擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt79b2在提高植物抗冷凍性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶基因的應(yīng)用，尤其涉及一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2在提高植物抗冷凍性中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖基轉(zhuǎn)移酶是專門負(fù)責(zé)催化糖基化修飾反應(yīng)的酶類，它將活性糖基從供體(通常 是UDP-glucose)轉(zhuǎn)移到受體分子上。糖基化修飾往往會(huì)改變植物分子的生物活性、水溶性、 在細(xì)胞內(nèi)和整體植株的轉(zhuǎn)運(yùn)特性、亞細(xì)胞定位以及與受體的相互識(shí)別與結(jié)合特性，另外還 能降低或消除內(nèi)源和外源物質(zhì)的毒性(Lim and Bowles，2004;Bowles et al.，2006;Wang and Hou，2009)。因此，糖基轉(zhuǎn)移酶基因在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞代謝平衡、維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)育 等方面有重要意義。例如，已有報(bào)道糖基轉(zhuǎn)移酶基因參與植物激素平衡調(diào)節(jié)、植物防御反 應(yīng)、植物次生代謝物合成以及植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等(Wang and Hou，2009)。但是目前為止有關(guān)擬 南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因在增強(qiáng)植物抗冷凍性中的應(yīng)用未見報(bào)道。
[0003] 生物界存在的糖基轉(zhuǎn)移酶按照所催化的底物性質(zhì)和序列相關(guān)性分屬94個(gè)不同的 家族。其中家族1包含的成員數(shù)量最多，與植物的關(guān)系最密切。在家族1中大多數(shù)基因 C端具 有一個(gè)由44個(gè)氨基酸組成的保守序列，即PSPG盒（plant secondary product glycosyltransferase box)。隨著擬南芥（Arabidopsis thaliana)全基因組測(cè)序的完成， 通過對(duì)PSPG盒的序列分析發(fā)現(xiàn)擬南芥中共有119個(gè)可能的糖基轉(zhuǎn)移酶，這些糖基轉(zhuǎn)移酶中 大部分的功能還不清楚。
[0004] 擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2是擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶家族1中的一個(gè)成員，目前它 的基因序列已公開于核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中。但是經(jīng)過檢索，有關(guān)擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2具有抗冷凍功能及其在增強(qiáng)植物抗冷凍性中的應(yīng)用未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] (1)本發(fā)明的目的
[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2在提高植物抗凍性中的應(yīng)用。
[0007] (2)本發(fā)明的技術(shù)方案
[0008] 本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2在提高植物抗凍性中的應(yīng)用。
[0009] 其中：所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，所 述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT79B2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述植物優(yōu)選是十字花科 植物，所述十字花科植物優(yōu)選是擬南芥、芥菜、油菜、白菜或甘藍(lán)。
[0010] 本發(fā)明利用SEQ ID No.3和SEQ ID如.4所示的引物序列，通過1^0?技術(shù)從擬南 芥中克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2，然后利用該基因構(gòu)建植物過表達(dá)載體，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因 操作，獲得轉(zhuǎn)基因植物。檢測(cè)表明轉(zhuǎn)基因植物的抗凍性得到顯著提高。
[0011] (3)本發(fā)明實(shí)施后可能帶來(lái)的有益效果
[0012] 本發(fā)明第一次證明擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2能夠參與植物的抗冷凍脅迫。 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作，可以顯著 提高轉(zhuǎn)基因植物的抗凍性(見附圖1、附圖2和附圖3)。預(yù)示本發(fā)明實(shí)施后將會(huì)為創(chuàng)造新型抗 凍植物提供幫助，可用于后續(xù)的作物品種改良，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大意義。
【附圖說明】
[0013] 圖l.qRT-PCR檢測(cè)UGT79B2冷凍脅迫誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Col-ο種子，滅菌 后均勻點(diǎn)種子到含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，4度春化3天后，置于22°C中培養(yǎng)14天。取出lg的 Col-Ο擬南芥，平均置于含有少量水的兩個(gè)濾紙皿中，一個(gè)濾紙皿繼續(xù)放置在22°C中培養(yǎng)， 一個(gè)濾紙皿放置在4°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別隔Oh，3h，6h，12h，24h取材，液氮速凍后，提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，用qRT-PCR驗(yàn)證UGT79B2是否受冷凍脅迫誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在冷脅 迫下UGT79B2受到明顯上調(diào)，并且在6h的時(shí)候UGT79B2上調(diào)最大。這個(gè)結(jié)果表明，UGT79B2受 冷脅迫誘導(dǎo)。
