專利名稱：用于治療呼吸道感染的方法和藥物組合物的制作方法
用于治療呼吸道感染的方法和藥物組合物發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于治療呼吸道感染的方法和藥物組合物。更特別地，本發(fā)明涉及用于治療呼吸道感染的方法中的TLR5激動劑。
發(fā)明背景
呼吸道感染是上呼吸道(例如鼻、耳、鼻竇和咽喉)和下呼吸道(例如氣管、支氣管和肺)的常見感染。上呼吸道感染的癥狀包括流鼻涕或鼻塞、煩躁、坐立不安、食欲不振、 活動力降低、咳嗽和發(fā)燒。
病毒性呼吸道感染引起和/或與喉嚨痛、感冒、義膜性喉炎和流感有關(guān)。引起上呼吸道和下呼吸道感染的病毒的實例包括鼻病毒和流感病毒A和B。
常見的呼吸道細(xì)菌感染引起和/或與例如百日咳和鏈球菌性喉炎有關(guān)。引起上呼吸道和下呼吸道感染的細(xì)菌的實例是肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)。肺炎鏈球菌(肺炎球菌)在全世界的嬰兒和老年人之中引起呼吸道感染。莢膜多糖是主要的毒性因子，并且其組成定義了肺炎球菌的91個血清型。某些血清型無癥狀地定植代表細(xì)菌個體間傳播用儲庫的人鼻咽。在一些個體中，定植可能發(fā)展為肺炎球菌肺炎和侵襲性疾病。與此相反，血清型如血清型I雖然幾乎與定植無關(guān)，但是引起侵襲性感染。
當(dāng)前呼吸道感染的治療包括分別施用用于治療、預(yù)防或改善病毒性、細(xì)菌性和真菌性呼吸道感染的抗病毒劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑。令人遺憾地，對于某些感染，沒有可用的治療，感染已被證明是難以治療的，或?qū)κ茉囌呤┯弥委煱l(fā)生的副作用超過了益處。使用治療細(xì)菌性呼吸道感染的抗菌劑也可能產(chǎn)生副作用或?qū)е履退幘?。施用抗真菌劑可能引起腎衰竭或骨髓功能障礙，并且可能不能有效對抗免疫系統(tǒng)受抑制的受試者的真菌感染。 另外，微生物(例如病毒、細(xì)菌或真菌)引起的感染可能對施用的治療劑或治療劑的聯(lián)合具有耐藥性或形成耐藥性。事實上，對施用的治療劑形成耐藥性的微生物通常形成多向耐藥性或多藥耐藥性，也就是說，對作用機理不同于該施用藥劑的機理的治療劑的耐藥性。因此，由于耐藥性，許多感染證明是大量標(biāo)準(zhǔn)治療方案所難以治療的。
因此，需要治療、預(yù)防、控制和/或改善呼吸道感染及其癥狀的新療法。
激活先天防御對控制肺炎球菌感染是必不可少的。Toll樣受體2 (TLR2)、TLR4和 TLR9以及適配器MyD88參與了肺內(nèi)肺炎球菌的早期檢測和清除。包含Nodl和Nod2的胞質(zhì)受體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nod)也與肺炎球菌的識別有關(guān)。TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活了黏膜的先天應(yīng)答，所述先天應(yīng)答使吞噬細(xì)胞如多形核中性粒細(xì)胞(PMN)和巨噬細(xì)胞的募集以及殺微生物劑的產(chǎn)生達到頂點。此過程引發(fā)通過吞噬作用以及細(xì)胞外殺死而快速消滅該病原體。在MyD88缺失的動物中，肺炎鏈球菌不能在體內(nèi)引發(fā)任何PMN募集進入氣道，增大了動物對肺炎的易感性。最新研究已經(jīng)強調(diào)了人TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，表明一些MyD88多態(tài)性與 對肺炎球菌感染的易感性增加有關(guān)。
通過先天受體的活性調(diào)節(jié)免疫性是對抗感染引起保護性反應(yīng)的新興概念?；驹硎谴龠M在規(guī)模、質(zhì)量和動力上大大超過該病原體本身引起的先天應(yīng)答的先天應(yīng)答。已經(jīng)在若干動物模型中證明了 TLR激動劑治療傳染性疾病的有效性，包括呼吸道感染模型(Brown, K. L. , C. Cosseau, J. L. Gardy and R. E. Hancock 2007. Complexities of targeting innate immunity to treat infection. TrendsTmmunoI 28 :260-266. ；Lembo, A.，M. Pelletier, R.1yer, M. Timko, J. C. Dudda, T. E. West, C. B. Wilson, A. M. Haj jar, and S.J.Skerrett. 2008. Administration of a synthetic TLR4agonist protects mice frompneumonic tularemia. J Tmmunol 180 :7574-7581 ；Romagne, F. 2007. Current and future drugs targeting one class of innate immunityreceptors the Toll-like receptors. Drug Discov Today 12:80-87)。TLR5能檢測作為鞭毛主要成分的細(xì)菌鞭毛蛋白。包括上皮細(xì)胞的各種肺道細(xì)胞表達TLR5，但尚未研究TLR5信號通道的調(diào)節(jié)用于治療呼吸道感染。
發(fā)明簡述
本發(fā)明涉及用于治療呼吸道感染的方法和藥物組合物。更特別地，本發(fā)明涉及用于治療呼吸道感染的方法中的TLR5激動劑。
發(fā)明詳述
肺炎鏈球菌是嬰兒肺炎和老年人肺炎的主要原因。先天防御對控制肺炎球菌感染是必不可少的，有缺陷的應(yīng)答會在易感個體中引發(fā)疾病。在這里，本發(fā)明人表明，鞭毛蛋白能夠局部激活先天免疫，由此增強對急性肺炎的抵抗力。鞭毛蛋白黏膜治療提高了肺內(nèi)肺炎鏈球菌的清除率并促進了對感染增加的存活率。此外，處理感染小鼠之后，肺結(jié)構(gòu)完全修復(fù)，表明鞭毛蛋白能重建穩(wěn)定狀態(tài)。使用不能通過TLR5發(fā)信號的鞭毛蛋白突變體， 他們證實TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對保護是必不可少的。在呼吸道中，鞭毛蛋白誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤進入氣道，并上調(diào)編碼IL-6、TNF-a、CXCLl、CXCL2和CCL20的基因的表達。使用消耗性抗體，他們證明中性粒細(xì)胞是用于保護的主要效應(yīng)器。此外，他們發(fā)現(xiàn)B和T細(xì)胞缺失的SCID小鼠清除肺炎鏈球菌攻擊達到與具有免疫能力的動物相同的程度，這表明鞭毛蛋白誘導(dǎo)的保護并不需要這些細(xì)胞群?？傊?，該結(jié)果強調(diào)，通過不被肺炎鏈球菌天然接合的 TLR的先天免疫性黏膜刺激能夠增強治愈肺炎球菌肺炎的效力。此外，不愿受任何特定理論的約束，本發(fā)明人相信通過TLR5的先天免疫性黏膜刺激還提供了治療呼吸道感染的相應(yīng)方法。例如,微生物產(chǎn)物如已知通過呼吸道刺激先天免疫性的不可分型的流感嗜血桿菌 (Haemophilus influenzae)溶解產(chǎn)物，能夠防范各種呼吸道感染(Evans SE, Scott BL, Clement CG, Larson DT, Kontoyiannis D, Lewis RE, Lasala PR, Pawlik J, PetersonJff, Chopra AK,Klimpel G, Bowden G, HookM, Xu Y, Tuvim MJ,Dickey BF. Stimulated innate resistance of lung epithelium protectsmice broadly against bacteria and fung1. Am J Respir Cell Mol Biol. 2010 ；42 :40-50),包括肺炎鏈球菌感染(Clement CG, Evans SE, Evans CM, Hawke D, Kobayashi R, Reynolds PR, Moghaddam SJ, Scott BL, Melicoff E, Adachi R, Dickey BF, Tuvim MJ. Stimulation oflung innate immunity protects against lethal pneumococcal pneumoniain mice. Am J Respir Crit Care Med. 2008 ； 177 :1322-30.)。這種呼吸道感染包括由細(xì)菌、病毒和真菌引起的疾病。
因此，本發(fā)明涉及用于治療呼吸道感染的方法中的TLR5激動劑。
術(shù)語“呼吸道感染”具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，用來指由活微生物引起的上呼吸道(例如鼻、耳、鼻竇和咽喉)和下呼吸道(例如氣管、支氣管和肺)感染。
引起病毒感染的病毒的實例包括，但不限于，逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如，人嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV) I和II型和人免疫缺陷病毒(HIV))，皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒(HSV) I和 II型、Epstein-Barr病毒、HHV6-HHV8和巨細(xì)胞病毒)，沙粒病毒(例如拉沙熱病毒)，副粘病毒(例如麻疹病毒屬病毒、人呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、hMPV和肺炎病毒)， 腺病毒，布尼亞病毒(例如漢坦病毒)，冠狀病毒(comaviruses),絲狀病毒(例如伊波拉病毒)，黃病毒(例如，丙肝病毒(HCV)、黃熱病毒和日本腦炎病毒)，肝炎病毒(例如乙肝病毒(HBV))，正粘病毒(例如，流感病毒A、B和C和PIV)，乳多空病毒(例如乳頭瘤病毒)， 細(xì)小核糖核酸病毒(例如，鼻病毒、腸道病毒和甲肝病毒)，痘病毒，呼腸孤病毒(例如輪狀病毒)，囊膜病毒(例如風(fēng)疹病毒)，和棒狀病毒(例如狂犬病病毒)。
引起細(xì)菌性呼吸道感染的細(xì)菌的實例包括，但不限于水螺菌科、固氮螺菌科、固氮菌科、類桿菌科、巴爾通體種、蛭弧菌科、彎曲桿菌種、衣原體種(例如，衣原體肺炎鏈球菌)、梭狀芽胞桿菌、腸桿菌科(例如檸檬酸細(xì)菌種、愛德華氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、歐文氏菌種、 大腸桿菌、哈夫尼菌種、克雷伯氏桿菌種、摩根氏菌種、普通變形桿菌、普羅維登斯菌、沙門氏菌種、粘質(zhì)沙雷氏桿菌和弗累克斯訥氏桿菌)，Gardinella科、流感嗜血桿菌、鹽桿菌科、 螺桿菌科、Legionallaceae科、李斯特菌種、甲基球菌科、分枝桿菌屬(例如結(jié)核分枝桿菌)、奈瑟氏球菌科、海洋螺菌科、巴斯德氏菌科、肺炎球菌種、假單胞菌種、根瘤菌科、螺旋菌科、無毛螺旋體科、葡萄球菌屬(例如，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和化膿性葡萄球菌 (Staphylococcus pyrogenes))、鏈球菌屬(例如，腸炎鏈球菌、糞鏈球菌(Streptococcus Fasciae)和肺炎鏈球菌)、VampirovibrHelicobacter科和蝙幅弧菌科。
