一種快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，包括如下步驟：（1）確定目標(biāo)植物種類和目標(biāo)基因，提取目標(biāo)植物的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR的為模板，選擇多個(gè)內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)得到CT值；（2）將所述CT值數(shù)據(jù)通過geNorm、NormFinder、BestKeeper三種軟件分析其適用性，用R軟件的RankAggreg程序包，將每個(gè)處理里得到的四組適用性排序數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)平均聚合，得到所述多個(gè)基因的最終適用性排序。本發(fā)明所述方法對(duì)于推動(dòng)揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆機(jī)理等基礎(chǔ)性研究和培育速生、抗逆、豐產(chǎn)的植物新品種等應(yīng)用型研究具有十分重要的意義。
【專利說明】一種快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)參基因，也被稱作參照基因或者管家基因，是研究目的基因表達(dá)量變化的重要內(nèi)源對(duì)照。內(nèi)參基因表達(dá)量的不穩(wěn)定和變化將導(dǎo)致需要研究的目的基因的表達(dá)量的偏差和波動(dòng)，為了獲得精確和可信度高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，鑒定和評(píng)價(jià)合適的內(nèi)參基因是任何一個(gè)物種進(jìn)行基因表達(dá)分析的關(guān)鍵前提條件。近幾年隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序成本的不斷降低，科學(xué)家完成大量植物物種的全基因測(cè)序工作，在這些已獲得基因組信息的植物物種內(nèi)開展內(nèi)參基因適用性的研究，成為從各方面深入研究該植物物種的基礎(chǔ)。目前有許多植物物種需要對(duì)內(nèi)參基因在不同組織、不同發(fā)育階段、不同的環(huán)境處理?xiàng)l件下的適用性進(jìn)行研究。
[0003]鑒定和評(píng)價(jià)內(nèi)參基因的適用性，需要對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行排序，技術(shù)操作基于實(shí)時(shí)性光定量PCR，目前應(yīng)用最廣泛的用于基因表達(dá)量分析的技術(shù)手之一，其具有較高的穩(wěn)定性、特異性和可靠性。胡楊(Populus euphratica Oliv)生長(zhǎng)在干旱鹽堿和溫差劇烈變化的極端沙漠環(huán)境中，被國(guó)際學(xué)術(shù)界越來越多的定性為進(jìn)行木本植物抗逆研究的模式材料，本研究對(duì)胡楊在脫落酸、寒冷、脫水、干旱、短期鹽、長(zhǎng)期鹽等六種逆境條件下的內(nèi)參基因適用性進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)，以作為其它植物的參考。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一種快速、準(zhǔn)確地對(duì)植物內(nèi)參基因進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)的方法，提供了可用于基因表達(dá)分析的合適內(nèi)參基因。
[0005]一種快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，包括如下步驟:
[0006]( I)確定目標(biāo)植物種類和目標(biāo)基因，并目標(biāo)植物其進(jìn)行前處理，提取目標(biāo)植物的總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR的為模板，選擇多個(gè)在其它物種中常用的并在轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)較穩(wěn)定的多個(gè)內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因的數(shù)量大于等于9，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，得到CT值；
[0007](2)將所述CT值數(shù)據(jù)通過geNorm、NormFinde;r、BestKeeper三種軟件分析其適用性，然后用R軟件的RankAggreg程序包，將每個(gè)處理里得到的四組適用性排序數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)平均聚合，得到所述多個(gè)基因的最終適用性排序。
[0008]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中所述目標(biāo)植物為草本糧食作物或木本植物，所述前處理為環(huán)境脅迫處理，為脫落酸處理、寒冷處理、脫水處理、干旱處理、短期鹽脅迫處理或長(zhǎng)期鹽脅迫處理中的一種或幾種。
