白背飛虱不同齡期穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因、其篩選方法及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學中昆蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及白 背飛虱不同齡期穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因及其篩選方法及應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白背飛虱 White-backed planthopper (Sogatella furcifera (Horvdith))，屬節(jié)肢 動物門，昆蟲綱，半翅目，飛虱科，一生經(jīng)歷3個發(fā)育階段，包括卵期、若蟲期和成蟲期，成蟲 具有迀飛習性。水稻是白背飛虱適宜寄主，白背飛虱不僅可以刺吸水稻韌皮部汁液，還可以 傳播多種病毒病，給水稻生產(chǎn)造成重大損失。白背飛虱在我國分布廣泛，包括華南、華中、華 北、東北以及西南稻區(qū)，西北稻區(qū)可達新疆自治區(qū)的米泉等地都有其分布。
[0003] 白背飛虱完成一個生命周期需要經(jīng)過卵、若蟲、成蟲三種蟲態(tài)，屬于漸變態(tài)昆蟲。 白背飛虱一年發(fā)生3~4代，雄成蟲較雌成蟲羽化早，雌成蟲一生只交配1次，雄成蟲可交 配3~4次，雌蟲產(chǎn)卵的部位集中于稻株基部。白背飛虱存在著形態(tài)和行為的多態(tài)現(xiàn)象，即 迀飛型（以長翅型為代表）和居留型（以短翅型為代表），溫度對白背飛虱翅型的分化起著 重要的作用，但一般情況下白背飛虱短翅型雄蟲極少見。
[0004] 近年來，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)以其快速、靈敏、準確、重復性高、可定 量、適用范圍廣等特點優(yōu)勢，已被廣泛應用于基因表達分析。在使用相對定量方法時需要一 個在實驗組和對照組中表達量恒定的參考基因作為檢測目的基因在特定條件下表達水平 變化的參照物，用來歸一化二者的實驗數(shù)據(jù)，這里的參考基因即為內(nèi)參基因。一個內(nèi)參基因 在特定的實驗條件下能持續(xù)穩(wěn)定的表達是其可應用的基本前提。理想的內(nèi)參基因應該滿足 以下條件：不存在假基因，以避免基因組DNA的擴增；高度或中度表達；穩(wěn)定表達于不同類 型的細胞和組織；表達水平與目標基因相似；不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響。常用 的內(nèi)參基因都是維持正常的細胞生命活動所必須的基因，如Actin、18S、GAPDH、Tublin等， 但是沒有一種內(nèi)參基因 mRNA表達水平在所有的條件下是一成不變的，一些內(nèi)參基因在某 種特定條件下，其表達可能發(fā)生變化。因此，研宄不同的環(huán)境條件下，某一有機體內(nèi)基因的 表達情況，內(nèi)參基因的選擇至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供的白背飛虱不同齡期穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，為白背飛虱不同齡期內(nèi)參 基因的選擇提供依據(jù)。
[0006] 同時本發(fā)明還提供其篩選方法及應用。
[0007] 本發(fā)明根據(jù)NCBI已經(jīng)公開發(fā)表的其它昆蟲相關(guān)基因序列，設計簡并引物，PCR獲 得白背飛虱6個常用內(nèi)參基因部分核苷酸序列，經(jīng)過克隆、測序以及與NCBI數(shù)據(jù)庫Blast 比對，確定為白背飛虱內(nèi)參基因的部分序列；隨后又基于此序列設計特異性的定量引物，建 立基于SYBR Green I染料技術(shù)的RT-qPCR方法，利用熒光定量PCR技術(shù)篩選出了白背飛虱 不同齡期最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，從而為今后研宄不同齡期基因表達水平以及白背飛虱的基因 功能方面建立堅實的基礎(chǔ)。
[0008] 白背飛虱不同齡期穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因 A1TU，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0009] 白背飛虱不同齡期穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因 AlTU的篩選方法，包括如下步驟：
[0010] (1)白背飛虱飼養(yǎng)：白背飛虱為實驗室飼養(yǎng)種群，飼養(yǎng)于人工氣候箱中，飼養(yǎng)條件 是27±1°C，75±5%，光周期為16h光照：8h黑暗；
[0011] (2)獲得內(nèi)參基因序列：GenBank數(shù)據(jù)庫公開的白背飛虱18S序列，登錄號為 JX556779. I ;RPL9和RPLlO的序列由轉(zhuǎn)錄組測序獲得，其獲得具體過程為利用Ion Proton II測序平臺，對白背飛虱唾液腺組織總RNA進行高通量測序，根據(jù)注釋結(jié)果查找獲得RPL9 和RPLlO的序列，與數(shù)據(jù)庫中的序列Blast比對，確定了 RPL9和RPLlO的部分序列，見SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8 ;基于NCBI已經(jīng)公開的相關(guān)基因序列，設計合成了 6個白背飛虱 內(nèi)參基因簡并引物，序列如下：
[0012]
[0013] (3)確定白背飛虱內(nèi)參基因序列：簡并引物PCR擴增獲得序列進行克隆并測序，將 獲得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，以確定內(nèi)參基因序列，見SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :8 ;
[0014] (4)設計特異性的熒光定量引物：基于獲得白背飛虱9個內(nèi)參基因序列，設計特異 性熒光定量PCR引物，并利用定量PCR溶解曲線法確定其擴增特異性，并設置10倍梯度稀 釋建立標準曲線，確立每對引物的擴增效率；
[0015]
[0016] (5)提取白背飛虱1齡、2齡、3齡、4齡、5齡、雄性成蟲和雌性成蟲總RNA，分別反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA進行實時熒光定量PCR分析；