引起真菌感染的真菌的實例包括，但不限于犁頭霉種(例如，傘枝犁頭霉和分枝犁頭霉)、曲霉種(例如，黃曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉和土曲霉)、皮炎芽生菌、假絲酵母種(例如，白色假絲酵母、Candida glabrala、Candida kerr、克魯斯假絲酵母、近平滑假絲酵母、偽熱帶假絲酵母、Candida quillermondi1、皺裙假絲酵母、類星形假絲酵母和熱帶假絲酵母)、粗球孢子菌、耳霉種、新生隱球菌、小坎寧安霉種、莢膜組織胞漿菌、微小毛霉、 巴西副球孢子菌、波氏假阿利什菌、肺炎肺囊蟲、根霉種(例如，少根根霉、米根霉和小孢根霉)、糖酵母種和申克孢子絲菌。
在一個特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的呼吸道感染是細(xì)菌性呼吸道感染，更特別是由沒有鞭毛的細(xì)菌引起的呼吸道感染。通常，沒有鞭毛和弓I起呼吸道感染的細(xì)菌包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌或肺炎支原體。甚至更優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的呼吸道感染是肺炎球菌感染。
在此使用的術(shù)語“Toll樣受體5”或“TLR5”具有其在本領(lǐng)域中的一般含義，用來指任何物種的Toll樣受體5，但是優(yōu)選人Toll樣受體。當(dāng)激活時，TLR5通過轉(zhuǎn)導(dǎo)胞內(nèi)信號引起細(xì)胞應(yīng)答，所述信號通過一系列從細(xì)胞表面到細(xì)胞核的信號分子傳送。通常，TLR5的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域募集適配器蛋白，MyD88，其募集絲氨酸/蘇氨酸激酶IRAK(IRAK-1和IRAK-4)。IRAK 形成具有TRAF6的復(fù)合物，其然后與參與轉(zhuǎn)導(dǎo)TLR信號的各種分子相互作用。這些分子及其他TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分刺激轉(zhuǎn)錄因子的活性，所述轉(zhuǎn)錄因子例如fos、jun和NF_kB， 以及fos、jun和NF-kB調(diào)節(jié)基因的相應(yīng)基因誘導(dǎo)產(chǎn)物，例如IL_6、TNF_a、CXCLl、CXCL2和 CCL20。
在此使用的術(shù)語“TLR5激動劑”是指通過TLR5選擇性激活或增加正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的化合物(天然的或非天然的)。TLR5激動劑能夠通過TLR5間接地激活或增加正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如通過修飾或改變TLR5或TLR5配體的天然構(gòu)象。介導(dǎo)TLR5信號的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子以及由于TLR5激活生成的分子的活性是可觀察或測量的TLR5活性。因此，TLR5活性包括胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的募集以及由TLR5激活引起的下游事件，例如轉(zhuǎn)錄因子的激活和免疫調(diào)節(jié)分子的生成。TLR5細(xì)胞應(yīng)答介導(dǎo)受試者的先天免疫系統(tǒng)應(yīng)答，因為TLR5表達細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)受試者的其它免疫系統(tǒng)細(xì)胞以促進免疫應(yīng)答。因此，在此使用的術(shù)語“TLR5 介導(dǎo)的應(yīng)答”是用來指TLR5激動劑誘導(dǎo)TLR5介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答的能力。示例性的TLR5介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答包括受試者的轉(zhuǎn)錄因子例如fos、jun和NF-kB的激活，細(xì)胞因子和趨化因子例如IL-6、TNF- a、CXCLl、CXCL2和CCL20的產(chǎn)生，和免疫應(yīng)答的刺激。
在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的TLR5激動劑是低分子量激動劑，例如有機小分子。術(shù)語“有機小分子”是指大小可與通常用于藥物的那些有機分子相比較的分子。該術(shù)語排除了生物大分子(例如蛋白質(zhì)、核酸等)。優(yōu)選的有機小分子的尺寸范圍不超過約 5000Da，更優(yōu)選不超過2000Da，和最優(yōu)選不超過約lOOODa。
或者，根據(jù)本發(fā)明的TLR5激動劑可以是抗體(該術(shù)語包括“抗體片段”)。特別地， 該TLR5激動劑可以是針對TLR5的抗體，通過這樣的方式所述抗體激活該受體。
可以根據(jù)已知方法通過將合適的抗原或表位施用于選自例如豬、牛、馬、兔、山羊、 綿羊和小鼠的寄主動物來產(chǎn)生抗體。各種本領(lǐng)域已知的助劑可用于增強抗體產(chǎn)生。雖然可用于實施本發(fā)明的抗體可以是多克隆的，但是優(yōu)選單克隆抗體。可以使用能夠在培養(yǎng)中通過連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任何技術(shù)制備和分離單克隆抗體。生產(chǎn)和分離的技術(shù)包括， 但不限于雜交瘤技術(shù)；人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)和EBV-雜交瘤技術(shù)。或者，描述為生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(參見，例如美國專利第4，946，778號)可適合于生產(chǎn)抗TLR5單鏈抗體。
對實施本發(fā)明有用的TLR5激動劑還包括抗TLR5抗體片段，其包括但不限于，可由完整抗體分子的胃蛋白酶消化生成的F(ab' ) 2片段，和可通過還原該F (ab' )2片段的二硫鍵生成的Fab片段?；蛘撸梢詷?gòu)建Fab和/或scFv表達文庫以能夠快速識別具有針對 TLR5的期望特異性的片段。
人源化抗體及其抗體片段也可以根據(jù)已知的技術(shù)來制備?！叭嗽椿贵w”是包含來源于非人免疫球蛋白的最小序列的非人(例如嚙齒動物)嵌合抗體形式。就絕大部分而言， 人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)其中來自該受體的高變區(qū)(CDR)的殘基被來自例如具有期望特異性、親合性和接受力的小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的非人物種(供體抗體)的高變區(qū)的殘基取代。在某些情況下，該人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人類的殘基取代。此外，人源化抗體可以包含未在受體抗體或供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能。通常，該人源化抗體將包含基本上所有的至少一個，典型地兩個可變區(qū)，其中，所有或基本上所有對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些的高變環(huán)，以及所有或基本上所有FR，是人免疫球蛋白序列的那些。該人源化抗體任選還將包含至少一部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，典型地是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。制備人源化抗體的方法在例如，Winter (美國專利第5，225，539號)和Boss (Celltech，美國專利第4，816，397 號)中描述。
然后，在產(chǎn)生如上描述的抗體之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地選擇出是TLR5激動劑的抗體。
在另一實施方式中，該TLR5激動劑是適體。適體是在分子識別方面代表抗體替換物的一類分子。適體是有能力識別幾乎任何種類的高親合性和特異性的靶分子的低聚核苷酸或低聚肽序列。如Tuerk C.和Gold L.，1990所描述，這種配體可以通過隨機序列文庫的指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化(SELEX)分離。該隨機序列文庫可通過DNA的組合化學(xué)合成獲得。在這個文庫中，每個成員都是最終化學(xué)修飾的單一序列的線形低聚物。Jayasena S. D.，1999中已經(jīng)綜述了該類分子的可能的修飾、用途和優(yōu)點。肽適體由通過支架蛋白例如大腸桿菌硫氧還蛋白A展示的構(gòu)象約束的抗體可變區(qū)組成，所述肽適體通過兩種混合方法從組合文庫中挑選出來。
然后，在如上描述產(chǎn)生針對TLR5的適體之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地選擇出是TLR5激動劑的那些適體。
在另一特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的TLR5激動劑是多肽，以及更特別是鞭毛蛋白多肽。
在此使用的術(shù)語“鞭毛蛋白”是用來指各種革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌菌種中所包含的鞭毛蛋白。鞭毛蛋白的非限制性來源包括，但不限于埃希桿菌屬(Escherichia) 例如大腸桿菌(E. coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏桿菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus);沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門菌 (Salmonella enterica serovar Typhimurium);沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescans);志賀氏菌屬(Shigella);以及芽胞桿菌屬(Bacilli)例如枯草芽抱桿菌(B. subtilis)和地衣芽抱桿菌(B.1icheniformis);假單胞菌屬(Pseudomonas) 例如綠膿桿菌(P. aeruginosa);和鏈霉菌屬(Streptomyces)。這些實例是說明性的而不是限制性的。鞭毛蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列可公開地在NCBI基因庫中獲得，參見例如登錄號 AAL20871、NP_310689、BAB58984、AA085383、AAA27090、NP_461698、AAK58560、 ΥΡ_001217666、YP_002151351、ΥΡ_001250079、AAA99807、CAL35450、AAN74969 和 BAC44986。 來自這些及其他菌種的鞭毛蛋白序列被在此使用的術(shù)語鞭毛蛋白所包括。因此，菌種之間的序列差異包括在該術(shù)語的含義中。