[0009]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中所述目標(biāo)植物為水稻、小麥、玉米、大豆、楊樹、松樹、柏樹、杉木、蘋果樹、梨樹、葡萄、橙子。[0010]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中所述目標(biāo)植物為胡楊。
[0011]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中所述步驟(1)具體為:確定目標(biāo)植物為胡楊，對(duì)胡楊進(jìn)行前處理，用CTAB法氯仿抽提提取胡楊葉片的總RNA，從擬南芥、水稻研究中找到常用來作為內(nèi)參基因的基因，以及已有的胡楊的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共挑出16個(gè)候選的內(nèi)參基因，分別為18S、60S、Actin, Cpn60 β、EFl α、eIF_5A、GAPDH、GII α、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB 和 UBQ,以及三個(gè)用于檢測(cè)內(nèi)參基因適用性的三個(gè)目標(biāo)基因PePYLl、PeSCOF-1和PeSCL7，對(duì)每個(gè)所述目標(biāo)基因用Primer6軟件設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)16個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，20ul的反應(yīng)體系含有l(wèi)OulSuperReal PreMix Plus, Iul 的 sscDNA,對(duì)應(yīng)約 9ng 的 RNA, 2ul 的 ROX reference Dye,上下游各0.3uM的引物，反應(yīng)條件為95°C 5min，95°C 15s60°C 60s共40個(gè)循環(huán)，然后溫度由40°C到100°C升溫，每個(gè)溫度下記錄熒光值來獲得溶解曲線，其中重復(fù)數(shù)為3，得到CT值。
[0012]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中所述前處理包括如下步驟:
[0013]在每年的四月份取來自新疆維吾爾族自治區(qū)的胡楊仔苗，四月上旬種植于直徑60cm高50cm的圓盆內(nèi)，每盆3_5棵，土壤以沙土為主，含有少量蛭石和花卉營(yíng)養(yǎng)土，每周澆兩次水，待小苗生長(zhǎng)3-4個(gè)月，即七月初或月末，苗高60~80cm的時(shí)候進(jìn)行環(huán)境脅迫處理，所述環(huán)境脅迫處理方法為以下方法中的一種或幾種:
[0014]A、脫落酸處理:對(duì)胡楊小苗葉面噴灑200mM ABA溶液，溶液由ABA固體粉末配制而成，處理時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，未噴灑ABA溶液的植株作為對(duì)照；
[0015]B、冷處理，將胡楊小苗連盆放在4_6°C的環(huán)境下，室溫約25°C度下的植株作為對(duì)照，保持對(duì)照和處理的光照一致，處理時(shí)間12h ；
[0016]C、脫水處理，從土壤中避免損傷根的前提下取出小苗，洗盡根部泥土直接裸露放置于濕度70%、溫度25°C的環(huán)境下，正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照，處理時(shí)間12h ；
[0017]D、干旱處理；通過澆水量控制相對(duì)土壤水分(RSMC)含量75%_10%，呈六個(gè)梯度，一直充分澆水的植株RSMC約75%-70%的作為對(duì)照，處理時(shí)間為一個(gè)月；
[0018]E、短期鹽處理，將土壤中移出未傷根的胡楊苗洗盡根部泥土后水培于含有350mMNaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作為對(duì)照，每隔6h換一次水避免根部缺氧，處理時(shí)間12h ；
[0019] F、長(zhǎng)期鹽脅迫，對(duì)長(zhǎng)有胡楊苗的盆澆200mM NaCl水溶液2L，之后維持正常不含鹽溶液的水25d ；
[0020]其中，每種處理6個(gè)梯度，每個(gè)梯度三盆植物材料；在ΑΒΑ、冷、脫水、短期鹽脅迫處理1、3、6、9、12小時(shí)的時(shí)候，在長(zhǎng)期鹽脅迫5、10、15、20、25天的時(shí)候，干旱脅迫控制RSMC —個(gè)月后，取20-30片同一位置的葉子速凍于液氮中，然后再放置于_80°C保存材料。
[0021]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中在提提取胡楊葉片的總RNA操作過程的最后一步用DNA酶消化，用Thermo NanoDrop2000測(cè)RNA的濃度，通過測(cè)0D26(i/0D28(i以及0D26(i/0D23(i兩個(gè)值來檢測(cè)RNA的純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)RNA的質(zhì)量，Agilent2100微流控芯片檢測(cè)RNA是否降解，每個(gè)處理每個(gè)梯度取1.8μ g的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將得到的cDNA稀釋8_10倍，保持終濃度的一致。