一種抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清，其為以豬傳染性胃腸炎病毒HB08株CGMCCNo.7807的滅活疫苗為免疫原，從免疫豬中分離血清制得。本發(fā)明制備的高免血清性狀良好，無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染，特異性強(qiáng)，安全性好，人工感染治愈率達(dá)100%，血清中和效價(jià)在29以上。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗血清的制備方法，具體是一種抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬傳染性胃腸炎(porcinetransmissible gastroenteritis, TGE)是引起豬腹瀉的一種重要接觸性病毒性腸道傳染病，發(fā)病快，對(duì)2周齡以?xún)?nèi)仔豬有高度致死率，幾乎能達(dá)到100%。該病是一種病毒病，目前尚無(wú)有效的治療藥物方法。給妊娠母豬接種疫苗，仔豬可通過(guò)初乳以被動(dòng)免疫的方式獲得抵抗力，但是隨著母源抗體的消失或參差不齊，仔豬的抵抗力逐漸下降或不同，對(duì)傳染性胃腸炎的易感性也表現(xiàn)不同，一旦發(fā)病，就造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。采用高免血清進(jìn)行群體治療是可行的辦法，也是以被動(dòng)免疫的方式使仔豬獲得免疫力，達(dá)到保護(hù)仔豬的目的。
但是臨床上流行的傳染性胃腸炎病毒一旦發(fā)生變異，由此制備的高免血清治療效果就會(huì)減弱，感染豬的發(fā)病率和死亡率就會(huì)增加。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清及其制備方法。
[0004]首先，本發(fā)明提供一種抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清，其為以豬傳染性胃腸炎病毒HB08株CGMCC N0.7807的滅活疫苗為免疫原，從免疫豬中分離血清制得。
[0005]其中，所述的豬傳染性胃腸炎病毒HB08株CGMCC N0.7807的滅活疫苗為將豬傳染性胃腸炎病毒HB08株滅活與油佐劑乳化制備而成。
[0006]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供所述抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清制備方法，包括如下步驟:
1)免疫:以豬傳染性胃腸炎病毒滅活疫苗為免疫原免疫50-60日齡長(zhǎng)大二元豬，第一次免疫:肌肉注射共4ml，第二次免疫:在第一次免疫后14日進(jìn)行，免疫劑量8ml，分兩點(diǎn)注射，第三次免疫:在第二次免疫后14日進(jìn)行，免疫劑量16ml，分三點(diǎn)注射；
2)采血:最后一次免疫后15~21日，檢測(cè)中和抗體效價(jià)，達(dá)到29以上時(shí)，殺豬無(wú)菌放
血；
3)血清分離與制備:用消毒刀將凝固血?jiǎng)澇?-3平方厘米的小塊，濾出血清，分裝于無(wú)菌生理鹽水瓶中，其余置于_70°C保存。
[0007]本發(fā)明的TGEV HB08株是 申請(qǐng)人:從河北一發(fā)病豬場(chǎng)分離到的強(qiáng)毒株經(jīng)過(guò)125代致弱后獲得的TGEV弱毒株，是目前國(guó)內(nèi)的TGEV流行株，該疫苗株毒力穩(wěn)定，安全，免疫原性好，能夠抵抗目前臨床上流行的強(qiáng)毒株的攻擊，保護(hù)率達(dá)90%以上。
[0008]將分離到的TGEV 125-165代TGEV致弱株，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)是CGMCC N0.7807，保藏時(shí)間是2013年6月28日。
[0009]本發(fā)明成功試制出了抗豬傳染性胃腸炎病毒的高免血清，其物理性狀良好，無(wú)細(xì)菌、霉菌和支原體生長(zhǎng)，無(wú)外源病毒污染，中和抗體效價(jià)在29倍以上。試驗(yàn)結(jié)果表明，本血清不但具有較高的抗體效價(jià)，而且還具有很強(qiáng)的特異性，完全符合檢測(cè)用血清標(biāo)準(zhǔn)的要求，為評(píng)價(jià)疫苗免疫效力提供了有力工具。血清效力評(píng)估結(jié)果表明，本發(fā)明制備的高免血清治愈率更高。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1 為 TGEV CPE 圖片(400X )。
[0011]圖2為T(mén)GEV分離毒S基因PCR檢測(cè)結(jié)果。圖中，M:DNA Marker DL2000 ；1:樣品；
2:陰性對(duì)照。
[0012]圖3為不同代次TGEV 0RF3序列比對(duì)結(jié)果。