術(shù)語“鞭毛蛋白多肽”是用來指保留結(jié)合并激活TLR5的能力的鞭毛蛋白或其片段。典型地，根據(jù)本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽包含涉及TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)域。術(shù)語“鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)域”包括天然存在的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)域和其功能保守的變體?！肮δ鼙Ｊ氐淖凅w”是其中在蛋白或酶中指定的氨基酸殘基在不改變該多肽的整個構(gòu)象和功能的情況下就已經(jīng)發(fā)生變化的那些變體，包括但不限于，用具有類似性質(zhì)(例如，極性、氫結(jié)合電位、 酸性、堿性、疏水性、芳香性等)的氨基酸置換氨基酸。在蛋白中，除指定為保守的那些氨基酸以外的氨基酸可以不同，因此任意兩個類似功能的蛋白之間的蛋白或氨基酸序列相似性百分比可以不同，可以是例如70%至99%，其根據(jù)校準(zhǔn)方案例如通過聚類方法測定，其中相似性基于MEGALIGN算法?！肮δ鼙Ｊ氐淖凅w”還包括具有通過BLAST或FASTA算法測定的至少60%氨基酸一致性的多肽，優(yōu)選至少75%，最優(yōu)選至少85%，并且甚至更優(yōu)選至少90%，且所述多肽具有與和其比較的天然蛋白或母蛋白相同或基本上類似的性質(zhì)或功能。涉及TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)域是本領(lǐng)域公知的，參見例如Smith等(2003) Nat.1mmunol. 4 :1247-1253(例如，鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白或其同源物或修飾形式的氨基酸 78-129、135-173 和 394-444)。
鞭毛蛋白多肽的實例包括但不限于，美國專利第6，585，980 ;6，130，082 ；5，888，810 ;5，618，533 ;和 4，886，748 號;美國專利公開號 US 2003/0044429A1 ;以及國際專利申請公開WO 2008097016和WO 2009156405所描述的那些，其通過引用的方式引入。
示例性的大腸桿菌O 157 :H7鞭毛蛋白是SEQD ID NO :1。示例性的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白是 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO :3。與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 3具有至少約90%，至少約95%，至少約97%，至少約98%或至少約99% —致性的氨基酸序列可被用作根據(jù)本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽。
在另一特定實施方式中，本發(fā)明包括使用國際專利申請W02009156405中描述的鞭毛蛋白重組蛋白，其全部內(nèi)容通過引用的方式引入。因此，本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽可以包含a)具有與該氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的N-末端肽，所述氨基酸序列始于位于SEQ ID NO 3的位置I的氨基酸殘基，并終止于選自位于SEQ ID NO 3的位置99至173 的任一個氨基酸殘基的氨基酸殘基；和b)具有與該氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的 C-末端肽，所述氨基酸序列始于選自位于SEQ ID NO 3的位置401至406的任一個氨基酸殘基的氨基酸殘基，并終止于位于SEQ ID NO :3的位置494的氨基酸殘基，其中所述N-末端肽直接連接到所述C-末端肽，或所述N-末端肽與所述C-末端肽通過間隔鏈一個與另一個間接連接。在另一特定實施方式中，所述N-末端肽·選自SEQ IDNO 3的氨基酸序列1_99、 1-137、1-160和1-173。在另一實施方式中，所述C-末端肽選自SEQ ID NO :3的氨基酸序列401-494和406-494。在另一實施方式中，所述N-末端和C-末端肽分別由SEQID NO 3 的氨基酸序列1-173和401-494組成。在另一實施方式中，所述N-末端和C-末端肽分別由SEQ ID NO 3的氨基酸序列1-160和406-494組成。在另一實施方式中，所述N-末端和C-末端肽分別由SEQ ID NO 3的氨基酸序列1_137和406-494組成。在另一實施方式中，所述N-末端肽和所述C-末端肽通過由NH2-GIy-AIa-AIa-GIy-C00H(SEQ ID NO 4)肽序列組成的中間間隔鏈一個與另一個間接連接。在另一實施方式中，位于SEQ IDNO 3的位置488的天冬酰胺氨基酸殘基被絲氨酸取代。在另一實施方式中，如上描述的鞭毛蛋白多肽包含在N-末端的額外的蛋氨酸殘基。
根據(jù)本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽可以通過已轉(zhuǎn)染核酸的重組細(xì)胞重組生成，所述核酸編碼該鞭毛蛋白多肽的氨基酸序列，并能使其在該轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有效生成。
編碼本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽的核酸序列可以被插入到用于克隆(DNA擴增)或用于表達的可復(fù)制載體中。各種載體可公開地獲得。例如，該載體可以是質(zhì)粒、粘粒、病毒顆?；蚴删w的形式。合適的核酸序列可以通過各種方法插入到該載體中。通常，利用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入到合適的限制性內(nèi)切酶位點。
載體組分通常包括，但不限于，一條或多條信號序列(如果該序列是待分泌的)、 復(fù)制起點、一個或多個標(biāo)志基因、增強子元件、啟動子以及轉(zhuǎn)錄終止序列。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)化連接技術(shù)構(gòu)建包含一種或多種這些組分的適合載體。
本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽不但可直接重組生成，而且可用異源多肽來生成融合多肽，其可以是信號序列或在成熟蛋白質(zhì)或肽的N-末端具有特異性切割位點的其它多肽。通常，該信號序列可以是該載體的組分，或其可以是編碼被插入到該載體中的目標(biāo)多肽的DNA 的一部分。該信號序列可以是選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、IPP或熱穩(wěn)定的腸毒素Il前導(dǎo)的原核信號序列。用于酵母分泌的信號序列可以是，例如，酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)、α因子前導(dǎo) (包括糖酵母屬和克魯維酵母屬α因子前導(dǎo)，后者在美國專利第5，010，182號中描述)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)、白色假絲酵母葡糖淀粉酶前導(dǎo)、或WO 90/13646中描述的信號。在哺乳動物細(xì)胞表達中，哺乳動物信號序列可用來直接分泌蛋白質(zhì)，例如來自相同或相關(guān)物種的分泌多肽，以及病毒分泌前導(dǎo)的信號序列。
表達和克隆載體均包含能啟動該載體在一個或多個選擇的寄主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。對于各種細(xì)菌、酵母和病毒，這種序列是大家熟知的。來自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點適合于大部分革蘭氏陰性細(xì)菌，2. mu.質(zhì)粒起點適合于酵母，各種病毒(SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)起點適用于在哺乳動物細(xì)胞中克隆載體。
表達和克隆載體將典型地包含選擇基因，也稱為可選擇的標(biāo)記。典型的選擇基因編碼蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其它毒素例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素的耐藥性，(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺失，或(C)供給不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)，例如編碼用于芽胞桿菌屬的D-丙氨酸消旋酶的基因。
適合用于哺乳動物細(xì)胞的可選擇的標(biāo)記的實例是能識別有能力接受編碼本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的核酸的細(xì)胞的那些，例如DHFR或胸苷激酶。當(dāng)使用野生型DHFR時，合適的寄主細(xì)胞是缺乏DHFR活性的CHO細(xì)胞系，其制備和增殖如Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 77 =4216(1980)所描述的那樣。適合在酵母中使用的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒 YRp7 中的 trp I 基因。Stinchcomb 等，Nature, 282 :39(1979) ；Kingsman 等，Gene, 7 141(1979) ；Tschemper et al, Gene, 10 :157 (1980)。該 trp I 基因為在色氛酸中缺乏生長能力的酵母突變株提供篩選標(biāo)記，例如，ATCC No. 44076或PEP4-1. Jones, Genetics, 85 12(1977)。
表達和克隆載體通常包含啟動子，所述啟動子可操作連接編碼該鞭毛蛋白多肽的核酸序列以控制mRNA的合成。通過各種潛在寄主細(xì)胞識別的啟動子是眾所周知的。適合與原核寄主一起使用的啟動子包括β_內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子體系(Chang等，Nature, 275 615(1978) ；Goeddel 等，Nature, 281 :544 (1979)),堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子體系 (Goeddel，Nucleic Acids Res. ,8 :4057(1980) ；EP 36，776)，和雜合啟動子例如 tac 啟動子(deBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA，80 :21-25 (1983))。在細(xì)菌體系中使用的啟動子也將包含可操作連接到編碼本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的DNA的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。
與酵母寄主一起使用的適合的促進序列的實例包括用于3-磷酸甘油酸酯激酶的啟動子(Hitzeman等，J. Biol. Chem.，255 :2073 (1980))，或用于其它糖解酶的啟動子(Hess 等，J. Adv. Enzyme Reg. ,7 :149(1968) ；Holland, Biochemistry, 17 :4900 (1978)),所述其它糖解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。