[0022]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中所述步驟(2)具體包括如下步驟:先將CT值的平均值對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后輸入geNorm軟件，通過M值的大小對(duì)16個(gè)基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，將對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換未經(jīng)過平均的三組CT值輸入NormFinder分析stab值，并根據(jù)stab值的由小到大對(duì)對(duì)16個(gè)基因的穩(wěn)定性進(jìn)行1-16的排序,BestKeeper通過CV值得出穩(wěn)定性排名并通過r2算出關(guān)聯(lián)性排名，將得到的四組排名用R軟件的RankAggreg程序包進(jìn)行加權(quán)平均聚合，得到16個(gè)基因的最終穩(wěn)定性排序，其中需要使用的內(nèi)參基因的數(shù)目由geNorm軟件算出的PV值進(jìn)行確定。
[0023]本發(fā)明所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其中16個(gè)候選的內(nèi)參基因，18S、60S、Actin, Cpn60 β、EFl α、eIF_5A、GAPDH、GII α、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID N0:32所示，三個(gè)用于檢測(cè)內(nèi)參基因適用性的三個(gè)目標(biāo)基因PePYLl、PeSCOF-1和PeSCL7的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:33~SEQ ID NO:38所示。
[0024]本發(fā)明快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法與現(xiàn)有技術(shù)不同之處在于:
[0025]本發(fā)明快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法簡(jiǎn)單易行，基于快速對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，僅需要提取目標(biāo)植物的總RNA，選擇常用的多個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)突光定量PCR反應(yīng),得到CT值，并通過geNorm、NormFinder> BestKeeper三種軟件分析其適用性，然后用R軟件的RankAggreg程序包，將每個(gè)處理里得到的四組適用性排序數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)平均聚合，得到所述多個(gè)基因的最終適用性排序，對(duì)三種結(jié)果進(jìn)行疊加和歸一化處理，再用qBasePlus對(duì)實(shí)驗(yàn)體系和結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證，能夠快速而系統(tǒng)完整的得到可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。比起傳統(tǒng)的只用單一的一種分析方法，該方法的可信度高，結(jié)果更準(zhǔn)確，應(yīng)用性更強(qiáng)，本發(fā)明所述方法結(jié)果準(zhǔn)確。另外，本研究建立了在六種環(huán)境脅迫處理?xiàng)l件下對(duì)胡楊內(nèi)參基因的適用性進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)，可作為其它植物物種的參考，為今后植物內(nèi)參基因適用性的研究奠定了 基礎(chǔ)。
[0026]本發(fā)明快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)任何一個(gè)已獲得全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)或EST數(shù)據(jù)的植物物種，包括草本主糧作物水稻、小麥、玉米、大豆等，或者木本植物楊樹、松樹、柏樹、杉木等以及經(jīng)濟(jì)林木本植物果樹類蘋果樹、梨樹、葡萄內(nèi)參基因的鑒定和評(píng)價(jià)，對(duì)于推動(dòng)揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆機(jī)理等基礎(chǔ)性研究和培育速生、抗逆、豐產(chǎn)的植物新品種等應(yīng)用型研究，都具有十分重要的意義。
[0027]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法作進(jìn)一步說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明所述方法的流程示意圖；
[0029]圖2是本發(fā)明方法中16個(gè)內(nèi)參基因PCR的特異性檢測(cè)，兩端為Marker ；
[0030]圖3是本發(fā)明方法中對(duì)所得到的CT值的離散性進(jìn)行分析；
[0031]圖4是本發(fā)明方法中通過geNorm算出的M值對(duì)16個(gè)基因在六種處理下的穩(wěn)定進(jìn)行排序，其中包括綜合起來的數(shù)據(jù)Total ；