[0017] (6)將實時熒光定量PCR實驗數(shù)據(jù)輸入到在線分析軟件Ref inder進行內(nèi)參基因穩(wěn) 定性分析，確立最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因。
[0018] 步驟（3)中 PCR 擴增的反應條件如下：94 °C，3min，（94 °C，30sec，55 °C， 30sec, 72°C，lmin) 35 個循環(huán)，72°C延伸 lmin，4°C保存。
[0019] 步驟（3)中核苷酸片段的克隆方法，包括以下步驟：
[0020] 純化步驟（2)所得PCR產(chǎn)物，瓊脂凝膠回收目的片段，取純化產(chǎn)物連接到pEASY-T 載體上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5 α中，37°C平板培養(yǎng)過夜，藍白斑篩選含目的片 段的陽性克隆菌株，對所獲得的陽性克隆進行序列測序，測序所得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進 行BLAST比較分析，進而確定所得的核苷酸序列為白背飛虱內(nèi)參基因序列。
[0021] 所述步驟⑷的方法為：提取白背飛虱的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA，然后以CDNA為 模板進行qPCR擴增，熒光染料為SYBR Green I 〇
[0022] 所述的qPCR擴增采用兩步法，即95°C預變性15min，PCR反應為95°C，10sec， 60°C，32sec，40個循環(huán)，最后是溶解曲線分析，步驟為：95°C，15sec，60°C lmin，95°C， 30sec,G0°G,15sec。
[0023] 白背飛虱不同齡期穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因 AlTU作為內(nèi)參基因在研宄不同齡期基因 表達水平中的應用。
[0024] 本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0025] 選取同一飼養(yǎng)條件（27±1°C，75±5%，光周期為16h光照：8h黑暗）下不同齡 期的白背飛虱1齡、2齡、3齡、4齡、5齡、雄性成蟲和雌性成蟲，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。然后進行熒光定量PCR驗證9個內(nèi)參基因穩(wěn)定性情況，篩選出白背飛虱不同齡期中 最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。這9個內(nèi)參基因包括：延伸因子l-α (Elongation factor 1-alpha， EF1A)、泛素（Polyubiquitin，UB)、核糖體蛋白 S18(Ribosomal protein S18，RPS18)、 肌動蛋白仏(^111，八(：1'預)、€1-1微管蛋白（八1?11&-1-七1*111111，六11^)、3-磷酸甘油醛 (Glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH)、核糖體蛋白 L9(Ribosomal protein L9，RPL9)、 核糖體蛋白 L10(Ribosomal protein L10，RPL10)和 18SrRNA(18S)。其中 18S 序列在數(shù)據(jù) 庫已經(jīng)公開發(fā)表、RPL9和RPLlO的序列是根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得。另外6個內(nèi)參基因包括： EF1A，UB，RPS18, ACTIN，A1TU，GAPDH是根據(jù)數(shù)據(jù)庫已經(jīng)公開的相關(guān)序列設計簡并引物，PCR 擴增并克隆測序，確定了部分序列。隨后基于此序列設計熒光定量相關(guān)的引物，進行實時熒 光定量PCR驗證。所獲得數(shù)據(jù)，采用在線分析軟件RefFinder(http://www. leonxie. com/ referencegene. php)進行數(shù)據(jù)分析。從而篩選出白背飛虱不同齡期下最穩(wěn)定表達的內(nèi)參基 因。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0027] 1.本發(fā)明首次克隆得到白背飛虱的6個內(nèi)參基因（EF1A，UB，RPS18，ACTIN，A1TU， GAPDH)部分基因片段。
[0028] 2.本發(fā)明首次驗證和比較了 9個常用內(nèi)參基因（EF1A，UB，RPS18, ACTIN，A1TU， GAPDH，RPL9, RPL10,18S)在白背飛虱蟲體中的表達量。
[0029] 3.本發(fā)明設計的定量PCR引物具有特異性，并具有90%以上的擴增效率，能夠為 準確定量提供堅實基礎(chǔ)。
[0030] 4.本發(fā)明利用熒光定量PCR技術(shù)首次驗證并篩選出了白背飛虱不同齡期穩(wěn)定的 內(nèi)參基因 A1TU。
【附圖說明】
[0031] 圖1.白背飛虱6個內(nèi)參基因（EF1A，UB，RPS18, ACTIN，A1TU，GAPDH)簡并引物的 PCR電泳圖；
[0032] 其中：M 代表 DL2000DNA Marker，從上到下依次為 2000bp，1000bp，750bp，500bp， 250bp, 100bp〇 I ：GAPDH ；2 ：A1TU ；3 ：ACTIN ；4 ：UB ；5 ：RPS18 ；6 ：EFlA〇
[0033] 圖2.白背飛虱9個內(nèi)參基因的溶解曲線。
[0034] 其中：橫坐標代表在溶解曲線擴增階段，從60°C到95°C之間的溫度范圍；縱坐標 代表SYBR Green I熒光染料結(jié)合到目標片段的雙鏈DNA后，進入溶解曲線擴增階段，隨溫 度升高，被ROX標準化后的SYBR Green I熒光信號值即1^的導數(shù)值，峰值指在所對應的溫 度下劇降低的拐點處的導數(shù)值。
[0035] 圖3.白背飛虱9個內(nèi)參基因的10倍梯度稀釋擴增曲線。
[0036] 其中：橫坐標代表qPCR擴增時的循環(huán)數(shù)，即Ct值；縱坐標代表在對應循環(huán)數(shù)下的 Rnito
[0037] 圖4.熒光定量PCR實驗9個內(nèi)參基因的Ct值繪制成盒須圖，Ct值越大基因表達 量越小，Ct值越小基因表達量越大。從圖中可以看出18S表達量最高，UB表達量最小