[0014] 圖2.低溫下擬南芥各個(gè)株系的萌發(fā)率實(shí)驗(yàn)。其中以WT (Col-ο)為擬南芥對(duì)照植物， 79B20E-7和79B20E-18為兩個(gè)過表達(dá)株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2為兩個(gè)突變株系。取 生長(zhǎng)一致的種子，滅菌后均勻點(diǎn)種子到含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)株系至少點(diǎn)種子150 顆，三次重復(fù)。4 °C春化3天后，將對(duì)照組培養(yǎng)皿置于22 °C培養(yǎng)，將實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)皿置于12 °C培 養(yǎng)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次萌發(fā)率，連續(xù)統(tǒng)計(jì)7天。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中各個(gè)株系的萌發(fā)率基本一致，沒 有差異，實(shí)驗(yàn)組中，過表達(dá)株系的萌發(fā)率總是高于野生型，突變株系的萌發(fā)率總是低于野生 型。試驗(yàn)結(jié)果表明UGT79B2參與冷脅迫。
[0015]圖3.低溫下擬南芥各個(gè)株系的生長(zhǎng)狀況實(shí)驗(yàn)。其中以WT(Col-O)為擬南芥對(duì)照植 物，79B20E-7和79B20E-18為兩個(gè)過表達(dá)株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2為兩個(gè)突變株 系。取生長(zhǎng)一致的種子，滅菌后均勻水平點(diǎn)種子到含MS培養(yǎng)基的方皿中，三個(gè)重復(fù)。4°C春化 3天后，將方皿垂直置于4°C培養(yǎng)。8周后，觀察各個(gè)株系表型。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系長(zhǎng)勢(shì)要比野生 型好，而突變體的長(zhǎng)勢(shì)要比野生型差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明UGT79B2參與冷脅迫。
[0016] 圖4.冷凍脅迫下擬南芥各個(gè)株系的存活率實(shí)驗(yàn)。其中以WT(Col-O)為擬南芥對(duì)照 植物，79B20E-7和79B20E-18為兩個(gè)過表達(dá)株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2為兩個(gè)突變株 系。取生長(zhǎng)一致的種子，滅菌后均勻點(diǎn)種子到含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)株系至少點(diǎn)種子 150顆，三次重復(fù)。4°C春化3天后，置于22 °C培養(yǎng)12天。然后將培養(yǎng)皿放置在4°C中培養(yǎng)2天， 再將培養(yǎng)皿用碎冰覆蓋，一起置于-1°C的冰箱中16h。16h后，拿走碎冰，將培養(yǎng)皿置于-1°C 的冰箱中，并且每隔lh降低1°C，同時(shí)取出三個(gè)重復(fù)含有各個(gè)株系的培養(yǎng)皿置于4°C中12h， 再?gòu)? °C中放置到22°C中兩天。兩天后，觀察各個(gè)株系的生長(zhǎng)情況，拍照并統(tǒng)計(jì)其存活率。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系在各個(gè)溫度下的冷凍脅迫，存活率總是高于野生型，而突變株系的 存活率總是低于野生型。從圖4可以看到，在-6 °C的時(shí)候，野生型大部分存活，過表達(dá)基本全 部存活，而突變體只有一小半存活。這個(gè)結(jié)果同樣表明UGT79B2參與冷凍脅迫。
[0017] 圖5.冷凍脅迫下的電解質(zhì)滲透率測(cè)定實(shí)驗(yàn)。對(duì)擬南芥各個(gè)株系的培養(yǎng)方法同冷凍 脅迫存活率實(shí)驗(yàn)中的處理方法。將冷凍脅迫處理之后的擬南芥中的各個(gè)株系用清水洗凈以 后，用電解質(zhì)測(cè)定儀測(cè)定其電解質(zhì)并計(jì)為W1，然后再將測(cè)定完電解質(zhì)的擬南芥在沸水浴中 煮沸l(wèi)Omin，待其冷卻后再將電解質(zhì)測(cè)定儀測(cè)其總電解質(zhì)W2,最后通過電解質(zhì)滲透率公式來(lái) 計(jì)算各個(gè)株系的電解質(zhì)滲透率，電解質(zhì)滲透率的計(jì)算公式為W=W1/W2X 100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，擬南芥各個(gè)株系的電解質(zhì)滲透率測(cè)定中，過表達(dá)株系的電解質(zhì)滲透率總是比野生型高， 而突變株系的電解質(zhì)滲透率總是比野生型低；其中以WT(Col-O)為擬南芥對(duì)照植物， 79B20E-7和79B20E-18為兩個(gè)過表達(dá)株系，ugt79b2k〇-l和ugt79b2k〇-2為兩個(gè)突變株系。這 個(gè)結(jié)果顯示UGT79B2參與植物體內(nèi)的冷凍脅迫，并且還與植物體內(nèi)電解質(zhì)滲透相關(guān)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1克隆擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2
[0019] 1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT79B2的克隆
[0020] 通過公開網(wǎng)站http: //www · cazy · org獲得UGT79B2基因的cDNA序列。根據(jù)cDNA序列 設(shè)計(jì)引物，正向引物為79B2-F: 5 ' -GGATCCCAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC-3 '，反向引物為 79B2-R: 5 ' -GAGCTCTACCAACCTTATTGATCACTCCCT-3 '。利用TRI zol試劑盒提取擬南芥RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增UGT79B2基因的全長(zhǎng)cDNA序列。將cDNA克隆的過程是先經(jīng)過BamHI和SacI酶切， 之后連入相應(yīng)酶切的pBluescript II SK( + )載體中，構(gòu)建成測(cè)序中間載體，稱為pK79B2