[0032]圖5是本發(fā)明方法中使用RankAggreg對(duì)得到的四組排名進(jìn)行加權(quán)平均聚合，得到最終的排序結(jié)果；其中，筆直的黑色線是CE，有彎曲的黑色線代表Mean ；[0033]圖6是本發(fā)明方法中選擇鑒定出的最適合的或者最不適合的內(nèi)參基因?qū)ePYLl、PeSCOF-1、PeSCL7三個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。
【具體實(shí)施方式】
[0034]實(shí)施例1
[0035]如圖1所示，一種快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，包括如下步驟:
[0036]確定目標(biāo)植物為胡楊，確定目標(biāo)基因?yàn)镻ePYLl、PeSCOF-1、PeSCL7三個(gè)基因；
[0037]在每年的四月份取來自新疆維吾爾族自治區(qū)的胡楊仔苗，約四月初旬種植于直徑約60cm高約50cm的圓盆內(nèi)，每盆3_5棵，土壤以沙土為主，含有少量蛭石和花卉營(yíng)養(yǎng)土，每周澆兩次水，待小苗生長(zhǎng)3-4個(gè)月，即七月初或月末，苗高約60~80cm的時(shí)候進(jìn)行6種環(huán)境脅迫處理:脫落酸處理，對(duì)胡楊小苗葉面噴灑200mM ABA溶液，溶液由ABA固體粉末配制而成，處理時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，未噴灑ABA溶液的植株作為對(duì)照；冷處理，將胡楊小苗連盆放在4-6°C的環(huán)境下，室溫約25°C度下的植株作為對(duì)照，保持對(duì)照和處理的光照一致，處理時(shí)間12h ;脫水處理，從土壤中避免損傷根的前提下取出小苗，洗盡根部泥土直接裸露放置于濕度70%、溫度25°C的環(huán)境下，正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照，處理時(shí)間12h ;干旱處理；通過澆水量控制相對(duì)土壤水分(RSMC)含量75%-10%，呈六個(gè)梯度，一直充分澆水的植株RSMC約75%-70%的作為對(duì)照，處理時(shí)間為一個(gè)月；短期鹽處理，將土壤中移出未傷根的胡楊苗洗盡根部泥土后水培于含有350mM NaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作為對(duì)照，每隔6h換一次水避免根部缺氧，處理時(shí)間12h ;長(zhǎng)期鹽脅迫，對(duì)長(zhǎng)有胡楊苗的盆澆200mM NaCl水溶液2L，之后維持正常不含鹽溶液的水25d。其中每種處理6個(gè)梯度，每個(gè)梯度三盆植物材料。在ΑΒΑ、冷、脫水、短期鹽脅迫處理1、3、6、9、12小時(shí)的時(shí)候，在長(zhǎng)期鹽脅迫5、10、15、20、25天的時(shí)候，干旱脅迫控制RSMC —個(gè)月后，取20-30片同一位置的葉子速凍于液氮中，然后再放置于-80°C保存材料。
[0038]取_80°C保存的材料在液氮條件下用研缽和杵研磨成粉末，并用CTAB法氯仿抽提提取胡楊葉片的總RNA，在操作過程的最后一步用DNA酶消化可能殘留的DNA以免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾，并用Thermo NanoDrop2000測(cè)RNA的濃度，以及通過測(cè)0D26(l/0D28(l以及OD26tl/OD230兩個(gè)值來檢測(cè)RNA的純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)RNA的質(zhì)量，Agilent2100微流控芯片檢測(cè)RNA是否降解，三種方法并用以獲得高質(zhì)量的RNA確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。每個(gè)處理每個(gè)梯度取1.8 μ g的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將得到的cDNA稀釋8_10倍，保持終濃度的一致。
[0039]從擬南芥、水稻等研究中找到常用來作為內(nèi)參基因的基因，以及已有的胡楊的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共挑出16個(gè)候選的內(nèi)參基因，它們是:18S(18S核糖體RNA基因)、60S^0S核糖體蛋白)、Actin(肌動(dòng)蛋白)、Cpn60i3 (60-KD伴侶蛋白β亞家族)、EFl α (延伸因子I α家族)、eIF_5A(真核翻譯起始因子5A)、GAPDH(甘油醛_3_磷酸脫氫酶)、GII α (葡萄糖苷酶IIa亞家族)、HIS(組氨酸家族蛋白)、LIPL(類脂質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白)、LTP(脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白)、RA(羧化/加氧酶活化蛋白)、RP(核糖體L27e蛋白家族)、RPL17(核糖體蛋白L17)、TUB(微管蛋白)、UBQ(泛素蛋白家族)以及三個(gè)用于檢測(cè)內(nèi)參基因適用性的三個(gè)基因PePYLl (ABA受體蛋白I)、PeSCOF-1 (鋅指蛋白)、PeSCL7 (植物特異性SC7轉(zhuǎn)錄因子)，對(duì)每個(gè)基因用Primere軟件設(shè)計(jì)特異性引物。