豬病毒性腹瀉四種病原的液相芯片檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及豬病毒性腹瀉四種病原的液相忍片檢測方 法，更具體設(shè)及一種能夠同時檢測豬病毒性腹瀉四種病原的液相忍片檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬病毒性腹瀉疾病是由多種病毒引起的W腹瀉、嘔吐及脫水為主要臨床癥狀的高 度接觸性腹瀉疾病。豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒 (PRoV)W及豬源牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)是引起該病的主要病原，各年齡豬均可感染，病 死率高達(dá)100%。
[0003] 近年來，豬病毒性腹瀉疾病的發(fā)病死亡率逐漸上升，而且由單一病原的感染發(fā)展 為多病原的混合感染，給臨床診斷帶來困難，延誤診斷時機(jī)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了經(jīng)濟(jì)損失。目 前，診斷該類病原的實驗室常規(guī)檢測方法有病毒的分離鑒定、ELISA、實時巧光定量PCR技術(shù) 等，但運些方法存在實驗周期長、操作繁瑣、或者僅限單一病毒、或者2-3個病毒檢測，沒有 同時檢測W上四種病毒的技術(shù)。
[0004] 液相忍片技術(shù)也稱微球體懸浮忍片技術(shù)，是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一種W 用巧光染色方法編碼直徑只有5.6皿的微球或6.5皿的磁性微球為核屯、的檢測技術(shù)。相對于 其他實驗室檢測技術(shù)，液相忍片技術(shù)具有通量高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣W及操 作簡便等無法比擬的優(yōu)勢。該項技術(shù)整合了應(yīng)用流體學(xué)、微球編碼、激光技術(shù)W及高速數(shù)字 信號處理等先進(jìn)技術(shù)，在特制的聚苯乙締小球或磁性小球上包被核酸探針及抗原抗體等分 子，在液相反應(yīng)體系中可W同時檢測多種成分，成為新型基因和蛋白組學(xué)中的研究工具，已 經(jīng)通過抑A認(rèn)證，可直接用于臨床診斷。
[000引液相忍片技術(shù)在核酸檢測中主要有立種檢測模式:直接DNA雜交、競爭性DNA雜交、 酶反應(yīng)beads雜交。直接DNA雜交是主流技術(shù)，其優(yōu)點是操作簡便且成本低。該項技術(shù)原理是 WPCR來標(biāo)記祀DNA，然后使其與偶聯(lián)在磁珠上的互補(bǔ)探針進(jìn)行直接雜交，最后加入巧光報 告分子SA-PE(鏈酶親和素-藻紅蛋白），用Luminex 200系統(tǒng)檢測，對所得平均中位巧光值 (MFI)進(jìn)行分析。在直接雜交之前，PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行生物素標(biāo)記。生物素標(biāo)記一般有兩種方 法：第一種是對引物進(jìn)行標(biāo)記，另一種是對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。研究者通常選用第一種方 法，操作方便，而且一般對下游引物進(jìn)行5 '端生物素化，然后對保守性較好的300bp左右的 DNA進(jìn)行擴(kuò)增，運樣祀DNA反義鏈就標(biāo)記上了生物素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供豬病毒性腹瀉四種病原的液相忍片檢測方法，首先設(shè)計合 成針對豬流行性腹瀉病毒(P抓V)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PRoV)W及豬 源牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的特異性探針及引物對，建立能夠同時檢測PEDV、TGEV、PRoV W 及BVDV的檢測方法，為臨床樣品檢測提供一種新的檢測方法，同時也為類似病毒的高通量 檢測提供借鑒。
[0007]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[000引本發(fā)明利用液相基因忍片中的DNA直接雜交法原理，建立一種可W同時檢測陽DV、 TGEV、PRoV及BVDV的檢測方法。首先分別設(shè)計四種病毒的特異性探針及引物對，然后分別進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與成功偶聯(lián)在微球上的探針進(jìn)行直接雜交，最后加入巧光報告分子 (SA-PE)，用Luminex200液相忍片分析檢測儀進(jìn)行測定，對所得MFI值進(jìn)行分析。并通過對雜 交溫度、雜交時間W及上、下游引物的比例優(yōu)化篩選，最后得出一個較為完整的檢測體系。
[0009] -種用于同時檢測四種豬病毒性腹瀉病原的液相基因忍片的引物對和探針，包括 豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PRoV)W及豬源牛病 毒性腹瀉病毒(BVDV)的上、下游引物和探針，所有下游引物5'端進(jìn)行生物素(Biotin)標(biāo)記， 所有的探針5'端進(jìn)行氨基(N出(C出)12修飾，具體序列如表1所示。
[0010] 表1
[0011]
[0013] 本發(fā)明所述四種豬病毒性腹瀉病原的液相忍片檢測方法，其包括如下步驟：
[0014] 1)W提取待測樣品中的RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;
[0015] 2)分別利用病毒BVDV的NPn基因、TGEV的N基因、P邸V的Μ基因、PRoV的VP6基因序列 設(shè)計、合成相應(yīng)的上下游引物、探針，各病毒上下游引物、特異性探針的具體序列如表1所 示；
[0016] 3)微球與探針進(jìn)行偶聯(lián)
