一種絲瓜內(nèi)參基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種絲瓜內(nèi)參基因，并揭露了利用該絲瓜內(nèi)參基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，不僅解決了現(xiàn)有絲瓜定量PCR檢測(cè)中沒(méi)有內(nèi)參基因的現(xiàn)狀；而且所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物用于絲瓜基因表達(dá)分析時(shí)，能夠提高絲瓜基因表達(dá)分析研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性；此外，所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性強(qiáng)，從而能夠大大的提高了采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)絲瓜時(shí)的檢測(cè)效率，并提高了檢測(cè)結(jié)果的可信度。
【專利說(shuō)明】一種絲瓜內(nèi)參基因及其應(yīng)用 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種絲瓜內(nèi)參基因及其應(yīng)用，具體地， 利用該絲瓜內(nèi)參基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)一對(duì)熒光定量特異引物。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 絲瓜（Luffa cylindrical)原產(chǎn)東印度，主要分布于熱帶、亞熱帶的亞洲各地，在 我國(guó)南北均有栽培，是我國(guó)主要的瓜類蔬菜。隨著其分子生物學(xué)研宄的不斷深入和發(fā)展，基 因表達(dá)分析正逐漸應(yīng)用于揭示絲瓜基因調(diào)控機(jī)理的研宄中。為了避免不同樣本在RNA的產(chǎn) 量、質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄效率以及擴(kuò)增效率上可能存在的差別，通常利用內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)校正和 標(biāo)準(zhǔn)化，以減少樣本之間的誤差，因此選擇合適的內(nèi)參基因?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行校正是得到可信數(shù) 據(jù)的關(guān)鍵。而18S核糖體脫氧核糖核酸（18S rRNA)存在于所有的真核生物細(xì)胞中，幾乎在 所有組織中都高水平表達(dá)，在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)量一般是恒定的，且其作 為內(nèi)參基因在分析植物基因表達(dá)以及檢測(cè)植物體內(nèi)的病原物研宄中應(yīng)用廣泛。
[0003] 但目前關(guān)于絲瓜18S rRNA基因的克隆和作為關(guān)于絲瓜內(nèi)參基因的研宄還未見(jiàn)報(bào) 道。而缺乏內(nèi)參基因，則難以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的校正和標(biāo)準(zhǔn)化，大大阻礙絲瓜各種基因的表達(dá) 特性及功能分析研宄。
[0004] 此外，雖然實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)物種基因表達(dá)的絕對(duì)定量 和相對(duì)定量研宄中，但是因絲瓜內(nèi)參基因的缺乏，目前尚未發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng) 用于絲瓜基因表達(dá)的絕對(duì)定量和相對(duì)定量研宄中的相關(guān)報(bào)道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種絲瓜內(nèi)參基因，并揭露了利用該絲瓜內(nèi) 參基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的：一種絲瓜內(nèi)參基因，所述內(nèi)參 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；且該內(nèi)參基因是以絲瓜DNA為模板、并以如下引物 對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)所得的；
[0007] 其中引物對(duì)為：
[0008] 正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，
[0009] 反向引物 5' -AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
[0010] 進(jìn)一步地，以權(quán)利要求1中所述內(nèi)參基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，利用Primer Premier5. 0軟件、并遵循實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì)出一對(duì)熒光定量特異引 物，該對(duì)熒光定量特異引物即為所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物；
[0011] 且該實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物為：
[0012] 正向引物 5' -GTGTTCTTCGGAATGACTGG-3'，