[0013]圖4所示為本發(fā)明高免血清與豬瘟病毒CSFV作用后免疫熒光檢測(cè)結(jié)果。其中，A為接種TGEV血清和CSFV混合物的細(xì)胞孔；B為接種細(xì)胞維持液的細(xì)胞孔。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0015]實(shí)施例1豬傳染性胃腸炎病毒HB08株免疫原的制備
取河北某豬場(chǎng)豬傳染性胃腸炎陽(yáng)性小腸適量，刮取腸粘膜和內(nèi)容物，按照1:5的比例(重量:體積)加入PBS，反復(fù)凍融3次，離心取上清，0.22 μ m濾膜過(guò)濾，濾液中加入終濃度為20μ g/ml的胰酶，37°C處理1.5小時(shí)。
[0016]按常規(guī)方法接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層的ST細(xì)胞，按照10%的比例接種病毒，37°C吸附I小時(shí)，補(bǔ)足細(xì)胞維持液(含lOPg/ml的胰酶)，37°C溫箱培養(yǎng)。如此操作盲傳至第8代時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)輕微的CPE變化，傳至第17代時(shí)則出現(xiàn)明顯、穩(wěn)定的CPE變化，細(xì)胞圓縮，顆粒增加，聚堆呈葡萄串樣，細(xì)胞出現(xiàn)損傷和脫落(圖1)。
[0017]參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1446-2010中反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法進(jìn)行(SOP)。即根據(jù) S 基因設(shè)計(jì)檢測(cè)引物對(duì):S-F:5’ -TATTTGTGGTYTTGGTYGTAATGC-3，；S-R:5’ -GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA-3’，以 95°C 45S、50°C 45S、72°C Imin 進(jìn)行 32 個(gè)循環(huán)后，72°C延伸5min。擴(kuò)增S基因片段為886bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0018]將豬傳染性胃腸炎病毒在ST細(xì)胞上連續(xù)傳代120代，并在此過(guò)程進(jìn)行了克隆純化，然后繼續(xù)在ST細(xì)胞上傳代至165代。TGEV 0RF3基因序列在第20代、40代、70代、100代處于比較穩(wěn)定的的狀態(tài)，有個(gè)別堿基的變化，但沒(méi)有改變氨基酸；而第125代開(kāi)始0RF3基因連同前面的間隔區(qū)序列出現(xiàn)81個(gè)核苷酸的缺失(起始密碼子前30個(gè)核苷酸、后51個(gè)核苷酸連續(xù)81個(gè)核苷酸缺失)，第125代、145代、165代穩(wěn)定缺失81個(gè)核苷酸，結(jié)果如圖3，序列如SEQ ID N0.5所示。擴(kuò)增0RF3序列的引物的引物為:
0RF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3，
0RF3-R:CAACAGGAACCAGAAAAATGA-3， 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄對(duì)第125~165代病毒進(jìn)行無(wú)菌、支原體及外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果無(wú)細(xì)菌，霉菌，支原體及外源病毒污染。將125~165代致弱株種毒命名為豬傳染性胃腸炎病毒HB08株，其保藏編號(hào)是CGMCC N0.7807 ;保藏時(shí)間是2013年6月28日；保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0019]取TGEV HB08株第145代與細(xì)胞維持液按1:50的比例接種到已長(zhǎng)滿(mǎn)單層的ST細(xì)胞上，置于37°C培養(yǎng)，待80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲病毒，測(cè)定毒價(jià)，(病毒含量為IO7TCID5tl/ml )，加入0.3%的甲醛，置于37°C恒溫培養(yǎng)箱24h進(jìn)行滅活，期間搖動(dòng)數(shù)次，加入3倍量油佐劑，經(jīng)乳化制備成滅活疫苗，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0020]實(shí)施例2血清制備 1)免疫程序
第一次免疫:肌肉注射共4ml。
[0021]第二次免疫:在第一次免疫后14日進(jìn)行，免疫劑量8ml，分兩點(diǎn)注射。