[0017]選用不同顏色編碼的微球分別偶聯(lián)病毒BVDV的探針BN-Probe、病毒TGEV的探針 TGEV-Probe、病毒陽DV的探針PMl-Probe、病毒PRoV的探針PVP6-Probe，將得到的四種偶聯(lián) 到微球的探針進(jìn)行混合，備用；
[001引 4)雜交
[0019] W步驟1)得到的cDNA為模板，利用步驟2)合成的上下游引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得 到生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0020] 將所述生物素化的擴(kuò)增產(chǎn)物與步驟3)中偶聯(lián)到微球上的探針混合物進(jìn)行雜交反 應(yīng)；
[002。 5)檢測
[0022]對步驟4)得到的雜交產(chǎn)物進(jìn)行液相忍片檢測，根據(jù)平均中位巧光強(qiáng)度值(MFI)判 定檢測結(jié)果：
[002引若待測樣品相應(yīng)病毒的MF巧陰性對照的MFI的比值> 3,則待測樣品判定為該病 毒陽性；
[0024] 若2含待測樣品相應(yīng)病毒的Μ門與陰性對照MFI的比值<3,則待測樣品判定為該病 毒疑似陽性；
[0025] 若待測樣品相應(yīng)病毒的MFI與陰性對照MFI的比值<2,則待測樣品判定為該病毒 陰性。
[0026] 進(jìn)一步，所述微球是直徑為6.5μΜ的磁性微球。
[0027] 步驟4)中，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系中上、下游引物的質(zhì)量比為1:1~8。
[002引再，步驟4)中，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系中上、下游引物的濃度^μΜ。
[0029] 步驟4)中，所述PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)程序中退火溫度為50~56°C。
[0030] 優(yōu)選的，步驟4)中，所述雜交反應(yīng)的雜交溫度為50~53°C，雜交時間為20~35min。
[0031] 更優(yōu)選的，步驟4)中，所述雜交反應(yīng)的雜交溫度為50°C，雜交時間為35min。
[0032] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述微球是直徑為6.5μΜ的磁性微球。
[0033] 本發(fā)明的有益效果：
[0034] 本發(fā)明成功建立了能同時檢測豬病毒性腹瀉四種病原的液相忍片檢測方法，且該 方法特異性好，重復(fù)穩(wěn)定性好，靈敏度比現(xiàn)有多重PCR檢測方法至少提高10倍。臨床樣品檢 測與現(xiàn)有PCR方法陽性符合率為100%，可W大規(guī)模應(yīng)用于臨床樣品檢測。
[0035] 說明書附圖
[0036] 圖1為本發(fā)明實施例2中擴(kuò)增產(chǎn)物的PCR電泳圖，其中，泳道1、2代表BVDV( + )、（-)， 泳道3、4代表陽0￥( + )、（-)，泳道5、6代表?3〇￥( + )、（-)，泳道7、8代表了66￥( + )、（-)。
[0037] 圖2為本發(fā)明實施例4中44#微球偶聯(lián)BVDV的探針BN-Probe與互補(bǔ)探針雜交后液相 忍片檢測結(jié)果。
[0038] 圖3為本發(fā)明實施例4中25#微球偶聯(lián)PEDV的探針PMl-Probe與互補(bǔ)探針雜交后液 相忍片檢測結(jié)果。
[0039] 圖4為本發(fā)明實施例4中20#微球偶聯(lián)PRoV的探針PVP6-Probe與互補(bǔ)探針雜交后液 相忍片檢測結(jié)果。
[0040] 圖5為本發(fā)明實施例4中15#微球偶聯(lián)TGEV的探針TGEV-Probe與互補(bǔ)探針雜交后液 相忍片檢測結(jié)果。
[0041] 圖6為本發(fā)明實施例6的液相忍片檢測結(jié)果。
[0042] 圖7為本發(fā)明實施例7特異性實驗時的液相忍片檢測結(jié)果。
[0043] 圖8為本發(fā)明實施例7靈敏度實驗時的液相忍片檢測結(jié)果。
[0044] 圖9為病毒陽DV的PCR檢測結(jié)果，其中，M:DL2000DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-8分別代 表質(zhì)粒倍比稀釋 1、1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇- 6、1〇-7;9代表陰性。
[0045] 圖10為病毒PRoV的PCR檢測結(jié)果，其中，M:DL2000DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-8分別 代表質(zhì)粒倍比稀釋 1、1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-6、1〇-7;9代表陰性。
[0046] 圖11為病毒BVDV的PCR檢測結(jié)果，其中，M:DL2000DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-8分別 代表質(zhì)粒倍比稀釋 1、1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-6、1〇-7;9代表陰性。
[0047] 圖12為病毒TGEV的PCR檢測結(jié)果，其中，M:DL2000DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-7分別 代表質(zhì)粒倍比稀釋1、1〇-1、1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇-6;8代表陰性。
【具體實施方式】
[0048] 下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0049] 主要材料與試劑
[0050] 儀器：ABI梯度PCR儀，凝膠成像分析系統(tǒng)（B10-RAD )，低溫臺式高速離屯、機(jī) (邸CKMAN)，滿旋震蕩器(Vision)，液相忍片檢測儀(Luminex200，Luminex公司）。
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