[0013] 反向引物 5' -ATCGTTTACGGCATGGACTA-3'。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] 本發(fā)明提供了一種絲瓜內(nèi)參基因，同時(shí)揭露了利用該絲瓜內(nèi)參基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)的 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，不僅解決了現(xiàn)有絲瓜定量PCR檢測(cè)中沒(méi)有內(nèi)參基因的現(xiàn)狀；而且所 設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物用于絲瓜基因表達(dá)分析時(shí)，能夠提高絲瓜基因表達(dá)分析研宄 的穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性；此外，所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性強(qiáng)，從而能夠大 大的提高了采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)絲瓜時(shí)的檢測(cè)效率，并提高了檢測(cè)結(jié)果的可信度。 【【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0016] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0017] 圖1是本發(fā)明中實(shí)施例1的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0018] 圖2是本發(fā)明中實(shí)施例2的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0019] 圖3是本發(fā)明中實(shí)施例3的PCR擴(kuò)增曲線圖。
[0020] 圖4是本發(fā)明中實(shí)施例3的溶解曲線圖。
[0021] 圖5是本發(fā)明中實(shí)施例4的1%的瓊脂糖凝膠電泳圖。 【【具體實(shí)施方式】】
[0022] 本發(fā)明列舉了以下幾個(gè)代表性實(shí)施例，這些實(shí)施例僅是示例性的，且不用于 限制本發(fā)明的范圍，這些實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。且各實(shí)施例中所采用的儀 器與試劑如下：美國(guó)ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀，美國(guó)ABI Veriti96-well熱循環(huán)儀，美 國(guó) ABI Power SYBR? Green PCR Master Mix, pMD18-T-vector、cDNA 第一鏈合成試 劑盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、Marker DL 2000、Taq DNA PolymerashdNTP均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 為Omega公司產(chǎn)品，引物合成和克隆測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成，其余生化 試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
[0023] 實(shí)施例1內(nèi)參基因的獲得
[0024] 步驟（1)、根據(jù)Genbank公布的西瓜、甜瓜及西萌蘆的18S rRNA基因設(shè)計(jì)一對(duì) 引物，并利用Clustalx軟件對(duì)所設(shè)計(jì)的該引物對(duì)進(jìn)行序列比對(duì)，且由鉑尚生物技術(shù)（上 海）有限公司合成該對(duì)引物，具體地，該對(duì)引物（如SEQ ID NO :1、2所示）：正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，反向引物 5' -AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
[0025] 步驟（2)、DNA提取：采用改良CTAB法進(jìn)行絲瓜基因組DNA的提取，具體地：稱取絲 瓜嫩葉0. 5g于研缽中，加入液氮和0. Ig的PVPP快速充分研磨至粉末狀，將粉末移至I. 5mL 離心管中；每管加入600 μ L預(yù)熱至65°C的2% CTAB提取緩沖液，同時(shí)加入7ul β -琉基乙 醇，充分混勾，65°C水浴60min，且每隔15min顛倒一次；取出離心管，冷卻至室溫，接著加入 等體積的氯仿/異戊醇，且氯仿/異戊醇中氯仿、異戊醇二者的體積比為24:1，輕緩顛倒混 勻，靜置l〇min，后于4°C下12000rpm離心IOmin ;取上清液至另一離心管，并加入等體積的 氯仿/異戊醇（氯仿/異戊醇中氯仿、異戊醇二者的體積比為24:1)進(jìn)行再次抽提，同樣于 4°C下12000rpm離心IOmin ;取上清液至另一離心管，并加入0. 6倍體積異丙醇，輕緩顛倒 混勾，后于4°C冰箱靜置30min-60min，之后在4°C條件下12000rpm離心IOmin ;用體積分?jǐn)?shù) 70 %乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，然后置于超凈工作臺(tái)上風(fēng)干；風(fēng)干后將所得DNA溶于100 μ L TE溶液中，并加入終濃度為IOmg. mL-1的RNase A 2. 5uL，接著于37°C水浴鍋中保溫30min， 之后用I %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量；最后將DNA稀釋至50ng. L-1，并于-20°c 冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0026] 步驟⑶、PCR擴(kuò)增：以經(jīng)步驟⑶處理所得的DNA為模板，并以步驟⑴中獲得的 引物為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0027] PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為25yL，含25ng模板、0.4ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1階1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 緩沖液2. 5 μ L、其余成分為滅菌的超純水。