其它酵母啟動子是具有通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)勢的誘導(dǎo)型啟動子，是用于乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。用于酵母表達的適合載體和啟動子進一步描述于EP 73，657。來自哺乳動物寄主細(xì)胞的載體的目標(biāo)核酸轉(zhuǎn)錄例如由從病毒基因組中獲得的啟動子來控制，所述病毒例如多形瘤病毒、禽痘病毒(在1989年7 月5日公開的UK2, 211，504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和猿猴病毒40(SV40);由異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子控制；以及由熱激啟動子控制，只要這種啟動子適合于該寄主細(xì)胞體系。
可以通過將增強子序列插入該載體來增加通過高級真核生物的編碼本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄。增強子是DNA的順式作用元件，通常約10到300bp，其作用于啟動子以增加它的轉(zhuǎn)錄。許多增強子序列目前已知來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、 白蛋白、α-胎蛋白以及胰島素)。然而，典型地，將使用一個來自真核細(xì)胞病毒的增強子。 實例包括在該復(fù)制起點(bpl00-270)的最近側(cè)面上的SV40增強子、巨細(xì)胞病毒早期啟動子的增強子、在該復(fù)制起點的最近側(cè)面上的多形瘤增強子和腺病毒增強子。所述增強子可以在編碼目標(biāo)多肽的序列的位置5'或3'上拼接到該載體上，但是優(yōu)選位于該啟動子的位點5'。
用于真核生物寄主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細(xì)胞有機體的有核細(xì)胞)的表達載體也將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。這種序列通?？梢詮恼婧松锘虿《镜腄NA或cDNA的5'非翻譯區(qū)和有時候3'非翻譯區(qū)中獲得。這些區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄為編碼本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的mRNA的非翻譯部分中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。
此外，在重組脊椎動物細(xì)胞培養(yǎng)中適合于適應(yīng)本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的合成的其它方法、載體和寄主細(xì)胞在 Gething 等,Nature, 293 :620-625(1981) ;Mantei 等，Nature, 281 40-46(1979) ；EP 117，060 和 EP 117，058 中描述。
寄主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化。用在此描述的表達或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞，以生成鞭毛蛋白多肽，并在視情況而定修飾的常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴增編碼期望序列的基因。
本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要過度實驗就能選擇培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)基、溫度、pH 等。通常，最大化細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)能力的原理、方案和實用技術(shù)可在Ma_alian Cell Biotechnology A PracticalApproach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)中找到。
轉(zhuǎn)染方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，例如CaP04處理和電穿孔。取決于使用的寄主細(xì)胞，使用適合于這種細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行轉(zhuǎn)化。如上述Samtoook等所描述， 使用氯化鈣的鈣處理或電穿孔通常用于原核生物或包含真正細(xì)胞壁屏障的其它細(xì)胞。對于沒有這種細(xì)胞壁的哺乳動物細(xì)胞，可以使用Graham and van der Eb, Virology, 52 456-457(1978)的磷酸鈣沉淀法。哺乳動物細(xì)胞寄主體系轉(zhuǎn)化的一般特性在美國專利第 4，399，216號中描述。轉(zhuǎn)化為酵母典型地根據(jù)Van Solingen等，J. Bact, 130 =946(1977) 和 Hsiao 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. (USA)，76 :3829 (1979)的方法來進行。然而，也可以使用將DNA引入細(xì)胞的其它方法，例如通過核顯微注射、電穿孔、細(xì)菌原生質(zhì)體與完整細(xì)胞融合、或聚陽離子例如聚凝胺或聚鳥氨酸。關(guān)于轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的各種技術(shù)參見Keown等， Methods in Enzymology, 185 :527-537 (1990)和 Mansour 等，Nature, 336 :348-352 (1988)。
在這里，用于在該載體中克隆或表達DNA的適合寄主細(xì)胞包括原核生物、酵母、或高級真核生物細(xì)胞。
適合的原核生物包括，但不限于，真細(xì)菌諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如，腸桿菌科諸如大腸桿菌。各種大腸桿菌菌株是可公開獲得的，例如大腸桿菌K12菌株 MM294(ATCC31, 446);大腸桿菌 X1776 (ATCC 31,537);大腸桿菌菌株 W3110 (ATCC 27,325)；和K5772(ATCC 53，635)。其它適合的原核寄主細(xì)胞包括腸桿菌科諸如，埃希桿菌屬例如大腸桿菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏桿菌屬、變形桿菌屬；沙門氏菌屬例如鼠傷寒沙門氏菌；沙雷氏菌屬例如粘質(zhì)沙雷氏菌；志賀氏菌屬；以及芽胞桿菌屬例如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如，在1989年4月12日公開的DD 266，710中公開的地衣芽孢桿菌41P)； 假單胞菌屬例如綠膿桿菌和鏈霉菌屬。這些實例是說明性的而不是限制性的。
鼠傷寒沙門氏菌(fliC fljB)的菌株SIN41用于生產(chǎn)本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽是特別有意思的，因為這些原核寄主細(xì)胞不分泌任何鞭毛蛋白(Proc Natl Acad Sci U SA.2001 ；98 =13722-7)。然而，鞭毛蛋白是通過專門的分泌體系——所謂的“III型分泌體系”分泌的。有趣地是，菌株SIN41產(chǎn)生最佳鞭毛蛋白分泌所需要的III型分泌體系的所有組分。根據(jù)fliC啟動子編碼新鞭毛蛋白肽的克隆序列能實現(xiàn)在菌株SIN41中分泌大量目標(biāo)鞭毛蛋白多肽。
菌株W3110也是有趣的，因為它是用于重組DNA產(chǎn)物發(fā)酵的常見寄主菌株。優(yōu)選地，該寄主細(xì)胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修飾菌株W3110以在編碼寄主內(nèi)源性蛋白質(zhì)的基因中引起遺傳突變，這種寄主的實例公開在發(fā)布于1990年8月7日的美國專利第4，946，783號中，包括具有完全基因型tonA的大腸桿菌W3110菌株1A2 ;具有完全基因型tonA ptr3的大腸桿菌W3110菌株9E4 ;具有完全基因型tonA ptr3 phoA E15(argF-lac) 169 degPompT kan. sup. r 的大腸桿菌 W3110 菌株 27C7 (ATCC 55,244);具有完全基因型 tona ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169degP ompT rbs7ilvG kan. sup. r 的大腸桿菌W3110菌株37D6 ;大腸桿菌W3110菌株40B4，其是具有非卡那霉素耐藥性degP缺失突變的菌株37D6 ;和具有突變體周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌株。大腸桿菌菌株MG1655、MG1655 AfimA-H或MKS12、fliD-和-f/m > A-/-/-缺失的MG1655菌株也是生產(chǎn)重組鞭毛蛋白作為分泌蛋白質(zhì)的重要候選者(Nat Biotechnol. 2005 ； (4) :475-81)?；蛘?，體外克隆法例如 PCR或其它核酸聚合酶反應(yīng)，是適合的。
除原核生物之外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母也是用作編碼根據(jù)本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的載體的適合克隆或表達寄主。釀酒酵母是常用的低級真核寄主微生物。