[0022]第三次免疫:在第二次免疫后14日進(jìn)行，免疫劑量16ml，分三點(diǎn)注射。
[0023]2)采血
最后一次免疫后15~21日，(先采血I次后，采用中和實(shí)驗(yàn)方法測(cè)血清效價(jià)，再放血致死，間隔3~4日)，對(duì)豬進(jìn)行健康檢查，無(wú)任何疾病者，于采血前12小時(shí)不喂飼料，但不限制飲水。事前先將殺豬刀、進(jìn)刀部位皮膚消毒，裝血的淺盆經(jīng)洗凈后蒸汽消毒。無(wú)菌放血。
[0024]3)血清分離與制備
采用自然凝結(jié)加壓法分離血清。用消毒刀將凝固血?jiǎng)澇蒊平方厘米的小塊，濾出血清，分裝于經(jīng)過(guò)蒸汽消毒的容量為500毫升的生理鹽水瓶中，每瓶取出20ml被檢，其余置于-70°C保存。
[0025]豬傳染性胃腸炎病毒(HB08株)滅活后與油佐劑乳化制備成免疫原,最后一次免疫接種后15日檢查其中和抗體效價(jià)，達(dá)到29以上。隨后按常規(guī)方法無(wú)菌采血及分離血清，并對(duì)血清半成品進(jìn)行了純凈性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，制備的血清中無(wú)細(xì)菌、霉菌和支原體生長(zhǎng)，無(wú)外源病毒污染，均符合要求。
[0026]實(shí)施例3血清效價(jià)測(cè)定
用DMEM將被檢高免血清按1: 8、1:16、1:32…1:2048稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度血清均加入等量滴度為200TCID50/0.1ml的TGEV HB08株，37°C中和I小時(shí)，接種長(zhǎng)滿(mǎn)ST細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞板6孔，每孔100μ 1，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞6孔和僅接種細(xì)胞維持液陰性對(duì)照細(xì)胞6孔，370C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~5日，每日觀察CPE，中和組和陰性對(duì)照組細(xì)胞孔均應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變，而病毒對(duì)照組細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞病變。以能夠保護(hù)50%細(xì)胞不發(fā)生病變的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的中和效價(jià)。從表1可以看出，制備的抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清中和效價(jià)在29以上。這也為以后疫苗效力評(píng)估中如何應(yīng)用高免血清提供了依據(jù)。
[0027]表1抗TGEV高免血清效價(jià)測(cè)定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種抗豬傳染性胃腸炎病毒高免血清，其為以豬傳染性胃腸炎病毒HB08株CGMCCN0.7807的滅活疫苗為免疫原，從免疫豬中分離血清制得。
2.如權(quán)利要求1所述的高免血清，其特征在于，所述的豬傳染性胃腸炎病毒HB08株CGMCC N0.7807的滅活疫苗為將豬傳染性胃腸炎病毒HB08株滅活與油佐劑乳化制備而成。
3.權(quán)利要求1或2所述的高免血清的制備方法，其包括如下步驟: O免疫:以豬傳染性胃腸炎病毒滅活疫苗為免疫原免疫50-60日齡長(zhǎng)大二元豬，第一次免疫:肌肉注射共4ml，第二次免疫:在第一次免疫后14日進(jìn)行，免疫劑量8ml，分兩點(diǎn)注射，第三次免疫:在第二次免疫后14日進(jìn)行，免疫劑量16ml，分三點(diǎn)注射； 2)采血:最后一次免疫后15~21日，檢測(cè)中和抗體效價(jià)，達(dá)到29以上時(shí)，殺豬無(wú)菌放血； 3)血清分離與制備:用消毒刀將凝固血?jiǎng)澇?-3平方厘米的小塊，濾出血清，分裝于無(wú)菌生理鹽水瓶中，其余置于_70°C保存。
【文檔編號(hào)】C07K16/06GK103709248SQ201310722668
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】侯艷紅, 王貴華, 趙亞榮, 劉明明, 于萍萍, 滿(mǎn)坤, 盧會(huì)英, 陳翠云 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究中心, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司, 北京科牧豐生物制藥有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司