[0028] ?0?反應(yīng)程序?yàn)椋?4°0預(yù)變性31^11;94°0變性3〇8,56°0退火3〇8,72°0延伸9〇8,35 個(gè)循環(huán)；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0029] 步驟（5)、取步驟⑷所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，得到如圖1 所示大小的片段，回收該片段并進(jìn)行純化后連接到PMD18-T載體上轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆子， PCR檢測(cè)后送至測(cè)序，所測(cè)得的序列即為內(nèi)參基因的核苷酸序列，其如SEQ ID NO :3所示。
[0030] 實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量PCR設(shè)計(jì)和常規(guī)PCR檢測(cè)
[0031] 以實(shí)施例1獲得的內(nèi)參基因的核苷酸序列為基礎(chǔ)，利用Primer Premier5. 0軟件， 并遵循實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì)出一對(duì)熒光定量特異引物，其擴(kuò)增片段為 271bp，該對(duì)熒光定量特異引物即為所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物（如SEQ ID NO :4、5所示）： 正向引物 5' -GTGTTCTTCGGAATGACTGG-3'，反向引物 5' -ATCGTTTACGGCATGGACTA-3'。
[0032] 提取絲瓜總 RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒 的方法合成cDNA第一鏈，即將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ;之后以所得cDNA為模板、以實(shí)時(shí)熒光定 量PCR引物為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系與反應(yīng)程序如下：
[0033] PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系的總體積為25yL，含25ng模板、0.4ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1階1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 緩沖液2. 5 μ L、其余成分為滅菌的超純水；
[0034] ?0?反應(yīng)程序?yàn)椋?4°0預(yù)變性31^11;94°0變性3〇8,56°0退火3〇8,72°0延伸9〇8,35 個(gè)循環(huán)；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0035] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示；由圖2可知， PCR擴(kuò)增得到一條單一條帶，沒(méi)有出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶（圖2)，經(jīng)測(cè)序大小為271bp，符合 預(yù)期大??；則可繼續(xù)下游的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物驗(yàn)證。
[0036] 實(shí)施例3
[0037] 提取絲瓜總 RNA，并按照 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試 劑盒的方法合成cDNA第一鏈，即將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ;之后以所得cDNA為模板、按照 Power SYBR1? Green PCR Master Mix 說(shuō)明書(shū)在 ABI7500 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀上進(jìn)行 PCR 反 應(yīng)，PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系與反應(yīng)程序如下：
[0038] 反應(yīng)體系為：反應(yīng)體系的總體積為25 yL，12. 5 yL Power SYBR? Green PCR Master Mix，IyL模板，實(shí)施例2中實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的正向引物0.5 yL(濃度為 10 μ mol/L)，實(shí)施例2中實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的反向引物0· 5 μ L (濃度為10 μ mol/L)，補(bǔ) 蒸餾水至總體積25 μ L。
[0039] 反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性IOmin ;95°C變性15s，60°C退火lmin，共40個(gè)循環(huán)；4°C 保存；每個(gè)反應(yīng)做3個(gè)重復(fù)。