其它包括粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe,Beachand Nurse,Nature, 290 140[1981];公開在1985年5月2日的EP139，383);克魯維酵母屬寄主(美國專利第 4，943，529 號；Fleer 等，Bio/Technology, 9 :968-975 (1991))例如乳酸克魯維酵母(K. lactis, MW98-8C, CBS683, CBS4574 ；Louvencourt 等，J.Bacterid.，737[1983])， 脆壁克魯維酵母(K. fragilis, ATCC 12，424),保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus, ATCC 16，045)，威克克魯維酵母(K. wickeramii, ATCC 24，178)，克魯雄酵母(K. waltii, ATCC56, 500)，果妮克魯維酵母(K. drosophilarum, ATCC 36, 906 ;Vanden Berg 等，Bio/ Technology, 8 :135 (1990))，耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans)和馬克斯克魯維酵母(K. marxianus);亞羅酵母屬(yarrowia, EP 402,226);巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris, EP 183, 070 ；Sreekrishna 等，J.Basic Microbiol. ,28 :265-278[1988])； 假絲酵母屬；里氏木霉(Trichoderma reesia, EP 244,234);粗糖鏈抱菌(Neurospora crassa, Case 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 76 :5259-5263 [1979]);許旺酵母屬例如許旺酵母(Schwanniomycesoccidenta lis,公開于 1990 年 10 月 31 日的 EP 394,538);和絲狀真菌例如脈孢菌、青霉菌、彎頸霉屬(公開在1991年I月10日的WO 91/00357)，和曲霉屬寄主例如構(gòu)巢曲霉(A. nidulans, ballance 等,Biochem. Biophys. Res. Commun., 112 =284-289[1983] ；Tilburn 等，Gene，26 :205-221 [1983] ；Yelton 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA,81 :1470_1474[1984])和黑曲霉(A. niger, Kelly and Hynes, EMBOJ.，4 475_479[1985])。在這里，甲醇酵母(Methylotropic yeasts)是適合的，其包括但不限于，能夠在甲醇上培養(yǎng)的酵母，所述酵母選自漢遜酵母屬、假絲酵母屬、克勒克酵母屬、畢赤氏酵母屬、糖酵母屬、球擬酵母屬和紅酵母屬組成的屬。用于編碼本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的核酸表達的適合寄主細(xì)胞來源于多細(xì)胞有機體。無脊椎動物細(xì)胞的實例包括昆蟲細(xì)胞例如果蠅S2和夜蛾屬Sf9，以及植物細(xì)胞。有用的哺乳動物寄主細(xì)胞系的實例包括中國倉鼠卵巢(CHO)和COS細(xì)胞。更具體的實例包括通過SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651);人胚胎腎臟系(在懸浮液培養(yǎng)物中生長的亞克隆293或293細(xì)胞，Graham等， J. Gen. Virol. ,36 :59(1977));中國倉鼠卵巢細(xì)胞/_DHFR(CH0，Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 77 :4216 (1980));小鼠支持細(xì)胞(TM4, Mather, Biol. Reprod.，23 243-251(1980));人肺細(xì)胞(ff138,ATCC CCL75);人肝細(xì)胞(Hep G2，HB 8065);小鼠乳房腫瘤(MMT 060562, ATCC CCL51)。合適寄主細(xì)胞的選擇被認(rèn)為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的掌握范圍內(nèi)。
本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽可以從培養(yǎng)基或寄主細(xì)胞溶解產(chǎn)物回收。如果是膜結(jié)合的，它可以利用適合的洗滌劑溶液(例如，TRIT0N-XTM. 100)或通過酶裂解從該膜中釋放出來。
可以通過各種物理或化學(xué)方法例如凍融循環(huán)、超聲處理、機械破壞或細(xì)胞溶解劑， 破壞用于編碼本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的核酸表達中所使用的細(xì)胞。從重組細(xì)胞蛋白質(zhì)或多肽中純化目標(biāo)多肽是所期望的。以下方法是示例性的適合的純化方法通過在離子交換柱上的分餾；乙醇沉淀法；反相HPLC ;在二氧化硅上或在陽離子交換樹脂例如DEAE上的色譜法；層析聚焦；SDS-PAGE ;硫酸銨沉淀法；利用例如Sephadex G-75的凝膠過濾法；蛋白質(zhì)A 瓊脂糖凝膠柱以去除污染物例如IgG ;和金屬螯合層析柱以結(jié)合本發(fā)明鞭毛蛋白多肽的表位標(biāo)記形式。
可以使用各種蛋白質(zhì)純化方法，這種方法是本領(lǐng)域已知的，例如在D eut s cher， Methods in Enzymology,182(1990) ;Scopes, ProteinPurification !Principles and Practice (Springer-Verlag New York, 1982)中描述。該選擇的純化步驟將取決于，例如， 使用的生產(chǎn)工藝的性質(zhì)和生成的特定鞭毛蛋白多肽。
在一個優(yōu)選實施方式中，該鞭毛蛋白多肽由重組鼠傷寒沙門菌SIN41(fliC fljB)的上清液純化，如 Nempont 等(Nempont, C. C. , D. ；Rumbo, M. ；Bompard, C.； Villeret, V. ；Sirard, J. C. 2008. Deletionof flagellin ' s hypervariable region abrogates antibody-mediatedneutralization and systemic activation of TLR5_dependent immunity. JTmmunoI 181:2036-2043.)中所公開的。具體地，沙門氏菌屬在Luria-Bertani (LB)肉湯中在37°C和攪拌下培養(yǎng)6_18小時。過濾該上清液，用60%硫酸銨(Sigma Aldrich, USA)飽和。通過離心、在20mM的pH為7. 5 的Tris/HCl中溶解來回收該沉淀物，然后透析。該蛋白質(zhì)通過羥磷灰石、陰離子交換和尺寸排阻色譜法(Bio-Rad Laboratories, USA ；GE Healthcare, Sweden)的依次循環(huán)進一步純化。最后，利用多粘菌素B柱(Pierce,USA)的脂多糖(LPS)耗盡該蛋白質(zhì)。利用Limulus試驗(Associates ofCape CodInc.，USA)，測得該殘留LPS濃度小于30pg LPS每微克重組鞭毛蛋白。
在另一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽可以通過在免疫親和層析基質(zhì)上的分離來純化。
所述免疫親和層析基質(zhì)包含已經(jīng)固定在其上的抗鞭毛蛋白抗體。使用“抗鞭毛蛋白”抗體，其在這里意味著結(jié)合天然鞭毛蛋白或結(jié)合去除高變區(qū)的鞭毛蛋白的抗體，包括本發(fā)明所包含的那些。
優(yōu)選地，該抗鞭毛蛋白抗體由單克隆抗體組成，包括小鼠抗鞭毛蛋白抗體。
在某些實施方式中，本發(fā)明的多肽可以通過化學(xué)肽合成的常規(guī)方法來合成。
例如，本發(fā)明的鞭毛蛋白多肽序列可以通過使用固相技術(shù)的直接肽合成來生成。
體外蛋白質(zhì)合成可以使用人工技術(shù)或通過自動化來進行。例如，自動化合成可以采用應(yīng)用生物系統(tǒng)的肽合成儀(AppliedBiosystems Peptide Synthesizer) (Foster City, Calif.)根據(jù)廠家的說明書來實現(xiàn)。
目標(biāo)多肽的各個部分可以單獨以化學(xué)方法合成，再結(jié)合利用化學(xué)方法或酶法以生成目標(biāo)全長肽。
本發(fā)明還涉及用于治療呼吸道感染的方法、包含根據(jù)本發(fā)明的TLR5激動劑的藥物組合物。
通常，根據(jù)本發(fā)明的TLR5激動劑可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑，和任選的緩釋基質(zhì)例如可生物降解的聚合物相混合，以形成治療組合物?！八帉W(xué)上”或“藥學(xué)上可接受的”是指當(dāng)施用于哺乳動物特別是人時，不產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)的分子實體和組合物。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑是指無毒的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、膠囊材料或任何類型的制劑輔劑。
本發(fā)明的藥物組合物配制成與其預(yù)定給藥途徑兼容。給藥途徑的實例包括，但不限于，胃腸外例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口服、鼻內(nèi)(例如吸入)、透皮(例如局部)、跨黏膜和直腸給藥。在一個具體實施方式
中，根據(jù)常規(guī)程序，將該組合物配制成適合于靜脈內(nèi)、皮下、 肌內(nèi)、口服、鼻內(nèi)的或局部給藥于人的藥物組合物。通常，用于靜脈內(nèi)給藥的組合物是無菌等滲水緩沖液形式的溶液。必要時，該組合物還可以包括增溶劑和在注射位點緩解疼痛的局部麻醉劑。
優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物是局部施用的(即在受試者的呼吸道中)。因此， 該組合物可以配制成膏劑、乳膏劑、透皮貼劑、洗劑、凝膠、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳劑的形式，或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其它形式。對于不可噴霧的局部劑型，一般使用包含載體或一種或多種賦形劑的粘性至半固體或固體形式，所述賦形劑與局部施用兼容，并且具有優(yōu)選大于水的動力粘度。適合的制劑包括，但不限于，溶液、懸浮液、乳劑、乳膏劑、膏劑、粉劑、 擦劑、油膏劑等，如果需要，所述制劑是無菌的或與影響不同性質(zhì)例如滲透壓力的助劑(例如，防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、緩沖劑或鹽)混合。其它適合的局部劑型包括可噴射氣霧劑制劑，其中將活性成分(優(yōu)選與固體或液體惰性載體混合)封裝在含有加壓揮發(fā)物(例如，氣體推進劑如氟利昂)的混合物中，或封裝在壓擠瓶中。如果需要，保濕劑或濕潤劑也可以加入到藥物組合物和劑型中。這種其他成分的實例是本領(lǐng)域熟知的。
如果本發(fā)明的方法包括組合物的鼻內(nèi)給藥，該組合物可以配制成氣霧劑形式、噴霧劑、霧劑或滴劑形式。特別是，根據(jù)本發(fā)明使用的 預(yù)防劑或治療劑可使用適合的推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適合氣體)，方便地以加壓包裝或噴霧器呈現(xiàn)的氣霧噴霧形式遞送。在加壓氣霧劑的情況下，可以通過提供閥門來遞送計量的量來確定劑量單位。用在吸入器或吹藥器中的膠囊和盒劑(由例如明膠組成的)可以配制成包含該化合物和合適粉狀基質(zhì)例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本發(fā)明的方法可以包含用霧化劑配制的肺給藥組合物，例如，通過利用吸入器或噴霧器。參見，例如，美國專利號 6，019，968,5, 985，320,5, 985，309,5, 934，272,5, 874，064、 5, 855, 913,5, 290, 540 和 4,880,078;以及 PCT 公開 WO 92/19244、WO 97/32572、 W097/44013、WO 98/31346和WO 99/66903 ;其每個以它們整體通過引用的方式合并于此。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的藥物組合物使用Alkermes AIR 肺藥物遞送技術(shù) (Alkermes, Inc. , Cambridge, Mass.)施用。
