本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴨2型腺病毒株。
技術(shù)背景
腺病毒是家禽常見的傳染性病原體。禽腺病毒分為三個群：ⅰ群是從雞、火雞、鵝和鴨的呼吸道感染分離出來的禽腺病毒，有共同的群特異性抗原，可分為a、b、c、d、e5個種和12個血清型；ⅱ群包括火雞出血性腸炎病毒、雉大理石皮病病毒和雞大脾病病毒；ⅲ群是從雞產(chǎn)蛋綜合征和鴨分離到的腺病毒。鴨2型腺病毒屬于ⅰ群禽腺病毒，是1977年法國匈牙利人從患病番鴨上分離出來的，感染鴨主要表現(xiàn)精神沉郁，下痢，消瘦等癥狀。病毒一旦帶入鴨群很難清除，主要有傳播方式?jīng)Q定的，即水平傳播和垂直傳播，給飼養(yǎng)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
通過對ⅰ群鴨2型腺病毒的流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病在我國鴨群中發(fā)病率日益上升趨勢?；谀壳?，國內(nèi)外沒有預(yù)防該病的商品化滅活疫苗，該病還在不斷蔓延。研制安全有效的滅活疫苗迫在眉睫，必須通過創(chuàng)新技術(shù)克服這一問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種鴨2型腺病毒，并將其毒株制備成滅活疫苗，用于預(yù)防ⅰ群鴨2型腺病毒疾病，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明所提供的鴨2型腺病毒，為鴨2型腺病毒gd株，于2016年6月5日保藏在武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno：v201633。
本發(fā)明所提供的鴨2型腺病毒可用于制備用于預(yù)防ⅰ群鴨2型腺病毒疾病的疫苗；
所述的疫苗為滅活疫苗。
本發(fā)明所篩選的病毒，其制備的鴨2型腺病毒滅活疫苗安全性良好，未出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。保存期試驗中經(jīng)過性狀、安全性試驗、效力試驗數(shù)據(jù)的分析，各項指標(biāo)均穩(wěn)定有效；利用血清學(xué)方法和免疫攻毒法評估疫苗的免疫效果，結(jié)果顯示，本發(fā)明中制備的滅活疫苗對鴨群能夠提供有效的免疫保護(hù)，具有很好的商品化開發(fā)前景。
附圖說明
圖1：篩選病毒的接種圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
實施例1
gd株的分離與鑒定
1、流行病學(xué)調(diào)查自2014年以來，廣東、浙江等地區(qū)的部分番鴨出現(xiàn)了一種以死亡率高的ⅰ群鴨2型腺病毒疾病。對病死的番鴨剖檢后，主要的病理變化如下：肝臟腫大、肝壞死，脾臟腫大出血點，胰腺壞死等多器官發(fā)生病變?yōu)樘攸c的疾病，經(jīng)臨床調(diào)查和實驗室檢測，初步診斷為ⅰ群鴨2型腺病毒。2015年發(fā)明人成功從廣東某養(yǎng)鴨場的鴨群中分離出一株病毒。
2、病毒分離取病鴨的肝臟、脾臟、心包液、胰腺、法氏囊的組織50～100g，用研缽研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀(無明顯的可見顆粒)，按1:5(w/v)比例與無菌生理鹽水勻漿，反復(fù)凍融3次后6000r/min離心10分鐘，取上清液加入青霉素和鏈霉素各10000iu/ml，4℃過夜，經(jīng)0.22μm微孔濾器過濾，無菌檢驗合格后保存?zhèn)溆?。將?％病毒過濾液接種鴨胚成纖維細(xì)胞，無血清的m199培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，37℃靜置培養(yǎng)60～78h，可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，如圖1所示，收毒。
3、病毒的鑒定
3.1血凝特性鑒定無菌采集spf雞和鴨血液，制備成0.8％、1％和2％濃度血紅細(xì)胞，4℃保存?zhèn)溆?。按常?guī)方法檢測分離毒株是否具有凝集這些紅細(xì)胞的特性。同時設(shè)ⅲ群鴨1型腺病毒(edsv-76)為凝集反應(yīng)陽性對照。結(jié)果：分離毒不能凝集spf雞和鴨紅細(xì)胞，即使改變紅細(xì)胞的濃度，也不能使之凝集。ⅲ群鴨1型腺病毒(edsv-76)能夠凝集雞、鴨的紅細(xì)胞。