[0040] 反應(yīng)的結(jié)果如圖3(其中，ARn指熒光強(qiáng)度、cycle指循環(huán)數(shù)）所示，從圖3可以看 出，3次重復(fù)的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線均很好。且為檢驗(yàn)反應(yīng)的特異性， 申請(qǐng)人:在PCR后進(jìn) 行融解曲線分析，分析結(jié)果如圖4所示，從圖4可顯示出，3次重復(fù)的Tm(溶解溫度）分別為 86. 25°C、86. 06°C、86. 25°C，且均只有一個(gè)特異峰，表明無(wú)引物二聚體，擴(kuò)增條帶單一，特異 性強(qiáng)，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，從而表明所設(shè)計(jì)的一對(duì)引物特異性強(qiáng)（即實(shí)施例2中的實(shí)時(shí) 熒光定量PCR引物），擴(kuò)增效率高，特異性強(qiáng)，能夠用于絲瓜熒光定量PCR的內(nèi)參引物實(shí)驗(yàn)。
[0041] 實(shí)驗(yàn)例4絲瓜18S rRNA基因表達(dá)穩(wěn)定性分析
[0042] 分別提取絲瓜根、莖、葉、幼瓜（花后5天）、商品瓜（花后12天）、成熟瓜（花后 30天）、高溫處理（38°C )葉片、低溫處理（8°C )葉片、強(qiáng)光處理（2000umol ·πΓ2 葉片、 及弱光處理（200umol · πΓ2 · S4)葉片的總RNA，之后分別按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的方法合成cDNA第一鏈，以獲得各自的cDNA ;利用實(shí)施2中的 實(shí)時(shí)熒光定量特異引物為引物對(duì)，以獲得的10種的cDNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò) 增體系與擴(kuò)增程序如下：
[0043] PCR擴(kuò)增體系：反應(yīng)體系的總體積為25 yL，25ng模板、0. 4 ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1階1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 緩沖液2. 5 μ L、其余成分為滅菌的超純水。
[0044] PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，28 個(gè)循環(huán)；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0045] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，且圖5中標(biāo) 識(shí)1至10分別為絲瓜根、莖、葉、幼瓜（花后5天）、商品瓜（花后12天）、成熟瓜（花后30 天）、高溫處理（38°C )葉片、低溫處理（8°C )葉片、強(qiáng)光處理（2000umol ·πΓ2 · ?Γ1)葉片、 及弱光處理（200umol · m_2 · s_〇葉片的PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果；由圖5顯示，采用實(shí)施2中的 實(shí)時(shí)熒光定量特異引物為引物對(duì)時(shí)，擴(kuò)增所得的10個(gè)條帶亮度基本一致，從而表明在絲瓜 不同組織、各生長(zhǎng)發(fā)育階段、及各種非生物脅迫條件下均能穩(wěn)定表達(dá)，即說(shuō)明了實(shí)時(shí)熒光定 量特異引物在絲瓜基因表達(dá)中的穩(wěn)定性，從而適用于絲瓜基因表達(dá)的研宄。
[0046] 綜上，本發(fā)明提供了一種絲瓜內(nèi)參基因，并揭露了利用該絲瓜內(nèi)參基因?yàn)榛A(chǔ)設(shè) 計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，不僅解決了現(xiàn)有絲瓜定量PCR檢測(cè)中沒(méi)有內(nèi)參基因的現(xiàn)狀；而 且所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物用于絲瓜基因表達(dá)分析時(shí)，能夠提高絲瓜基因表達(dá)分析 研宄的穩(wěn)定性、可靠性和重復(fù)性；此外，所設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性強(qiáng)，從而能 夠大大的提高了采用實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)絲瓜時(shí)的檢測(cè)效率，并提高了檢測(cè)結(jié)果的可信度。
【權(quán)利要求】
1. 一種絲瓜內(nèi)參基因，其特征在于：所述內(nèi)參基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； 且該內(nèi)參基因是以絲瓜DNA為模板、并以如下引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)所得的； 其中引物對(duì)為： 正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'， 反向引物 5' -AGGAITCAATCCAGCCACAGGIT-3'。
2. -種實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，其特征在于：以權(quán)利要求1中所述內(nèi)參基因的核苷酸 序列為基礎(chǔ)，利用Primer Premier5. 0軟件、并遵循實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì) 出一對(duì)熒光定量特異引物，該對(duì)熒光定量特異引物即為所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物； 且該實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物為： 正向引物 5' -GTGITCTTCGGAATGACTGG-3'， 反向引物 5' -ATCGITTACGGCATGGACTA-3'。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104480202SQ201410725658
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】朱海生, 溫慶放, 陳敏氡 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所