因此，本發(fā)明提供預(yù)防、治療、控制或改善呼吸道感染或一種或多種其癥狀的方法，其包括向有需要的受試者施用治療有效量的TLR5激動劑。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語待治療的“受試者”或“個體”是用來指患有或可能患有癌癥的人或非人哺乳動物(例如嚙齒動物(小鼠、大鼠)、貓、犬、或靈長類動物)。優(yōu)選地，所述受試者是人。
術(shù)語“治療有效量”是指在可適用于任何治療的合理利益/風(fēng)險比的情況下，足以治療癌癥的多肽或核酸的量。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽和藥物組合物在合理醫(yī)療診斷范圍內(nèi)的每日總用量將由主治醫(yī)師決定。對于任一特定受試者的具體治療有效劑量水平將取決于許多因素，包括待治療的病癥和該病癥的嚴(yán)重程度；使用的多肽的活性；使用的具體組合物，受試者的年齡、體重、總體健康狀況、性別和飲食；給藥時間，給藥途徑，治療的持續(xù)時間；與所使用的具體多肽聯(lián)合使用或同時使用的藥物；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素。
將通過以下附圖和實施例進一步闡明本發(fā)明。然而，這些實施例和附圖不應(yīng)該解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。


圖1 :鞭毛蛋白保護BALB/c小鼠抵抗肺炎鏈球菌的致命性呼吸性攻擊只使用在鹽水中的4X IO5CFU的肺炎鏈球菌(Sp)血清型1(黑色方塊)，或補充有Iyg鞭毛蛋白 (FliC，黑色圓)或補充有Iyg胰蛋白酶消化的鞭毛蛋白(FliC/T，開圓)鼻內(nèi)感染BALB/c 小鼠(η = 8)。(A)每天監(jiān)測小鼠存活率。與鹽水組或FliC/T處理組相比，F(xiàn)liC處理組的存活率是統(tǒng)計上顯著的。結(jié)果是從3個實驗中選出的I個代表。(B)攻擊24h之后處死小鼠， 并在肺中測定菌落形成單位(CFU)的數(shù)目。用星號標(biāo)注組之間的顯著差異；P < 0.05(*)。 結(jié)果是從3個實驗中選出的I個代表。誤差線表示平均值土平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。
圖2:抵抗肺炎鏈球菌感染的鞭毛蛋白介導(dǎo)的保護需要TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)只使用在鹽水中的4X IO5CFU的肺炎鏈球菌(Sp)血清型I (黑色方塊)，或補充有Iyg FliC Δ 174-400 (黑色圓)，或補充有I μ g缺少TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基序的FliQ174-400/89-96* (開圓)鼻內(nèi)感染BALB/c小鼠(η = 8)。每天記錄小鼠存活率。與未處理組或FliC,174-400/89-96*處理組相比，F(xiàn)liCA 174-400處理組的存活率是統(tǒng)計上顯著的(P < O. 05)。結(jié)果是從2個實驗中選出的I個代表。實施例
材料&方法
細(xì)菌制備肺炎鏈球菌血清型I (臨床分離物E1586)是從烏拉圭(39)衛(wèi)生部國家參比實驗室中獲得的。工作儲液是如下制備的。將生長在血瓊脂平板上的肺炎鏈球菌新菌落接種到 ToddHewitt 酵母發(fā)酵液(THYB) (Sigma-Aldrich, St. Louis-MO, USA)中，在 37°C 下培養(yǎng)，直到該培養(yǎng)物達到O. 7-0. 9單位的0D6(l(lnm。將培養(yǎng)物在_80°C下儲存在THYB+甘油 12% (v/v)中達到3個月。對于小鼠感染，使工作儲液解凍，用無菌的生理鹽水溶液(鹽水)洗滌，并稀釋到合適的濃度。儲液中細(xì)菌的數(shù)量通過將連續(xù)稀釋物涂在血瓊脂平板上來確定。
蛋白質(zhì)如之前所描述制備來自鼠傷寒沙門菌SIN22或重組鞭毛蛋白(FliCM74_4QQ 和FliCM74_4TO/89_96J的天然鞭毛蛋白(FliC)。？1扣，174_4(|(|/89_96*攜帶阻止TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的氨基酸代替物(89-96)。所有蛋白質(zhì)均包含少量LPS (小于30pg LPS每μ g，采用鱟試驗測定)。在一些實驗中，胰蛋白酶水解的FliC(FliC/T)用作對照。在用于確保蛋白質(zhì)為主要單體之前，在65°C下加熱天然的FliC 5分鐘。除非具體說明，Iyg FliC、FliC/T、FliCM74_4(l(l 或FliC,174-400/89-96* 與所述肺炎鏈球菌懸浮液共同鼻內(nèi)施用。為了排除鞭毛蛋白對細(xì)菌生存能力的任何直接影響，在與相同濃度用于體內(nèi)試驗的鞭毛蛋白一起培養(yǎng)肺炎鏈球菌之前和之后測定活菌數(shù)。與對照情況相比，與鞭毛蛋白培養(yǎng)之后，在恢復(fù)細(xì)菌的數(shù)目上沒有顯著差巳
動物感染雌性BALB/c、C57BL/6J和遠系雜交NMRI品系(6_8周大)從國家部門獸醫(yī)實驗室(烏拉圭)或Janvier實驗室(法國)獲得。雌性SCID小鼠(C. B-17SCID)從 Institut Pasteur de Lille培育基地獲得。這些小鼠的特點在于缺少B和T淋巴細(xì)胞以及血內(nèi)無丙種球蛋白。在單個通風(fēng)籠中供養(yǎng)動物，并在垂直式生物安全操作臺(class II A2 ESCO, Pensylvania-USA)中處理動物使其感染。所有實驗符合目前國家和制度性規(guī)定和倫理準(zhǔn)則(CHEA-Universidad de la Repiiblica,Uruguay 和 #A59107_InstitutPasteur de Lille)。通過腹膜內(nèi)(1. p.)注射總體積200 μ I的2. 2mg氯胺酮(Richmond-Vet Pharma, Bs. As. -Argentina)和 O.1lmg 甲苯噻嗪(Portinco, Montevideo-Uruguay),或利用麻醉非重復(fù)呼吸系統(tǒng)(DRE-Compact 150, DRE Veterinary, Louisville-US)吸入異氟燒 (Belamont, SAS,France)來使小鼠麻醉。以20到50 μ I鹽水的方式，將細(xì)菌和鞭毛蛋白施用到小鼠的鼻孔上。每天記錄小鼠的存活率。
為了消耗粒性白細(xì)胞，在用肺炎鏈球菌(24)鼻內(nèi)攻擊之前24小時，腹膜內(nèi)施用 100 μ g的抗-Gr-1 (RB6-8C5)或同型對照(HB 152)。鞭毛蛋白鼻內(nèi)處理之后，在支氣管肺泡灌洗(BAL)中發(fā)現(xiàn)該抗-Grl注射消耗了 96. 8±1. 2%的PMN。
肺和脾中細(xì)菌接種量的測定鼻內(nèi)攻擊之后在選定時間點采集肺和脾，再用 UltraTurrax均質(zhì)器(IKA-Werke, Staufen-Germany)均質(zhì)化。通過將連續(xù)稀釋物涂在血瓊脂平板上來測定活菌數(shù)。
定量的RT-PCR (qRT-PCR):使用 UltraTurrax 均質(zhì)器在 Trizol 試劑(Invitrogen, California-USA)中使肺均質(zhì)化，然后在_80°C下儲存。按照廠家說明書進行RNA萃取。在 cDNA 合成之前，用 DNAse-1(Invitrogen)處理 IygS RNA,利用隨機引物(Invitrogen)和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)進行第一鏈互補DNA(cDNA)合成。根據(jù)以下方案，在 Rotor-Gene 6000 (Corbett, Sydney-Australia) 中利用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(Qiagen，Hilden-Germany)進行實時PCR :95°C下15分鐘，然后是40個95°C下 15秒和60°C下I分鐘的循環(huán)。以O(shè). 9μ M的最終濃度使用引物。使用β-肌動蛋白作為管家基因使目標(biāo)基因的表達標(biāo)準(zhǔn)化。與鹽水處理組相比，給出的結(jié)果表明mRNA水平成倍增加。
浸潤入氣道和肺的PMN的測定為了支氣管肺泡灌洗(BAL)，插入抽樣氣管，滴入Iml的PBS和ImM EDTA六次，通過輕輕吸取回收；重復(fù)該過程兩次。將細(xì)胞懸浮在 FACS-EDTA緩沖液(PBS，0. 1%疊氮化物，1%來自Sigma-Aldrich的牛血清白蛋白加上5mM EDTA)中。如上所述的膠原酶/脫氧核糖核酸酶處理(34)之后，分離肺細(xì)胞，再通過40 μ m 細(xì)胞過濾器過濾。在兩層的Percoll (Sigma-Aldrich)梯度中分離免疫細(xì)胞。簡言之，將細(xì)胞懸浮在35%等滲Percoll溶液中，小心地放置到70%等滲Percoll溶液上面，在2600g 和室溫下不減速離心30分鐘。清除主要對應(yīng)于上皮細(xì)胞的頂部細(xì)胞層，從最靠近70 % Percoll層的細(xì)胞層中回收免疫細(xì)胞。使用100 μ m細(xì)胞過濾器過濾細(xì)胞，洗滌，染色以進行 FACS 分析。通過 FSC-SSC 和陽性染色來自 BD Biosciences 或 BioLegend, California-USA 的 PE-或 Alexa Fluor 647-結(jié)合的抗 _Ly_6G(克隆 1A8)、PerCP_Cy5. 5-結(jié)合的抗-Ly-6C (克隆HKl. 4)或PE-結(jié)合的抗-CD Ilb (克隆M1/70)來識別中性粒細(xì)胞。用PFA 4% 固定之后，在帶有 CellQuest 3. 3 軟件(BD Biosciences)的 FACS CaliburCytometer 上進行流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)采集。
組織學(xué)分析在4%福爾馬林(Sigma-Aldrich)中固定肺24小時，然后嵌入石蠟油中。使用 Leica 切片機(Leica Microsystems, ffetzlar-Germany)在 5μηι 處將肺塊切片，粘附到硅烷化的載玻片上。用Nikon Eclipse 80i顯微鏡和Nikon DS-Ril數(shù)碼照相機分析蘇木精/伊紅染色的切片，通過實驗室成像使用NIS-Elements BR 3. O軟件處理。
統(tǒng)計分析進行對數(shù)秩(Mantel-Cox)檢驗來分析存活曲線。為了在兩組之間進行對比，進行Mann-Whitney檢驗。在所有情況下，P值< O. 05認(rèn)為是顯著的。用GraphPad Prism 程序(GraphPadSoftware, San Diego California USA)進行統(tǒng)計分析。
結(jié)果
鞭毛蛋白的鼻內(nèi)遞送保護小鼠抵抗肺炎鏈球菌的致命性攻擊我們首先測定了鼻內(nèi)(1. η.)施用時引起B(yǎng)ALB/c小鼠100%死亡率的肺炎鏈球菌的最小量。用增加劑量的肺炎鏈球菌血清型I的臨床分離物感染動物，并每天評價存活率。我們定義4X IO5CFU為在 72-120小時內(nèi)殺死全部動物的最小致死量(MLD)。