3.2理化特性檢驗病毒液分別經(jīng)鹽酸(ph3)、氫氧化鈉(ph10)、溫度(60℃、1h)、氯仿、乙醚處理后，接種鴨胚成纖維細(xì)胞(0.2ml/t25方瓶)，另設(shè)生理鹽水處理組作為對照。接種72h后觀察細(xì)胞病變。結(jié)果：分離毒經(jīng)乙醚、氯仿和鹽酸(ph3)處理的毒株，不影響病毒在細(xì)胞中的增殖，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，pcr檢測結(jié)果陽性。表明病毒沒有囊膜，對乙醚和氯仿有抵抗力，耐酸。而經(jīng)氫氧化鈉(ph10)和溫度(50℃、1h)處理后，接種細(xì)胞，無細(xì)胞病變，pcr檢測陰性。表明分離毒株的核酸類型為dna，病毒不耐堿，對熱敏感，60℃，1h可被滅活。
3.4pcr檢測取病鴨的肝臟、脾臟、心包液、胰腺、法氏囊的組織無菌研磨，反復(fù)凍融3次，利用組織細(xì)胞基因組dna快速提取試劑盒提取病毒dna，進(jìn)行pcr檢測。1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
pcr反應(yīng)體系：總體積25ul
在0.5m1pcr管中依次加入
10×taq聚合酶緩沖液------------5u1
2.5mmo14dntp-------------------4u1
上游引物(20pmol)---------------1u1
下游引物(20pmol)----------------1u1
taqdna聚合酶(1-2u)----------0.3ul
dna--------------------------------4ul
用滅菌去離子水9.7ul補(bǔ)足至總體積25u1，pcr反應(yīng)在ptc-100基因擴(kuò)增儀內(nèi)進(jìn)行。pcr反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性條件為95℃，5min，變性條件為94℃，30sec，退火溫度和時間為53℃，30sec，延伸溫度為72℃延伸35sec，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。
經(jīng)擴(kuò)增，分離毒株擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的片段，與預(yù)期的目的片段大小相符。對擴(kuò)增的片段進(jìn)行測序、拼接后，通過ncbiblast比對分析，分離毒與ⅰ群禽腺病毒屬于同一分支，是鴨2型腺病毒序列。與ncbi公布的序列同源性最接近，但也存在序列上的差異。
實施例2
gd株毒種的制備
挑選已長滿單層的鴨胚成纖維細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，加入終濃度1％毒種(gd株原始毒種第3代)無血清的m199維持液，37℃靜置培養(yǎng)60～78h，可出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80％以上時收獲。按此方法連傳10代，分別標(biāo)記為c3～c10代。測定每代次病毒含量。將檢驗無菌且病毒含量≥106.0tcid50病毒液混合，定量分裝，凍干保存。
實施例3
gd株抗原的制備
1制苗材料選擇鴨胚成纖維細(xì)胞、gd株病毒液的制備。
2細(xì)胞制備取11～13日齡的spf鴨胚，用0.25％胰酶進(jìn)行消化，加入適量含10％血清的m199培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。
3接毒挑選已長滿單層的鴨胚成纖維細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，加入終濃度為1％毒種的維持液，置37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
4收獲接毒后，每日觀察2次，記錄細(xì)胞病變情況。當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80％以上時收獲，凍融2次，收獲的細(xì)胞毒滅活前在-20℃保存。
實施例4
gd株病毒液的滅活及半成品檢驗與疫苗的制備
1滅活將gd細(xì)胞病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計量加入10％甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為0.2％。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37℃滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37℃開始計時，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2～8℃保存，應(yīng)不超過1個月。
2半成品檢驗