對(duì)16個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析(qRT-PCR)，20ul 的反應(yīng)體系含有 IOul SuperReal PreMix Plus，Iul 的 sscDNA (對(duì)應(yīng)約9ng的RNA),2ul的ROX reference Dye,上下游各0.3uM的引物，反應(yīng)條件為95°C 5min,95°C 15S60°C60S共40個(gè)循環(huán)，然后溫度由40°C到100°C升溫，每個(gè)溫度下記錄熒光值來獲得溶解曲線，其中重復(fù)數(shù)為3。獲得CT值，對(duì)得到的CT值進(jìn)行離散性分析，分析結(jié)果如圖3所示。16個(gè)內(nèi)參基因PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果見圖2，兩端為Marker，片段大小如圖2所示。16 個(gè)候選的內(nèi)參基因，185、605、六。衍11、0?1160 3、EF1 a、eIF_5A、GAPDH、GII α、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ IDNO:32所示，三個(gè)用于檢測(cè)內(nèi)參基因適用性的三個(gè)目標(biāo)基因PePYLUPeSCOF-1和PeSCL7的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0:33~SEQ ID N0:38所示。16個(gè)內(nèi)參基因的信息如表1所示，按表1中的引物從上至下38個(gè)引物的序號(hào)分別為SEQ ID NO:1~SEQ IDN0:38。
[0040]表1.本發(fā)明中16個(gè)內(nèi)參基因及三個(gè)目的基因的基因名、功能注釋、引物序列、擴(kuò)增長(zhǎng)度、PCR效率
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)確定目標(biāo)植物種類和目標(biāo)基因，并目標(biāo)植物其進(jìn)行前處理，提取目標(biāo)植物的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR的為模板，選擇多個(gè)在其它物種中常用的并在轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)較穩(wěn)定的多個(gè)內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因的數(shù)量大于等于9，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，得到CT值； (2)將所述CT值數(shù)據(jù)通過geNorm、NormFinder>BestKeeper三種軟件分析其適用性，然后用R軟件的RankAggreg程序包，將每個(gè)處理里得到的四組適用性排序數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)平均聚合，得到所述多個(gè)基因的最終適用性排序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:所述目標(biāo)植物為草本糧食作物或木本植物，所述前處理為環(huán)境脅迫處理，為脫落酸處理、寒冷處理、脫水處理、干旱處理、短期鹽脅迫處理或長(zhǎng)期鹽脅迫處理中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:所述目標(biāo)植物為水稻、小麥、玉米、大豆、楊樹、松樹、柏樹、杉木、蘋果樹、梨樹、葡萄、橙子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:所述目標(biāo)植物為胡楊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:所述步驟(1)具體為:確定目標(biāo)植物為胡楊，對(duì)胡楊進(jìn)行前處理，用CTAB法氯仿抽提提取胡楊葉片的總RNA，從擬南芥、水稻研究中找到常用來作為內(nèi)參基因的基因，以及已有的胡楊的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，共挑出16個(gè)候選的內(nèi)參基因，分別為18S、60S、Actin, Cpn60 β、EFla、eIF-5A、GAPDH、GII a、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB 和 UBQ,以及三個(gè)用于檢測(cè)內(nèi)參基因適用性的三個(gè)目標(biāo)基因PePYLl、PeSCOF-1和PeSCL7，對(duì)每個(gè)所述目標(biāo)基因用Primer6軟件設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)16個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析，20ul的反應(yīng)體系含有IOul SuperReal PreMix Plus, Iul 的 sscDNA,對(duì)應(yīng)約 9ng 的 RNA, 2ul 的 ROX referenceDye，上下游各0.3uM的引物，反應(yīng)條件為 95°C 5min，95°C 15s60°C 60s共40個(gè)循環(huán)，然后溫度由40°C到100°C升溫，每個(gè)溫度下記錄熒光值來獲得溶解曲線，其中重復(fù)數(shù)為3，得到CT值。