0062]圖3為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的轉(zhuǎn)基因水稻植株接種二化螟的抗蟲效果圖；
[0063]圖4為本發(fā)明殺蟲基因及其用途的轉(zhuǎn)基因水稻植株接種大螟的抗蟲效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0064]下面通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明殺蟲基因及其用途的技術(shù)方案。
[0065]第一實(shí)施例、PICl基因的合成
[0066]獲得本發(fā)明殺蟲基因PIC1-01，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示；所述PICl-Ol核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述PICl-Ol基因序列(SEQ ID NO:1)的5’端還連接有NcoI酶切位點(diǎn)，所述PICl-Ol基因序列(SEQ ID NO:1)的3，端還連接有BamHI酶切位點(diǎn)。
[0067]第二實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0068]1、構(gòu)建含有PICl-Ol核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T
[0069]將合成的PICl-Ol核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；PIC1-01為PICl-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ;MCS為多克隆位點(diǎn))。
[0070]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501 )，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA(重組克隆載`體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)和X-gal(5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA(乙二胺四乙酸)，50禮葡萄糖，？!18.0)懸?。患尤?0(^1新配制的溶液11 (0.2M NaOH,1%SDS(十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液III (3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4V、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，棄上清液，沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0071]提取的質(zhì)粒經(jīng)XhoI和BamHI酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述PICl-Ol核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，即PICl-Ol核苷酸序列正確插入。
[0072]2、構(gòu)建含有PICl-Ol核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100074
[0073]用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamHI分別酶切重組克隆載體DBNO1-T和表達(dá)載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的PIC1-01核苷酸序列片段插到表達(dá)載體DBNBC-01的NcoI和BamHI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100074，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動子(SEQ ID NO: 2);PICl-Ol =PICl-Ol核苷酸序列(SEQ ID NO:1) ；Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQIDN0:3) ；PM1:磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID N0:4) ；LB:左邊界)。
[0074]將重組表達(dá)載體DBN100074用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100074)，42 °C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,NaC110g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaC110g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XhoI和BamHI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100074在NcoI和BamHI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即PICl-Ol核苷酸序列。
[0075]3、構(gòu)建含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100074N (正對照)
[0076] 按照本發(fā)明第二實(shí)施例中I所述的構(gòu)建含有PICl-Ol核苷酸序列的重組克隆載體DBN01-T的方法，利用已知序列(SEQ ID NO: 5)構(gòu)建含有已知序列的重組克隆載體DBNOIR-To對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01R-T中插入的已知序列為序列表中SEQ ID N0:5所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。
[0077]按照本發(fā)明第二實(shí)施例中2所述的構(gòu)建含有PICl-Ol核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100074的方法，利用已知序列構(gòu)建含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100074N。對陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100074N中插入的已知序列為序列表中SEQID NO: 5所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。
[0078]4、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0079]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100074和DBN100074N (已知序列)用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌 LBA4404 (Invitrgen, Chicago, USA, CAT:18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為:100 μ L農(nóng)桿菌LBA4404、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體)；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100074和DBN100074N (已知序列)結(jié)構(gòu)完全正確。
[0080]第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入PICl-Ol核苷酸序列的水稻植株的獲得及驗(yàn)證
[0081]1、獲得轉(zhuǎn)入PICl-Ol基因序列的水稻植株
[0082]按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無菌培養(yǎng)的粳稻品種日本晴的愈傷組織與第二實(shí)施例中4所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實(shí)施例中2和3構(gòu)建的重組表達(dá)載體DBN100074和DBN100074N (已知序列)中的T-DNA (包括玉米Ubiquitin基因的啟動子序列、PICl-Ol核苷酸序列、已知序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到水稻染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入PICl-Ol核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株(正對照)；同時以野生型玉米植株作為負(fù)對照。
