本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)綿羊肺炎支原體的引物和探針，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

綿羊肺炎支原體(mycoplasmaovipneumoniae,mo)是引起綿羊和山羊支原體性肺炎(mycoplasmapneumoniaofgoatsandsheep,mpgs)的主要病原。mpgs傳染性強(qiáng)，主要通過(guò)呼吸道感染，也可垂直傳播，病羊和耐過(guò)羊是該病的主要傳染源(賀英等,2009;萬(wàn)一元等,2000)。mpgs臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、咳嗽、喘氣、漸進(jìn)性消瘦、肺和胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥,病死率一般為30%～50%,有的高達(dá)80%(yangetal.,2014;rifatbegovicetal.,2011;dassnayakeetal.,2010;besseretal.,2008)。

當(dāng)前國(guó)外非洲、西班牙、意大利、美國(guó)、約旦，國(guó)內(nèi)四川、貴州、內(nèi)蒙古、青海、廣西、福建等地均有該病發(fā)生的報(bào)道。該病給養(yǎng)羊業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此，亟需建立一種綿羊肺炎支原體特異、敏感、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。

taqman熒光pcr是在普通pcr的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，使用熒光pcr檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)靶核苷酸序列的技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)前國(guó)內(nèi)雖有針對(duì)綿羊肺炎支原體檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，但是主要是針對(duì)16srrna設(shè)計(jì)的引物，并且只有染料法熒光定量pcr方法，尚未見(jiàn)有綿羊肺炎支原體taqman熒光定量pcr檢測(cè)方法。本發(fā)明的建立可以填補(bǔ)該領(lǐng)域的空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)綿羊肺炎支原體的引物和探針。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

用于檢測(cè)綿羊肺炎支原體的實(shí)時(shí)熒光定量pcr引物，引物的核苷酸序列為：上游引物：5’-cttcgggacttattggag-3’，下游引物：5’-gatgcaaactgatttacttg-3’。

用于檢測(cè)綿羊肺炎支原體的探針，序列為：5’-aagaccgattgtcaggccga-3’。

所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)（r）和熒光淬滅基團(tuán)（q）的寡核苷酸。

利用本發(fā)明的引物和探針可用于檢測(cè)綿羊肺炎支原體的p113基因，尤其適用于基于熒光定量pcr技術(shù)的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立一種可用于檢測(cè)綿羊肺炎支原體的熒光定量pcr方法。

具體操作方法如下：

1、引物設(shè)計(jì)：根據(jù)genbank上公布的綿羊肺炎支原體kr270152.1基因組序列，利用primer6.0軟件對(duì)p113基因序列進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)，探針合成同時(shí)進(jìn)行兩端熒光標(biāo)記，探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是fam，3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為eclipse。

2、反應(yīng)體系的優(yōu)化：優(yōu)化出的25μl最佳反應(yīng)體系為：premixextaq^tm（probeqpcr）12.5μl、上、下游引物（10μmol/l）各0.5μl、探針（5μmol/l）1μl、模板2μl、水8.5μl。最佳反應(yīng)條件為：95℃，30s預(yù)變性；95℃5s，55℃10s，72℃20s共45個(gè)循環(huán)。

3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備：通過(guò)pcr對(duì)綿羊肺炎支原體fj-cl01株的p113基因進(jìn)行擴(kuò)增。20μlpcr擴(kuò)增體系為：premixtaq^tmversion2.0plusdye10μl、上下游引物(10μmol/μl)各1μl、fj-cl株dna2μl、滅菌無(wú)離子水補(bǔ)至20μl。pcr程序：94℃2min；94℃30s、55℃15s、72℃15s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。用凝膠回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物并將目的片段連接到pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒做pcr及酶切鑒定，并送至寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。以經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以?xún)?yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

該方法可用于綿羊肺炎支原體的病原診斷和流行病學(xué)調(diào)查，為疾病的早期預(yù)防奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

有益效果

本發(fā)明根據(jù)genbank登錄的kr270152.1的p113基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，首此針對(duì)綿羊肺炎支原體p113基因建立taqman實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法，該方法靈敏度高，最低可檢測(cè)到10copies，特異性好、重復(fù)性好，可用于檢測(cè)臨床樣品中綿羊肺炎支原體的含量。