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:所述前處理包括如下步驟: 在每年的四月份取來自新疆維吾爾族自治區(qū)的胡楊仔苗，四月上旬種植于直徑60cm高50cm的圓盆內(nèi)，每盆3-5棵，土壤以沙土為主，含有少量蛭石和花卉營(yíng)養(yǎng)土，每周澆兩次水，待小苗生長(zhǎng)3-4個(gè)月，即七月初或月末，苗高60~80cm的時(shí)候進(jìn)行環(huán)境脅迫處理，所述環(huán)境脅迫處理方法為以下方法中的一種或幾種: A、脫落酸處理:對(duì)胡楊小苗葉面噴灑200mMABA溶液，溶液由ABA固體粉末配制而成，處理時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，未噴灑ABA溶液的植株作為對(duì)照； B、冷處理，將胡楊小苗連盆放在4-6°C的環(huán)境下，室溫約25°C度下的植株作為對(duì)照，保持對(duì)照和處理的光照一致，處理時(shí)間12h ； C、脫水處理，從土壤中避免損傷根的前提下取出小苗，洗盡根部泥土直接裸露放置于濕度70%、溫度25°C的環(huán)境下，正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照，處理時(shí)間12h ； D、干旱處理；通過澆水量控制相對(duì)土壤水分(RSMC)含量75%-10%，呈六個(gè)梯度，一直充分澆水的植株RSMC約75%-70%的作為對(duì)照，處理時(shí)間為一個(gè)月； E、短期鹽處理，將土壤中移出未傷根的胡楊苗洗盡根部泥土后水培于含有350mMNaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作為對(duì)照，每隔6h換一次水避免根部缺氧，處理時(shí)間12h; F、長(zhǎng)期鹽脅迫，對(duì)長(zhǎng)有胡楊苗的盆澆200mMNaCl水溶液2L，之后維持正常不含鹽溶液的水25d ； 其中，每種處理6個(gè)梯度，每個(gè)梯度三盆植物材料；在ΑΒΑ、冷、脫水、短期鹽脅迫處理1、3、6、9、12小時(shí)的時(shí)候，在長(zhǎng)期鹽脅迫5、10、15、20、25天的時(shí)候，干旱脅迫控制RSMC —個(gè)月后，取20-30片同一位置的葉子速凍于液氮中，然后再放置于_80°C保存材料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:在提提取胡楊葉片的總RNA操作過程的最后一步用DNA酶消化，用Thermo NanoDrop2000測(cè)RNA的濃度，通過測(cè)OD26tZOD28tl以及OD26tZOD23tl兩個(gè)值來檢測(cè)RNA的純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)RNA的質(zhì)量，Agilent2100微流控芯片檢測(cè)RNA是否降解，每個(gè)處理每個(gè)梯度取1.8 μ g的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將得到的cDNA稀釋8_10倍，保持終濃度的一致。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:所述步驟(2)具體包括如下步驟:先將CT值的平均值對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后輸入geNorm軟件，通過M值的大小對(duì)16個(gè)基因的穩(wěn)定性進(jìn)行排序，將對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換未經(jīng)過平均的三組CT值輸入NormFinder分析stab值,并根據(jù)stab值的由小到大對(duì)對(duì)16個(gè)基因的穩(wěn)定性進(jìn)行1_16的排序，BestK^per通過CV值得出穩(wěn)定性排名并通過r2算出關(guān)聯(lián)性排名，將得到的四組排名用R軟件的RankAggreg程序包進(jìn)行加權(quán)平均聚合，得到16個(gè)基因的最終穩(wěn)定性排序，其中需要使用的內(nèi)參基因的數(shù)目由geNorm軟件算出的PV值進(jìn)行確定。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速鑒定和評(píng)價(jià)植物內(nèi)參基因適用性的方法，其特征在于:16 個(gè)候選的內(nèi)參基因，185、605、六。衍11、0?1160 3、EF1 a、eIF_5A、GAPDH、GII a、HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB和UBQ的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQIDNO:32所示，三個(gè)用于檢測(cè)內(nèi)參基因適用性的三個(gè)目標(biāo)基因PePYLUPeSCOF-1和PeSCL7的引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:33~SEQ ID N0:38所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882142SQ201410138424
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】夏新莉, 尹偉倫, 王厚領(lǐng) 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)