一種林可霉素的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種林可霉素的提取方法，該方法主要包括下列步驟：發(fā)酵液調(diào)酸后經(jīng)陶瓷超濾膜過濾，然后調(diào)堿后再次經(jīng)陶瓷超濾膜過濾，之后進行一次仲辛醇萃取與鹽酸反萃取，將一次反萃取液調(diào)堿后再經(jīng)陶瓷超濾膜過濾，進行二次仲辛醇萃取與鹽酸反萃取，最后將二次反萃取液加丙酮進行蒸發(fā)結(jié)晶。該方法提取林可霉素的收率高，可明顯提高產(chǎn)品色級，減少產(chǎn)品中B組分含量。本發(fā)明通過膜處理工藝提高其他提取工藝的料液質(zhì)量，進而提高整體提取效率，降低萃取工序萃余液中仲辛醇的殘余量，提高產(chǎn)品質(zhì)量，同時降低生產(chǎn)廢水的COD，具有一定的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益。
【專利說明】一種林可霉素的提取方法
[0001]
【技術(shù)領域】
[0002]本發(fā)明涉及一種林可霉素的提取方法，尤其涉及采用膜過濾與萃取相結(jié)合提取林可霉素的方法。
[0003]【背景技術(shù)】
[0004]林可霉素,英文名Lincomycin。作用于敏感菌核糖體的50S亞基，阻止膿鏈的延長，從而抑制細菌細胞的蛋白質(zhì)合成。通用名:林可霉素，中文別名:潔霉素、林肯霉素、潔霉素；化學名:6_ (1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯燒甲酰氨基)-1-硫代-6,8- 二脫氧-D-赤式-a -D-半乳辛吡喃糖苷鹽酸鹽一水合物。分子式:C18H34N2O6S.HCl.H2O,分子量:461.02,本品為白色結(jié)晶性粉末；有微臭或特殊臭；味苦。本品在水或甲醇中易溶，在乙醇中略溶。
[0005]目前林可霉素的生產(chǎn)工藝較傳統(tǒng)，如有生產(chǎn)廠家發(fā)采用板框過濾、混合醇萃取、鹽酸反萃取、蒸發(fā)、結(jié)晶等組合工藝從發(fā)酵液中提取林可霉素。板框過濾精度低、只能將發(fā)酵液中的懸浮物部分去除，且勞動量大。板框過濾后的堿化液中含有部分懸浮物及其他可溶性大分子雜質(zhì)，丁醇或混合醇萃取過程中會形成明顯的乳化層，萃取效率低，萃余液中丁醇或混合醇殘留量大，萃取有機相中雜質(zhì)含量也較多，且有機相中的部分雜質(zhì)會隨著反萃取進入反萃取液中最終殘留在產(chǎn)品中，導致產(chǎn)品雜質(zhì)含量低。由于萃余液中丁醇或仲辛醇殘留量大，造成溶媒浪費，同時增加了萃余液的C0D，增加了廢水處理負荷。專利CN102746348A公布了一種林可霉素的分離方法，主要包括如下步驟:將含林可霉素發(fā)酵液酸化后過濾，然后調(diào)堿后再次過濾取濾液，之后上樣聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂柱吸附，先用與上樣液同PH的堿性水溶液洗脫除雜，再用正丁醇洗脫林可霉素，收集林可霉素正丁醇溶液進行濃縮、酸化后結(jié)晶，然后再用丙酮重結(jié)晶。該方法中林可霉素酸化液及堿化液均采用板框過濾，過濾精度低，過濾清液中含有部分懸浮物及蛋白等大分子雜質(zhì)，影響吸附樹脂吸附林可霉素的效率，同時造成樹脂的使用壽命降低。吸附樹脂的再生酸、堿、水用量大，成本高。劉路等在《膜分離技術(shù)在林可霉素發(fā)酵液分離濃縮中的應用》中介紹了含有有機超濾膜和有機納濾膜的林可霉素分離工藝，主要步驟如下:發(fā)酵液調(diào)酸后經(jīng)板框過濾，后精濾，將精濾液經(jīng)有機超濾膜過濾后的清液再經(jīng)有機納濾膜濃縮，再將納濾濃縮液進行脫水濃縮、萃取、結(jié)晶等工序，該分離工藝較復雜，有機納濾膜濃縮林可霉素的濃縮效率低、通量小且在濃縮過程中也將料液中的雜質(zhì)截留并濃縮，而且有機超濾、納濾膜有不耐酸喊、使用壽命短等缺點。
`[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中林可霉素收率低、純度低以及溶媒消耗大的問題，提供一種溶劑損耗量少、操作簡便，且產(chǎn)品林可霉素純度可達98.5%以上的林可霉素提取方法。技術(shù)方案如下:
一種林可霉素的提取方法，包括如下步驟:
第I步、將滅菌后的林可霉素發(fā)酵液的PH調(diào)節(jié)至3~4，然后將料液通過第一陶瓷超濾膜進行過濾，得到第一陶瓷膜清液；
第2步、將第一陶瓷膜清液的pH調(diào)節(jié)至11~12，然后將料液通過第二陶瓷超濾膜進行過濾，得到第二陶瓷膜清液；
第3步、在第二陶瓷膜清液中加入仲辛醇，進行萃取，有機相為第一萃取液，再用pH值2~3的鹽酸溶液進行反萃取,水相為一次反萃取液；
第4步、調(diào)節(jié)一次反萃取液的pH至11~12，再通過第三陶瓷超濾膜進行過濾，得到第三陶瓷膜清液；
第5步、將第三陶瓷膜清液中加入仲辛醇，進行萃取，有機相為第二萃取液，再用pH值2~3的鹽酸溶液進行反萃取,水相為二次反萃取液；
第6步、在二次反萃取液中加入丙酮，進行蒸發(fā)結(jié)晶后，得到林可霉素粗品。
[0008]第I步中，通過調(diào)酸，可將發(fā)酵液中酸性蛋白析出，再將調(diào)酸后發(fā)酵液經(jīng)超濾膜過濾澄清，去除菌體及蛋白等大分子雜質(zhì)，優(yōu)選是采用草酸對PH進行調(diào)節(jié)。第2步中，通過調(diào)堿，可將料液中的堿性蛋白析出，通過超濾之后，將這些堿性蛋白去除，并同時去除其它的一些大分子雜質(zhì)，優(yōu)選是采用片堿調(diào)節(jié)pH。
[0009]第3步進行萃取的過程中，是可以使第二陶瓷膜清液中的有效成分轉(zhuǎn)移至仲辛醇中，反萃取中，優(yōu)選采用PH2~3的鹽酸溶液進行調(diào)節(jié)，可以使林可霉素返回至水相中，采用仲辛醇作為萃取液可以有效地提`高產(chǎn)品品質(zhì)，降低雜質(zhì)含量。作為優(yōu)選，一次萃取用仲辛醇的量為第二陶瓷膜清液體積的1/5~1/4，反萃取時使用的鹽酸溶液的體積是萃取有機相體積的1/7~1/5。如果仲辛醇用量過多，會導致萃取液的用量過大，而在反萃取中會導致有一部分的萃取液進入至水相中，導致萃取液的浪費；相反地，如果仲辛醇用量過小，則會使林可霉素不能完全地轉(zhuǎn)移至萃取相中，導致收率的下降。一次反萃取液的林可霉素的效價一般能夠達到發(fā)酵液效價的20~25倍。
[0010]在研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，在對一次反萃取液進行調(diào)節(jié)pH至11~12，并進行超濾，得到第三陶瓷膜清液，可以進一步地提高產(chǎn)品的純度。
[0011 ] 進一步地還發(fā)現(xiàn)，在第三陶瓷膜清液中加入2~3倍體積的純水進行稀釋，并保持pH為11~12,有利于提高第5步中的萃取效率,一次反萃取液較為粘稠,一次反萃取液中林可霉素效價為50000~60000，加水之后可以降低粘度、改善溶質(zhì)的濃度，在二次萃取及反萃取后，可以進一步地減小雜質(zhì)含量、提聞廣物純度。
[0012]第5步中進行二次萃取可以進一步地提高產(chǎn)物純度，二次萃取用仲辛醇的量為第三陶瓷膜清液體積的1/5~1/4，反萃取時使用的鹽酸溶液的體積是萃取有機相體積的1/7~1/5。經(jīng)二次萃取、反萃取后得到的二次反萃取液中雜質(zhì)含量進一步降低，產(chǎn)品效價較堿化液提高70~80倍，可達500000~600000。
[0013]經(jīng)過大量試驗摸索發(fā)現(xiàn)，對于第一、第二、第三陶瓷超濾膜的平均孔徑，如果孔徑太大，會導致有較多的雜質(zhì)不能被超濾膜截留，會導致后續(xù)的萃取過程中界面乳化、萃取效率低、產(chǎn)品的雜質(zhì)含量高等問題；如果孔徑太小，會導致過濾濃縮過程難以進行，滲透通量小，較優(yōu)的孔徑范圍是20 nm~50 nm，可以保證萃取過程順利進行，同時也能兼顧產(chǎn)品的收率和純度。