附圖說(shuō)明

圖1綿羊肺炎支原體實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法的擴(kuò)增曲線。

圖2為綿羊肺炎支原體的實(shí)時(shí)熒光定量pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1綿羊肺炎支原體的熒光定量pcr方法的建立

一、材料：

山羊支原體山羊肺炎亞種由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所儲(chǔ)岳峰饋贈(zèng)，大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌等由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室程龍飛研究員饋贈(zèng)；綿羊肺炎支原體fj-cl01株、絲狀支原體山羊亞種fj-gt株、萊氏無(wú)膽甾原體fj-np株、牛支原體fj-hj株、羊口瘡病毒fj-fz株為本室分離、鑒定、保存。

二、步驟

1、儀器與試劑：pmd19-t載體、sybrpremixextaqⅱ（2×）、dl2000marker均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；熒光定量pcr管購(gòu)自axygen（美國(guó)）公司；膠回收試劑盒購(gòu)自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自omegabio-tek（美國(guó)）公司；mastercyclereprealplex熒光定量pcr儀，eppendorf（德國(guó)）公司產(chǎn)品。

2.引物和探針的特異性

引物和探針的特異性是本實(shí)驗(yàn)所建立方法的最重要因素。根據(jù)genbank登錄的kr270152.1的p113基因序列，通過(guò)比對(duì)分析，設(shè)計(jì)引物和探針。

引物序列為：上游引物：5’-cttcgggacttattggag-3’，下游引物：5’-gatgcaaactgatttacttg-3’。

探針序列為：5’-aagaccgattgtcaggccga-3’。

3、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

通過(guò)pcr對(duì)綿羊肺炎支原體fj-cl01株的p113基因進(jìn)行擴(kuò)增。20μlpcr擴(kuò)增體系為：premixtaq^tmversion2.0plusdye10μl、上下游引物(10μmol/μl)各1μl、fj-cl株dna2μl、滅菌無(wú)離子水補(bǔ)至20μl。pcr程序：94℃2min；94℃30s、55℃15s、72℃15s，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。用凝膠回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物并將目的片段連接到pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞，抽提質(zhì)粒做pcr及酶切鑒定，并送至寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。以經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

4.反應(yīng)條件的優(yōu)化

采用25條件反應(yīng)體系premixextaq^tm（probeqpcr）12.5μl、上、下游引物（10μmol/l）各0.5μl、探針（5μmol/l）1μl，倍比稀釋后的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品2μl，補(bǔ)水至終體積25μl，以出現(xiàn)最高熒光值及最小的ct值為指標(biāo)，分別對(duì)退火溫度（51～60℃）、引物和探針濃度（5～10μmol/l）進(jìn)行優(yōu)化。

5、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

用easydilution將構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹copies/μl)作為模板，以?xún)?yōu)化的條件進(jìn)行擴(kuò)增，以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，以ct值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，熒光定量pcr方法對(duì)綿羊肺炎支原體的最低檢測(cè)限為10copies，且ct與拷貝數(shù)在1×10¹～1×10⁹拷貝/μl范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r²為0.999，擴(kuò)增效率為102%。擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。

6特異性檢測(cè)

6.1特異性檢測(cè)

用優(yōu)化的條件分別對(duì)綿羊肺炎支原體、山羊支原體山羊肺炎亞種、大腸桿菌、巴氏桿菌、金黃色葡萄球菌、副豬嗜血桿菌、萊氏無(wú)膽甾原體、牛支原體、絲狀支原體山羊亞種及羊口瘡病毒核酸樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)該方法的特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢測(cè)結(jié)果顯示，只有綿羊肺炎支原體核酸樣品為陽(yáng)性，其余核酸樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

6.2可重復(fù)性及再現(xiàn)性評(píng)估

對(duì)同一陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)重復(fù)管，用建立的實(shí)時(shí)熒光定量pcr進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其重復(fù)性，計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品置于-20℃保存，分別于第7、14、21d重檢，評(píng)價(jià)其再現(xiàn)性，計(jì)算其組間變異系數(shù)。計(jì)算得組內(nèi)變異系數(shù)為0.58%～1.29%，組間變異系數(shù)為0.19%～1.22%，可重復(fù)性好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專(zhuān)利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

sequencelisting

<110>福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所

<120>一種用于檢測(cè)綿羊肺炎支原體的引物和探針

<130>3

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

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cttcgggacttattggag18

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<213>人工序列

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gatgcaaactgatttacttg20

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