然后，通過比較肺炎鏈球菌鼻內(nèi)攻擊的小鼠的存活率與滴入鞭毛蛋白(FliC)和肺炎鏈球菌的小鼠的存活率來評價鞭毛蛋白控制肺炎球菌肺炎的能力。作為對照，還用肺炎鏈球菌和預(yù)先用胰蛋白酶水解的鞭毛蛋白(FliC/T)攻擊小鼠。如圖1A所示，F(xiàn)liC處理的小鼠具有75%的存活率，而未處理的或FliC/T處理的動物在攻擊之后的3到4天內(nèi)死亡。不同獨立實驗之間從75%到100%變化的鞭毛蛋白誘導(dǎo)該保護。與只接受肺炎鏈球菌的動物相比，鞭毛蛋白和肺炎鏈球菌的聯(lián)合施用導(dǎo)致在24小時內(nèi)肺內(nèi)細(xì)菌數(shù)減少了 80倍 (圖1B)。我們還評價了鞭毛蛋白在感染之前和之后施用時，是否能發(fā)揮抵抗肺炎球菌感染的保護應(yīng)答。肺炎球菌攻擊之前12至24小時鼻內(nèi)接受鞭毛蛋白的所有動物存活下來，而到第4天，所有對照小鼠都死亡。此外，當(dāng)攻擊之后24小時施用鞭毛蛋白時，也實現(xiàn)了 100% 保護。因此，鞭毛蛋白顯示出對肺炎球菌肺炎的預(yù)防和治療作用。
此外，評價了在C57BL/6和遠系雜交品系NMRI中鞭毛蛋白誘導(dǎo)保護的能力。發(fā)現(xiàn)對于這兩種品系，肺炎鏈球菌血清型I的MLD均是2 X IO6CFU,并用5倍MLD評價了鞭毛蛋白介導(dǎo)的保護。細(xì)菌攻擊之前12小時施用鞭毛蛋白在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)了 80%的保護；類似地，當(dāng)攻擊之前32-6小時施用鞭毛蛋白，在NMRI動物中實現(xiàn)了 100%的保護。當(dāng)在C57BL/6和NMRI品系中與肺炎鏈球菌聯(lián)合施用時，雖然程度較低(40% )，但是鞭毛蛋白仍具保護性。總而言之，這些結(jié)果表明鞭毛蛋白處理在不同的小鼠品系中是保護性的。
其次，我們研究了 TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對于由鞭毛蛋白處理引起的保護是否必需。為此，我們使用重組鞭毛蛋白FliCA174__和FliCA174_4QQ/89_9W(27)。FliCA174-.具有與天然鞭毛蛋白相同的促進黏膜TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，而FliC,174-400/89-96*攜帶阻止TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的突變。盡管接受FliCM74_4(l(l和肺炎鏈球菌的全部小鼠經(jīng)歷攻擊之后存活下來，但接受突變體FliC,174-400/89-96* 的小鼠中沒有一個存活下來(圖2)。這些結(jié)果強有力的表明保護需要TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
鞭毛蛋白處理促進促炎基因表達，并在肺炎球菌肺炎期間加劇了短暫的細(xì)胞浸潤入肺然后，我們分析鞭毛蛋白處理是否改變了肺對肺炎球菌感染的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。如前所述， 用肺炎鏈球菌或肺炎鏈球菌加上鞭毛蛋白攻擊小鼠。另一組只接受鞭毛蛋白作為對照。處理和感染二十四小時后，收集肺，通過qRT-PCR分析選擇基因的表達。與肺炎球菌攻擊相比較，單獨施用鞭毛蛋白或與肺炎鏈球菌聯(lián)合施用引起了 Cxcll、Cxcl2和Ccl20mRNA水平的急劇增加。鞭毛蛋白處理還增加了 Tnf的表達；雖然該差異是相容的，但其不是統(tǒng)計學(xué)顯著的。在受攻擊并用鞭毛蛋白處理的動物中116表達增加了，但是在只接受鞭毛蛋白或肺炎鏈球菌的那些動物中116表達并未增加，這表明鞭毛蛋白和肺炎球菌感染之間在116表達上具有協(xié)同效應(yīng)。與模擬動 物相比，在全部組中，TgfbU 1117a、I117f、1123和114基因的 mRNA水平保持不變。
為了評價促炎基因的表達是否與發(fā)炎和細(xì)胞浸潤入氣道有關(guān)，我們進行了鞭毛蛋白處理和感染后24小時獲得的肺組織的組織學(xué)分析。肺炎鏈球菌誘導(dǎo)局限于某些細(xì)支氣管和接近于這些細(xì)支氣管的血管周圍區(qū)域的中等細(xì)胞浸潤。相反地，鞭毛蛋白處理，單獨或與肺炎球菌一起，誘導(dǎo)水腫以及影響不僅血管周圍和支氣管周圍(peribroncheal)區(qū)域而且圍繞肺實質(zhì)的一些區(qū)域的細(xì)胞大量浸潤。值得注意地，在第7天，來自接受鞭毛蛋白和肺炎球菌的小鼠的肺顯示出炎癥的完全消退，沒有明顯的細(xì)胞浸潤或水腫。這些結(jié)果表明， 鞭毛蛋白誘導(dǎo)了強烈但短暫的促進細(xì)菌清除的炎癥反應(yīng)，不引起肺形態(tài)或功能的永久性改變。
鞭毛蛋白誘導(dǎo)的保護需要Gr-1表達細(xì)胞，但與B和T淋巴細(xì)胞無關(guān)中性粒細(xì)胞募集進入氣道是肺炎球菌感染和鼻鞭毛蛋白處理的標(biāo)志，在這里我們表明鞭毛蛋白處理和感染激活了涉及中性粒細(xì)胞募集的基因表達。因此，我們的目的在于，比較在用肺炎鏈球菌攻擊、或鞭毛蛋白處理或未用鞭毛蛋白處理的動物中的中性粒細(xì)胞浸潤的動力學(xué)。在攻擊后的不同時點收集BAL和肺，用抗-Ly6G抗體染色。肺炎球菌攻擊在所有動物中誘導(dǎo)PMN 的募集。然而，與只用肺炎鏈球菌攻擊的小鼠比較，在攻擊時用鞭毛蛋白處理的小鼠顯示出更快速和明顯的PMN浸潤入氣道。無論哪個組，在24小時時，PMN浸潤到達最高點，并且各組之間的差異最大。然而，到48小時，各組之間的PMN的數(shù)目已不再是明顯不同。因此，鞭毛蛋白與肺炎球菌的聯(lián)合施用引起大量的中性粒細(xì)胞快速且短暫的募集進入氣道。
隨后，我們確定中性粒細(xì)胞對于鞭毛蛋白介導(dǎo)的保護而言是否關(guān)鍵。為此目的，攻擊之前24小時將粒性白細(xì)胞受體-1 (Gr-1或Ly6G/Ly6C)特異性的單克隆抗體或同型對照抗體腹膜內(nèi)注入動物。接受同型對照并且用FliC處理的動物經(jīng)歷攻擊之后存活下來。與此相反，抗-Gr-1處理消耗了來自該氣道的>95%的中性粒細(xì)胞，取消了鞭毛蛋白介導(dǎo)的抵抗肺炎鏈球菌的保護。這些結(jié)果表明，Gr-1表達細(xì)胞如PMN，是肺炎球菌感染中鞭毛蛋白誘導(dǎo)的保護的關(guān)鍵效應(yīng)器。
由于在肺炎球菌感染的早期階段已經(jīng)涉及B和T淋巴細(xì)胞，我們評價它們在鞭毛蛋白誘導(dǎo)的保護中的作用。用2 X IO7CFU的肺炎鏈球菌或肺炎鏈球菌和鞭毛蛋白攻擊SCID 小鼠(抗體、B和T細(xì)胞缺失的)以及具有免疫能力的BALB/c小鼠。感染36小時之后收集肺和脾，測定細(xì)菌數(shù)。鞭毛蛋白聯(lián)合施用在SCID小鼠肺中促進細(xì)菌清除，達到與BALB/c 小鼠中類似的程度。此外，當(dāng)鞭毛蛋白處·理時，SCID和BALB/c小鼠都顯示出脾內(nèi)較低的細(xì)菌數(shù)，這意味著它們不僅能控制局部感染，而且能控制全身感染。與BALB/c小鼠相比，鞭毛蛋白滴注后16小時，SCID小鼠募集了類似數(shù)量的PMN進入肺和肺泡腔。總之，這些結(jié)果表明，Gr-1表達細(xì)胞引發(fā)鞭毛蛋白誘導(dǎo)的保護，既不需要B細(xì)胞,也不需要T淋巴細(xì)胞。
討論:
如根據(jù)預(yù)防肺炎鏈球菌對呼吸道早期定植的TLR以及MyD88要求所示，先天免疫性是控制肺炎球菌感染必不可少的(Albiger, B. , Sandgren A. , Katsuragi H., Meyer-Hoffert U. , Beiter K. , Wartha F. , Hornef M. , Normark S. and NormarkB.H. 2005. Myeloiddifferentiation factor 88-dependent signalling controls bacterial growth during colonization and systemic pneumococcal disease inmice. Cell Microbiol 7 1603-1615. ；Khan, A. Q. , Q. Chen, Z. -Q. ffu, J. C. Paton, and C. M. Snapper. 2005. Both innate immunity and type lhumoral immunity to Streptococcus pneumoniae are mediated byMyD88 but differ in their relative levels of dependence on Toll-LikeReceptor 2.1nfect. Tmmun. 73 :298-307.)。對氣道肺炎球菌感染的免疫應(yīng)答的特點在于，大量和快速的募集中性粒細(xì)胞進入肺，通過PMN吞噬性殺死肺炎球菌被認(rèn)為是主要的防衛(wèi)機理。盡管如此，肺炎鏈球菌可以通過抑制或延遲補體沉積和吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)來躲避寄主的先天防御。因此，在血清型特異性抗體產(chǎn)生和繞過增強調(diào)理吞噬的補體沉積抑制之前，中性粒細(xì)胞涌入在清除感染中經(jīng)常是無效的。 在該研究中，我們評價外源性施用不被肺炎鏈球菌天然接合的TLR激動劑，即TLR5激動劑鞭毛蛋白，是否能增強先天免疫性以控制急性呼吸性肺炎球菌感染。我們發(fā)現(xiàn)局部施用鞭毛蛋白通過增強局部和全身的細(xì)菌清除來提升用致死量的肺炎鏈球菌血清型I攻擊的小鼠的存活率。在BALB/c、C57BL/6和NMRI小鼠中感染建立之前、期間和之后進行鞭毛蛋白處理是有效的。
已經(jīng)證明體內(nèi)施用鞭毛蛋白上調(diào)了促炎細(xì)胞因子的表達。在這里，我們表明，在肺炎鏈球菌攻擊的時候，聯(lián)合施用鞭毛蛋白也上調(diào)了肺內(nèi)PMN特異性趨化因子/活化基因 CxclUCxcl2以及Tnf和Ccl20的表達，而僅僅肺炎鏈球菌不能充分誘導(dǎo)這些基因。與該趨化因子和細(xì)胞因子表達模式一致，肺組織切片的分析顯示在氣管周圍和血管周圍區(qū)域中大量的細(xì)胞浸潤，這在鞭毛蛋白處理動物的肺中比感染的未處理動物的肺中更加明顯。值得注意的是，雖然通過鞭毛蛋白誘導(dǎo)了明顯的炎癥反應(yīng)，但是到第7天，肺組織完全恢復(fù)了， 而未處理的動物死于感染。BAL樣品的分析表明，在肺炎球菌攻擊的時候施用TLR5激動劑， 誘導(dǎo)加速和更明顯的PMN募集。PMN浸潤是短暫的，在24小時到達最高點，在40小時退回到穩(wěn)定狀態(tài)。Gr-1表達細(xì)胞(很可能是PMN)的消耗取消了該保護，表明這些細(xì)胞是控制肺炎球菌肺感染所必需的。鞭毛蛋白介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的自我限制性質(zhì)是非常相關(guān)的發(fā)現(xiàn)，因為加劇的炎癥可能與肺屏障與功能的衰竭有關(guān)?？刂芓LR5反應(yīng)的分子機制不僅僅上調(diào)促炎基因，而且引發(fā)反應(yīng)終止。因此，鞭毛蛋白黏膜處理可以被認(rèn)為是針對肺炎球菌肺炎的療法，其增強了中性粒細(xì)胞的浸潤并同時增強了對炎癥的限制，值得在臨床試驗中進一步評估。
除PMN之外，還有若干研究已經(jīng)報道，T和B淋巴細(xì)胞以及天然抗體可能在肺炎球菌肺炎的早期控制中起重要作用。已表明，T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答早期積聚在支氣管周圍炎癥區(qū)域，并且T淋巴細(xì)胞與對抗肺炎球菌的防御有關(guān)，因為與它們的野生型對應(yīng)物相比， 缺乏CD4+T細(xì)胞的MHC II類缺失的小鼠對感染更敏感。已表明，CD19缺失的小鼠，其具有發(fā)育受阻的Bla細(xì)胞和自然抗體生產(chǎn)，對肺炎球菌感染的易感性增加。然而，在這里提供的結(jié)果表明，T和B細(xì)胞都不是鞭毛蛋白誘導(dǎo)的局部和全身的細(xì)菌清除所需要的。綜合起來， 我們的結(jié)果強有力的表明改變PMN動力學(xué)導(dǎo)致有效殺死肺炎球菌，即使在不存在B和T淋巴細(xì)胞的情況下。