2.1無菌檢驗取滅活的病毒液，按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。
2.2滅活檢驗將滅活后的病毒液作10倍稀釋，接種已長滿單層的鴨胚成纖維細(xì)胞(24孔細(xì)胞板)4孔，每孔0.2ml，補(bǔ)充維持液至2.0ml；同時設(shè)未接種的鴨胚成纖維細(xì)胞作空白對照，37℃、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察168小時。將培養(yǎng)物收獲反復(fù)凍融后盲傳一代，繼續(xù)培養(yǎng)120小時。觀察是否出現(xiàn)cpe。
2.3病毒含量測定將毒種用細(xì)胞維持液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10－6、10－7、10－83個稀釋度，分別接種于已長滿單層的鴨胚成纖維細(xì)胞(96孔細(xì)胞板)，每個稀釋度接種6孔，每孔0.1ml。同時設(shè)病毒陽性對照孔和細(xì)胞陰性對照孔，37℃培、5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)和觀察168小時，出現(xiàn)cpe者判為感染，計算tcid50。
3滅活疫苗的制備
3.1油相制備：
取礦物油94份，硬脂酸鋁2份(g)，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司班-80(span-80)6份(ml)，充分混勻后，121℃高壓蒸氣滅菌備用。
3.2水相制備：
在96份(ml)滅活的抗原液中加入4份(ml)滅菌吐溫-80(tween-80)，充分振搖，直到tween-80徹底溶解。
3.3乳化
取油相2份導(dǎo)入乳化罐中，開動電機(jī)低速攪拌，同時徐徐加入水相1份后，1000r/min，乳化30分鐘，即成油乳劑滅活疫苗。
4分裝定量分裝，加蓋密封，并粘貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。
實施例5
疫苗成品檢驗
1性狀
外觀乳白色乳劑。
劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。
穩(wěn)定性吸取疫苗10ml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不多于0.5ml。
黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。
2裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
3無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗，應(yīng)無菌生長。
4安全檢驗皮下免疫21日齡spf鴨10只，每只頸部皮下分點注射疫苗1.0ml，觀察21d，生長發(fā)育均正常，精神狀態(tài)良好，剖檢注射部位疫苗吸收良好，無紅腫、組織壞死等炎癥反應(yīng)。
實施例6
疫苗免疫效果檢測
1血清學(xué)方法用21日齡spf鴨20只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另10只不免疫作對照。免疫后7日～6個月，每只鴨分別采血，分離血清，用瓊擴(kuò)試驗檢測免疫鴨和對照鴨的鴨2型腺病毒抗體，記錄抗體結(jié)果。
2免疫攻毒法用21日齡spf鴨20只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另10只不免疫作對照。免疫后21～28日，所有免疫鴨和對照鴨，肌肉注射病毒液(約含106.0tcid50/0.1ml)，每只0.2ml。觀察并詳細(xì)記錄免疫鴨和對照鴨的發(fā)病情況。
結(jié)果顯示：5批疫苗免疫組21日及以后瓊擴(kuò)抗體均≥8/10陽性，對照組鴨全部為陰性；攻毒保護(hù)結(jié)果：5批疫苗免疫鴨攻毒后觀察14日，保護(hù)數(shù)均不少于9只；對照鴨攻毒7日內(nèi)全部發(fā)病，死亡9只，死亡鴨(死亡后剖檢)及發(fā)病鴨(攻毒后7日剖檢)剖檢病理變化：均出現(xiàn)典型的肝臟腫大和壞死，脾臟、腎臟等多個器官壞死。詳見下表1、2。
而且，對比實驗表明，用目前市場上出售的ⅰ群鴨2型腺病毒疫苗進(jìn)行免疫，再用本發(fā)明篩選的gd株進(jìn)行攻毒實驗；結(jié)果表明目前市場上出售的疫苗的免疫效果遠(yuǎn)低于本發(fā)明的gd株制備的滅活疫苗的效果；推測是由于gd株基因發(fā)生變異導(dǎo)致目前疫苗的免疫效果不好。
表1：疫苗免疫后抗體效價檢測結(jié)果
表2：5批疫苗效力檢驗結(jié)果
綜上，本發(fā)明篩選的gd株疫苗一種免疫效果比較理想的滅活苗，能夠有效的預(yù)防ⅰ群鴨2型腺病毒的發(fā)生。