[0083]對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化，簡要地，把水稻種子接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6鹽、N6維他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 2mg/L、植物凝膠3g/L,PH5.8)上，從水稻成熟胚誘導(dǎo)出愈傷組織(步驟1:愈傷誘導(dǎo)步驟)，之后，優(yōu)選愈傷組織，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸愈傷組織，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)ICl-Ol核苷酸序列和/或已知序列傳遞至愈傷組織上的至少一個細(xì)胞(步驟2:侵染`步驟)。在此步驟中，愈傷組織優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(0D660=0.3，侵染培養(yǎng)基(N6鹽、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)2mg/L、pH5.4))中以啟動侵染。愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時期(3天)(步驟3:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(N6鹽、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) 2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，有一個“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(N6鹽、N6維他命、干酪素300mg/L、鹿糖30g/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 2mg/L、植物凝膠3g/L, pH5.8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟4:恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有抗生素但沒有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的愈傷組織在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟5:選擇步驟)。優(yōu)選地，愈傷組織在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(N6鹽、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖10g/L、甘露糖10g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 2mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物(步驟6:再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(N6分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。[0084]篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述N6分化培養(yǎng)基(N6鹽、N6維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、6-芐氨基腺嘌呤2mg/L、奈乙酸lmg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖15g/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于30°C下培養(yǎng)。
[0085]2、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)入PIC1-01核苷酸序列的水稻植株
[0086]分別取轉(zhuǎn)入PICl-Ol核苷酸序列的水稻植株和轉(zhuǎn)入已知序列的水稻植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA,通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測PICl基因的拷貝數(shù)。同時以野生型水稻植株作為負(fù)對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
[0087]檢測PICl基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0088]步驟11、分別取轉(zhuǎn)入PICl-Ol核苷酸序列的水稻植株、轉(zhuǎn)入已知序列的水稻植株和野生型水稻植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；
[0089]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0090]步驟13、用NanoDrop2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0091]步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；
[0092]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型水稻植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0093]以下引物和探針用來檢測PICl-Ol核苷酸序列:
[0094]引物I (CFl):TCGGCACAGTCTCCAGCTTC 如序列表中 SEQ ID NO:6 所示；
[0095]引物2 (CRl):CCACAGCTCACTGAGAATCCG 如序列表中 SEQ ID N0:7 所示；
[0096]探針I(yè) (CPl):CCTGAAGAAGGTCGGCTCGCTGATC 如序列表中 SEQ IDNO:8 所示；
[0097]以下引物和探針用來檢測已知序列:
[0098]引物3 (CF2):CTCTACGCCAGCGGTTCC 如序列表中 SEQ ID NO:9 所示；
[0099]引物4 (CR2):GGCTGTAGAGGAAGGGCCAG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；
[0100]探針2 (CP2):CCCACAGCAAACCCAGAGCTTCACC 如序列表中 SEQ IDN0:11 所示；
[0101]PCR反應(yīng)體系為:
[0102]
【權(quán)利要求】
1.一種殺蟲基因，其特征在于，其核苷酸序列包括: (a)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或 (b)與(a)的核苷酸序列同類編碼，且不為SEQID NO: 5 ;或 (c)在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2.一種表達(dá)盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求1所述殺蟲基因。
3.一種包含權(quán)利要求1所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒的重組載體。
4.一種產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括: 獲得包含權(quán)利要求1所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 在允許產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 回收所述殺蟲蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞包括植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲或藻類。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述產(chǎn)生殺蟲蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
7.一種用于增加昆蟲靶范圍`的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)在植物中與至少一種不同于權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的殺蟲蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒編碼的殺蟲蛋白質(zhì)的第二種殺蟲核苷酸一起表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲核苷酸可以編碼Cry類殺蟲蛋白質(zhì)、Vip類殺蟲蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α _淀粉酶或過氧化物酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述用于增加昆蟲靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲核苷酸為抑制目標(biāo)昆蟲害蟲中重要基因的dsRNA。
10.一種產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求1所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒或權(quán)利要求3所述重組載體導(dǎo)入植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述產(chǎn)生抗蟲植物的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
12.一種用于保護(hù)植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，包括:將權(quán)利要求I所述殺蟲基因或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒或權(quán)利要求3所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受昆蟲害蟲侵害量的殺蟲蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述用于保護(hù)植物免受由昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
14.一種控制昆蟲害蟲的方法,其特征在于,包括:使昆蟲害蟲與抑制量的由權(quán)利要求1所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白接觸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述控制昆蟲害蟲的方法，其特征在于，所述昆蟲害蟲是鱗翅目昆蟲害蟲。
16.一種由權(quán) 利要求1所述殺蟲基因編碼的昆蟲抑制性蛋白質(zhì)控制昆蟲害蟲的用途。
【文檔編號】C07K14/325GK103725696SQ201310722905
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】龐潔, 丁德榮, 韓超, 岳健婷, 李勝兵 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心