我們的結(jié)果還表明，TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是鞭毛蛋白誘導(dǎo)的保護所需要的。在氣道中， TLR5通過肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達，表明這些常駐細(xì)胞可能是鞭毛蛋白處理時抵抗肺炎鏈球菌的保護性先天防御誘導(dǎo)中的關(guān)鍵角色。與此一致，近來研究表明，氣道上皮細(xì)胞是 TLR5激活的組織，其涉及響應(yīng)于鞭毛細(xì)菌的趨化因子生產(chǎn)和PMN募集。另一方面，鼠科中性粒細(xì)胞表達TLR5，因而TLR5信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也可以直接激活PMN并增強它們殺死肺炎鏈球菌的能力。通過類似方式，之前已證實，熱殺死的流感嗜血桿菌能夠以Nodl-相關(guān)的方式特異性增強PMN殺死肺炎球菌的能力。
預(yù)防和治療肺炎鏈球菌感染的當(dāng)前療法在預(yù)防或治愈肺炎球菌疾病上有限制，因而還需要免疫干預(yù)的新策略。一些報告已表明，細(xì)菌溶解產(chǎn)物和全部熱殺死的細(xì)菌的施用會刺激抵抗感染的保護性反應(yīng)。然而，在設(shè)計人用藥物時，這些制劑的不明確性質(zhì)通常是問題。我們的結(jié)果表明，單個和良好表征的分子特別是鞭毛蛋白的局部刺激足以增強肺先天免疫防御并控制肺炎球菌肺炎，突出了使用微生物相關(guān)分子模式作為基礎(chǔ)形成抗菌療法的益處。
參考文獻
貫穿本申請，各種參考文獻描述了本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的目前狀況。因此，這些參考文獻的公開內(nèi)容通過引用的方式結(jié)合到本說明書中。
權(quán)利要求
1.TLR5激動劑，其用于治療呼吸道感染的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的TLR5激動劑，其選自有機小分子、抗體、適體或多肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的TLR5激動劑，其是鞭毛蛋白多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的TLR5激動劑，其中所述鞭毛蛋白多肽是從細(xì)菌中分離出來的，所述細(xì)菌選自埃希桿菌屬例如大腸桿菌、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏桿菌屬、變形桿菌屬；沙門氏菌屬例如鼠傷寒沙門菌；沙雷氏菌屬例如粘質(zhì)沙雷氏菌、志賀氏菌屬；芽胞桿菌屬例如枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌；假單胞菌屬例如綠膿桿菌；和鏈霉菌屬。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4的TLR5激動劑，其中所述鞭毛蛋白多肽的所述氨基酸序列選自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3，或與 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2 或 SEQ IDNO 3具有至少約90 %，至少約95 %，至少約97 %，至少約98 %或至少約99 %一致性的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的TLR5激動劑，其中所述鞭毛蛋白多肽包含a)具有與該氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的N-末端肽，所述氨基酸序列始于位于SEQ ID NO 3的位置I的氨基酸殘基，并終止于選自位于SEQ ID NO 3的位置99至173的任一個氨基酸殘基的氨基酸殘基；和b)具有與該氨基酸序列至少90%氨基酸一致性的C-末端肽，所述氨基酸序列始于選自位于SEQ ID NO 3的位置401至406的任一個氨基酸殘基的氨基酸殘基，并終止于位于SEQ ID NO 3的位置494的氨基酸殘基，其中所述N-末端肽直接連接到所述C-末端肽，或所述N-末端肽與所述C-末端肽通過間隔鏈一個與另一個間接連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的TLR5激動劑，其中所述N-末端肽選自SEQIDNO 3的氨基酸序列 1-99、1-137、1-160 和 1-173。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的TLR5激動劑，其中所述C-末端肽選自SEQID NO 3的氨基酸序列 401-494 和 406-494。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項的TLR5激動劑，其中所述N-末端和C-末端肽分別由SEQID NO 3的氛基酸序列1-173和401-494組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項的TLR5激動劑，其中所述N-末端和C-末端肽分別由SEQID NO 3的氨基酸序列1-160和406-494組成。
11.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項的TLR5激動劑，其中所述N-末端和C-末端肽分別由SEQID NO 3的氨基酸序列1-137和406-494組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求6-11任一項的TLR5激動劑，其中所述N-末端肽和所述C-末端肽通過由NH2-GIy-AIa-AIa-GIy-COOH(SEQ IDNO 4)肽序列組成的中間間隔鏈一個與另一個間接連接。
13.根據(jù)權(quán)利要求6-12任一項的TLR5激動劑，其中所述位于SEQID NO 3的位置488的天冬酰胺氨基酸殘基被絲氨酸取代。
14.根據(jù)權(quán)利要求6-13任一項的TLR5激動劑，其中所述鞭毛蛋白多肽包含在N-末端的額外蛋氨酸殘基。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的TLR5激動劑，其中所述呼吸道感染選自病毒感染、細(xì)菌感染或真菌感染。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的TLR5激動劑，其中所述病毒感染由病毒引起，所述病毒選自逆轉(zhuǎn)錄病毒例如人嗜T淋巴細(xì)胞病毒(HTLV) I和II型和人免疫缺陷病毒(HIV)，皰疹病毒例如單純皰疹病毒(HSV) I和II型、Epstein-Barr病毒、HHV6-HHV8和巨細(xì)胞病毒，沙粒病毒例如拉沙熱病毒，副粘病毒例如麻疹病毒屬病毒、人呼吸道合胞病毒、流行性腮腺炎病毒、hMPV和肺炎病毒，腺病毒，布尼亞病毒例如漢坦病毒，冠狀病毒、絲狀病毒例如伊波拉病毒，黃病毒例如丙肝病毒(HCV)、黃熱病毒和日本腦炎病毒,肝炎病毒例如乙肝病毒(HBV),正粘病毒例如流感病毒A、B和C、PIV，乳多空病毒例如乳頭瘤病毒，細(xì)小核糖核酸病毒例如鼻病毒、腸道病毒和甲肝病毒，痘病毒，呼腸孤病毒例如輪狀病毒，囊膜病毒例如風(fēng)疫病毒，和棒狀病毒例如狂犬病病毒。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的TLR5激動劑，其中所述細(xì)菌感染由細(xì)菌引起，所述細(xì)菌選自水螺菌科，固氮螺菌科，固氮菌科，類桿菌科，巴爾通體種，蛭弧菌科，彎曲桿菌種，衣原體種例如衣原體肺炎鏈球菌，梭狀芽胞桿菌，腸桿菌科例如朽1檬酸細(xì)菌種、愛德華氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、歐文氏菌種、大腸桿菌、哈夫尼菌種、克雷伯氏桿菌種、摩根氏菌種、普通變形桿菌、普羅維登斯菌、沙門氏菌種、粘質(zhì)沙雷氏桿菌和弗累克斯i內(nèi)氏桿菌，Gardinella科,流感嗜血桿菌，鹽桿菌科，螺桿菌科，Legionallaceae科,李斯特菌種，甲基球菌科，分枝桿菌屬例如結(jié)核分枝桿菌，奈瑟氏球菌科，海洋螺菌科，巴斯德氏菌科，肺炎球菌種，假單胞菌種，根瘤菌科，螺旋菌科，無毛螺旋體科，葡萄球菌屬例如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和化膿性葡萄球菌，鏈球菌屬例如腸炎鏈球菌、糞鏈球菌和肺炎鏈球菌，Vampirovibr Helicobacter科，和編幅弧囷科。
18.根據(jù)權(quán)利要求17或18的TLR5激動劑，其中所述細(xì)菌感染由不具有鞭毛的細(xì)菌例如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、或肺炎支原體所引起。
19.根據(jù)權(quán)利要求17-19任一項的TLR5激動劑，其中所述細(xì)菌感染是肺炎球菌感染。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的TLR5激動劑，其中所述真菌感染由真菌引起，所述真菌選自犁頭霉種例如傘枝犁頭霉和分枝犁頭霉，曲霉種例如黃曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉和土曲霉，皮炎芽生菌，假絲酵母種例如白色假絲酵母、Candida glabrala、Candida kerr、克魯斯假絲酵母、近平滑假絲酵母、偽熱帶假絲酵母、CandidaquiIlermondi1、皺裙假絲酵母、類星形假絲酵母和熱帶假絲酵母，粗球孢子菌，耳霉種，新生隱球菌，小坎寧安霉種，莢膜組織胞漿菌，微小毛霉，巴西副球孢子菌，波氏假阿利什菌，肺炎肺囊蟲，根霉種例如少根根霉、米根霉和小孢根霉，糖酵母種，和申克孢子絲菌。
21.用于治療呼吸道感染的方法的藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項的TLR5激動劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的藥物組合物，其配制成與局部施用例如鼻內(nèi)施用或肺施用兼容。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的藥物組合物，其配制成氣霧劑形式、噴霧劑、霧劑或滴劑形式。
24.預(yù)防、治療、控制或改善呼吸道感染或一種或多種其癥狀的方法，其包含向有需要的患者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-14任一項的TLR5激動劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療呼吸道感染的方法和藥物組合物。更特別地，本發(fā)明涉及用于治療呼吸道感染的方法中的TLR5激動劑。
文檔編號A61P11/00GK103037887SQ201080067699
公開日2013年4月10日 申請日期2010年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月25日
發(fā)明者J-C·西拉德, J·A·沙巴瓜蒂 申請人:國家醫(yī)療保健研究所, 里爾巴斯德研究所