專利名稱：一種供hplc分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵液進(jìn)行高效液相色譜法檢測的前處理方法，尤其涉及一種供 HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法。
背景技術(shù)：
林可霉素屬于林可霉素類抗生素，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌及某些厭氧的革蘭氏陰性菌有效，對陽性菌的作用類似紅霉素。主要用于厭氧菌引起的腹腔和婦科感染，也常用于敏感陽性菌所致的各種嚴(yán)重感染，因它濃集于骨組織，故為金葡骨髓炎的首選藥，其在臨床上應(yīng)用較為廣泛。林可霉素的組分包括林可霉素及其B組分，其中B組分為雜質(zhì)組分，目前林可霉素發(fā)酵液單位的檢測最常用的為生物檢測或旋光法檢測，均無法對林可霉素B組分進(jìn)行檢測。相對于生物檢測或旋光法檢測，高效液相色譜法(HPLC)具有快速、準(zhǔn)確、林可霉素B組分的量能直觀比較的優(yōu)點，特別是在林可霉素菌種選育時搖瓶發(fā)酵液的檢測上表現(xiàn)更為突出，有利于優(yōu)選出林可霉素B組分低的菌種，其應(yīng)用也日益廣泛。在應(yīng)用HPLC法檢測發(fā)酵液單位中，發(fā)酵液前處理方法的優(yōu)劣對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、色譜柱的損傷程度以及檢測效率影響較大，因而對發(fā)酵液前處理方法的改進(jìn)與提高很有意義。現(xiàn)有技術(shù)中，林可霉素發(fā)酵液前處理技術(shù)(張朝正等，多元萃取體系分離發(fā)酵液中林可霉素的過程研究，中國科學(xué)院上海冶金研究所；材料物理與化學(xué)(專業(yè))博士論文 2000年度)是發(fā)酵液經(jīng)復(fù)合萃取劑、pH為10. 5、溫度為常溫、相比r (0/A)=0. 5條件下多元萃取，一級萃取收率可達(dá)到92%以上。此林可霉素發(fā)酵液前處理方法缺點在于過程復(fù)雜， 需進(jìn)行多元萃取，萃取不完全，只能測定萃取相中林可霉素含量，從而影響測定的準(zhǔn)確性， 效率比較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，旨在提高HPLC分析林可霉素發(fā)酵液單位及林可霉素B組分的準(zhǔn)確性，提高液相色譜柱的分離效果和使用壽命。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的
一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，所述方法包括如下步驟
1)將林可霉素發(fā)酵液進(jìn)行離心分離去除菌絲體與固體雜質(zhì)得上清液；
2)將步驟I)所得上清液與乙醇按1:2 4體積比混合均勻，通過離心分離析出水溶性蛋白質(zhì)后得到的清液即可作為樣品用于高效液相色譜法(HPLC)分析林可霉素及B組分含量。為進(jìn)一步除去微小的顆粒雜質(zhì)，所述步驟2)中離心分離后得到的清液用孔徑為 O. 22 μ m O. 45 μ m偏氟膜(F膜)過濾。優(yōu)選的，所述步驟2)中將步驟I)所得上清液與乙醇以1:4的體積比混合均勻，可以除去很大一部分不溶于乙醇水溶液的雜質(zhì),使離心液中含有的水溶性蛋白質(zhì)變性析出，從而被離心除去，有利于提高色譜柱的使用壽命。所述步驟I)中離心分離的條件為4000 10000r/min下離心10 15分鐘,步驟
2)中離心分離的條件為6000 12000r/min下離心10 20分鐘。優(yōu)選的，步驟2)中離心分離后得到的清液用孔徑為O. 22 μ m偏氟膜(F膜)過濾。優(yōu)選的，所述步驟I)中的離心時間為10分鐘。優(yōu)選的，所述步驟2)中的離心時間為15分鐘。本發(fā)明中，所述的林可霉素發(fā)酵液是指任何產(chǎn)林可霉素的菌株在適當(dāng)?shù)臈l件下發(fā)酵產(chǎn)生出來的林可霉素發(fā)酵液。本發(fā)明的有益效果是通過本方法對林可霉素發(fā)酵液處理后，供HPLC分析的樣品中的雜質(zhì)大大降低，林可霉素與林可霉素B組分及相鄰峰均能有效分離，連續(xù)進(jìn)行數(shù)百個樣品分析，未見柱壓明顯升高，色譜柱的理論塔板數(shù)符合檢測要求，分析效果良好。
具體實施例方式實施例I :
取林可霉素生產(chǎn)發(fā)酵液，于4000r/min離心10分鐘，去除菌絲體與固體雜質(zhì)，吸取上清液，按體積比1:2加入乙醇，混合均勻，在6000r/min條件下離心20分鐘；然后用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾后的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可霉素，《中華人民共和國藥典》(2010)二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續(xù)分析50個樣品后，柱壓為1298 1334psi， 林可霉素峰的理論塔板數(shù)為6800 7500 ;林可霉素與林可霉素B組分分離度大于14，與相鄰的色譜峰分離度大于9，分析前后，柱壓略有升高，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數(shù)沒有明顯變化。實施例2:
取林可霉素生產(chǎn)發(fā)酵液，于4000r/min離心15分鐘，去除菌絲體與固體雜質(zhì)，吸取上清液，按體積比1:3加入乙醇，混合均勻，在6000r/min條件下離心20分鐘；然后用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾后的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可霉素，《中華人民共和國藥典》(2010)二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續(xù)分析50個樣品后，柱壓為1316 1343psi， 林可霉素峰的理論塔板數(shù)為6800 7500 ;林可霉素與林可霉素B組分分離度大于14，與相鄰的色譜峰分離度大于9，分析前后，柱壓沒有明顯變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數(shù)未下降。實施例3:
取林可霉素生產(chǎn)發(fā)酵液，于6000r/min離心15分鐘，去除菌絲體與固體雜質(zhì)，吸取上清液，按體積比1:4加入乙醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心15分鐘；然后用O. 22 μ m 偏氟膜過濾；過濾后的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可霉素，《中華人民共和國藥典》(2010)二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續(xù)分析50個樣品后，柱壓為1320 1337psi， 林可霉素峰的理論塔板數(shù)為6800 7500 ;林可霉素與林可霉素B組分分離度大于15，與相鄰的色譜峰分離度大于9，分析前后，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數(shù)未下降。實施例4:
取林可霉素菌種選育搖瓶發(fā)酵液，于8000r/min離心10分鐘，去除菌絲體與固體雜質(zhì)，吸取上清液，按體積比1:3加入乙醇，混合均勻，在80000r/min條件下離心17分鐘；然后用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾后的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可霉素《中華人民共和國藥典》(2010) 二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續(xù)分析80個樣品后，柱壓為 1330 1361psi，林可霉素峰的理論塔板數(shù)為6800 7500 ;林可霉素與林可霉素B組分分離度大于14，與相鄰的色譜峰分離度大于9，分析前后，柱壓沒有明顯變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數(shù)未下降。實施例5:
取林可霉素菌種選育搖瓶發(fā)酵液，于lOOOOr/min離心10分鐘，去除菌絲體與固體雜質(zhì)，吸取一定量的上清液，按體積比1:4加入乙醇，混合均勻，在12000r/min條件下離心10 分鐘；然后用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾后的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可霉素《中華人民共和國藥典》(2010) 二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續(xù)分析120個樣品后，柱壓為1328 1357psi，林可霉素峰的理論塔板數(shù)為6800 7500 ;林可霉素與林可霉素B組分分離度大于15，與相鄰的色譜峰分離度大于9，分析前后，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數(shù)未下降。上述實施例僅是本發(fā)明的較佳實施方式，詳細(xì)說明了本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和實施要點，并非是對本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行限制，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的任何簡單修改及等效結(jié)構(gòu)變換或修飾，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟.1)將林可霉素發(fā)酵液進(jìn)行離心分離去除菌絲體與固體雜質(zhì)得上清液；.2)將步驟I)所得上清液與乙醇按1:2 4體積比混合均勻，通過離心分離析出水溶性蛋白質(zhì)后得到的清液即可供HPLC分析使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，其特征在于，所述步驟2)中離心分離后得到的清液用孔徑為O. 22 μ m O. 45 μ m偏氟膜過濾。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，其特征在于，所述步驟2)中將步驟I)所得上清液與乙醇按1:4的體積比混合均勻。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，其特征在于，所述步驟I)中離心分離的條件為4000 10000r/min下離心10 15分鐘,步驟2)中離心分離的條件為6000 12000r/min下離心10 20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，其特征在于，步驟2)中離心分離后得到的清液用孔徑為O. 22 μ m偏氟膜過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，其特征在于，所述步驟I)中的離心時間為10分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，其特征在于，所述步驟2)中的離心時間為15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開一種供HPLC分析用林可霉素發(fā)酵液的前處理方法，該方法包括如下步驟1)將林可霉素發(fā)酵液離心分離得上清液；2)將上清液與乙醇以1:2～4體積比混合均勻，離心分離析出水溶性蛋白質(zhì)后得到的清液即可用于HPLC分析。使用該方法預(yù)處理發(fā)酵液后，供HPLC分析的樣品中的雜質(zhì)大大降低，用于林可霉素發(fā)酵液檢測，林可霉素組分及其B組分均與相鄰雜質(zhì)峰有效分離，分析效果好，林可霉素B組分能直觀的用數(shù)據(jù)表現(xiàn)出來，分析準(zhǔn)確率高，連續(xù)進(jìn)行數(shù)百個樣品分析，未見柱壓明顯升高，色譜柱理論塔板數(shù)能滿足檢測要求。
文檔編號G01N30/06GK102590395SQ20121001053
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月14日
發(fā)明者劉瑞華, 姚健, 李為全, 營麗, 陳倩倩 申請人:安徽省皖北藥業(yè)股份有限公司