超濾過程中的跨膜壓差與整個工藝也是密切相關(guān)的，由于析出的酸性或者堿性蛋白都是可壓大分子雜質(zhì)，壓力過大時，其會透過超濾膜進入至滲透液側(cè)，會影響到萃取過程中的界面乳化情況以及產(chǎn)品的純度，如果壓力過小時，滲透通量過低，使過濾難以進行，最終會導致產(chǎn)品的收率低，而且，在設定跨膜壓差時，也是要結(jié)合平均孔徑進行設定的，壓力的大小與孔徑存在著密切的關(guān)系，經(jīng)過大量試驗摸索，最優(yōu)的跨膜壓差是0.1~0.2MPa ;膜面流速的設定也與孔徑、跨膜壓差密切相關(guān)，流速過大時，在膜表面無法形成良好的濾餅層，就會無法通過濾餅層的形成來輔助進行對于雜質(zhì)的過濾，這樣就會有雜質(zhì)透過膜層進入至滲透側(cè)，影響到萃取過程和產(chǎn)品的純度，雖然有可能提高過濾通量、提高產(chǎn)品得率，但是卻會帶來產(chǎn)品純度的下降，相反，如果流速過小，會導致過濾通量低、產(chǎn)品得率低，經(jīng)過大量試驗綜合考慮，優(yōu)選的膜面流速是2~5m/s。
[0014]第5步中二次反萃取液的效價一般在500000~600000 ;第6步中，在二次反萃取液中加入其5~8倍體積的丙酮進行蒸發(fā)結(jié)晶。通過蒸發(fā)結(jié)晶出的晶體大，雜質(zhì)含量低。
[0015]本發(fā)明所述的B組分是指發(fā)酵法生產(chǎn)的林可霉素中的雜質(zhì)B，具體的結(jié)構(gòu)及檢測方法可以參照《歐洲藥典7.0》。
[0016]有益效果
(I)目前傳統(tǒng)過濾均采用板框過濾，過濾精度低，勞動強度大。采用陶瓷超濾膜過濾，不僅可去除發(fā)酵液中的菌體等不溶物，還可去除其他大分子可溶性雜質(zhì)。通過調(diào)節(jié)pH，可以更好地將料液中的酸性蛋白和 堿性蛋白通過陶瓷膜過濾去除。另外，陶瓷超濾膜具有使用壽命長、易清洗再生、耐高溫、耐腐蝕、強度高的特點。采用陶瓷超濾膜過濾代替酸化液及堿化液的板框過濾，提高過濾精度，降低勞動強度。
[0017](2)陶瓷膜過濾，具有精度高的優(yōu)點，可以有效地去除料液中的大分子雜質(zhì)，使萃取過程不易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，萃取效率高，更好的提高產(chǎn)品的純度。
[0018](3)采用仲辛醇作為萃取劑，具有萃取效率高、殘余量低、產(chǎn)品收率高等優(yōu)點。林可霉素料液的萃取、反萃取過程同時又是產(chǎn)品的除雜、濃縮過程。
[0019](4)各階段料液經(jīng)陶瓷超濾膜過濾后去除了其中的懸浮物及其他大分子雜質(zhì)，尤其是經(jīng)陶瓷超濾膜過濾的堿化液、一次反萃液再進行萃取時，萃取效率明顯提高，萃取過程中無乳化層，有機相中雜質(zhì)含量低。同時，萃取后水相中仲辛醇殘余量明顯降低。
[0020](5)料液經(jīng)膜多次陶瓷超濾膜過濾、兩次萃取及反萃取后所得二次反萃取液基本無顏色，雜質(zhì)含量極低，提高了結(jié)晶效率。
[0021](6)采用該組合提取工藝，可明顯提高產(chǎn)品收率至96%以上，降低產(chǎn)品中B組分含量，提高產(chǎn)品質(zhì)量，在本發(fā)明的一個最優(yōu)實施例中，林可霉素的含量可以達到98.9%以上，B組分的含量低至0.35%，同時也能保持收率在97.5%。與板框過濾、混合醇萃取、鹽酸反萃取、蒸發(fā)、結(jié)晶的傳統(tǒng)工藝流程相比，本方法的萃余液中仲辛醇殘余量減少50%以上，生產(chǎn)廢水COD降低300mg/L以上。
[0022]
【具體實施方式】[0023]實施例1
取林可霉素的發(fā)酵液150kg，加草酸調(diào)節(jié)pH至3，后經(jīng)第一陶瓷超濾膜過濾，陶瓷膜孔徑為0.05 μ m，壓力為0.2MPa，膜面流速2 m/s。取過濾后酸化液用濃堿調(diào)節(jié)pH至11，將堿化液再次經(jīng)過第二陶瓷超濾膜過濾，陶瓷膜孔徑為0.05 μ m，壓力為0.1MPa，膜面流速2m/s，取過濾后堿化液加仲辛醇，用量是第二陶瓷膜清液體積的1/10，室溫攪拌5min靜置分層，分層過程速度較快，界面清晰，無乳化現(xiàn)象出現(xiàn)。一次萃取后廢液再加仲辛醇，用量是第二陶瓷膜清液體積的1/10，室溫攪拌5min靜置分層。合并有機相加鹽酸溶液調(diào)pH為3，鹽酸溶液的用量是有機相的1/5，攪拌5min，靜置分層，得一次反萃取液。將一次反萃取液用濃堿調(diào)節(jié)PH至12后經(jīng)第三陶瓷超濾膜過濾，陶瓷膜孔徑為0.02 μ m，壓力為0.15MPa，膜面流速5 m/s，將過濾清液加純水稀釋兩倍并調(diào)節(jié)pH12。向稀釋后的第三陶瓷膜清液中加入仲辛醇，用量是稀釋后的第三陶瓷膜清液體積的1/5，攪拌5min靜置分層，得有機相，再加入PH為3的鹽酸溶液，鹽酸溶液使用的體積是有機相體積的1/7，攪拌5min，靜置分層得二次反萃取液。將二次反萃液中加入5倍體積的丙酮進行蒸發(fā)結(jié)晶，經(jīng)體積烘干即得林可霉素粗品。取各階段陶瓷超濾膜的過濾清液測懸浮物含量均為0，堿化液、一次反萃取液經(jīng)陶瓷超濾膜過濾后清液萃取過程中無乳化層；取粗品做液相色譜檢測，粗品中林可霉素含量97.9%, B 組分含量 0.43%,收率 95.2%。
[0024]收率的計算方法是:收率=林可霉素粗品的效價X粗品的重量/(林可霉素發(fā)酵液的效價X發(fā)酵液的重量)X 100%
實施例2
關(guān)于萃取劑的選擇，在本實施例中，采用了一些常見的萃取劑應用于提取步驟中，與實施例I的區(qū)別是分別用了如表1所示的萃取劑，萃取方法相同，其得到的最終的產(chǎn)品檢測結(jié)果如表1。
[0025]表1不同—取劑對產(chǎn)ρππ結(jié)果白彳影響
【權(quán)利要求】
1.一種林可霉素的提取方法，其特征在于，包括如下步驟: 第I步、將滅菌后的林可霉素發(fā)酵液的PH調(diào)節(jié)至3~4，然后將料液通過第一陶瓷超濾膜進行過濾，得到第一陶瓷膜清液； 第2步、將第一陶瓷膜清液的pH調(diào)節(jié)至11~12，然后將料液通過第二陶瓷超濾膜進行過濾，得到第二陶瓷膜清液； 第3步、在第二陶瓷膜清液中加入仲辛醇，進行萃取，有機相為第一萃取液，再用pH值2~3的鹽酸溶液進行反萃取,水相為一次反萃取液； 第4步、調(diào)節(jié)一次反萃取液的pH至11~12，再通過第三陶瓷超濾膜進行過濾，得到第三陶瓷膜清液； 第5步、將第三陶瓷膜清液中加入仲辛醇，進行萃取，有機相為第二萃取液，再用pH值2~3的鹽酸溶液進行反萃取,水相為二次反萃取液； 第6步、在二次反萃取液中加入丙酮，進行蒸發(fā)結(jié)晶后，得到林可霉素粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林可霉素的提取方法，其特征在于:所述的第一陶瓷超濾膜、第二陶瓷超濾膜或者第三陶瓷超濾膜的平均孔徑是50 nm，超濾過程的跨膜壓差是0.1~0.2 MPa，超濾過程的膜面流速是2~5m/s。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林可霉素的提取方法，其特征在于:所述的第3步中，仲辛醇的量為第二陶瓷膜清液體積的1/5~1/4，鹽酸溶液的體積是萃取有機相體積的1/7~1/5。`
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林可霉素的提取方法，其特征在于:所述的第5步中，在進行萃取之前，加入一次反萃取液的2~3倍體積的純水對第三陶瓷膜清液進行稀釋，并保持pH為11~12。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林可霉素的提取方法，其特征在于:所述的第5步中，仲辛醇的量為第三陶瓷膜清液體積的1/5~1/4，鹽酸溶液的體積是萃取有機相體積的1/7~1/5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的林可霉素的提取方法，其特征在于:所述的第6步中，丙酮的加入體積是二次反萃取液體積的5~8倍。
【文檔編號】C07H1/08GK103724380SQ201310723011
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月25日
【發(fā)明者】秦泗光, 熊福軍, 陳磊, 王貝貝, 彭文博, 張宏 申請人:江蘇久吾高科技股份有限公司