一種使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，包括如下步驟：（1）提取胡楊的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR的模板；（2）使用大于等于9個(gè)內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上選擇SYBR?Green法進(jìn)行反應(yīng)，得到CT值；（3）通過(guò)公式和geNorm軟件的PV值計(jì)算功能，以0.15為閾值確定內(nèi)參基因的數(shù)目；（4）根據(jù)所需數(shù)目選擇內(nèi)參基因，和目的基因一起進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，將得到的CT值通過(guò)geNorm軟件，計(jì)算得到目的基因在每個(gè)處理下用多內(nèi)參基因組合得到相對(duì)表達(dá)量的變化數(shù)據(jù)。本發(fā)明所述方法與傳統(tǒng)的單一內(nèi)參基因方法相比，能夠得到更為可靠的結(jié)論。
【專利說(shuō)明】—種使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種使用多內(nèi)參基因組合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究胡楊抗逆關(guān)鍵基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]胡楊(Populus euphratica Oliv)是第三世紀(jì)殘余的古老樹種,在6000多萬(wàn)年前就在地球上生存，分布于亞非荒漠地區(qū)，并且是唯一能在世界最大的流動(dòng)性沙漠，塔克拉瑪干沙漠，生長(zhǎng)并建群的喬木樹種，長(zhǎng)期適應(yīng)干旱鹽堿和溫差劇烈變化的極端沙漠環(huán)境，進(jìn)化出了完整的應(yīng)對(duì)干旱、鹽堿、低溫等逆境因素的機(jī)制，因此胡楊含有豐富的抗逆性基因資源等待開發(fā)，并且隨著2013年中國(guó)科學(xué)家完成其全基因組測(cè)序工作，對(duì)于林木抗逆性機(jī)理等基礎(chǔ)性研究，和定向培育抗逆造林新品種等應(yīng)用型研究，胡楊將發(fā)揮十分重要的作用。
[0003]具有高度靈敏性、特異性和穩(wěn)定性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)是目前應(yīng)用最廣泛的用于研究基因表達(dá)模式的分子生物學(xué)檢測(cè)方法之一，它能檢測(cè)極低含量的mRNA以及基因在不同樣品間細(xì)微的表達(dá)差異變化，因此qRT-PCR常用來(lái)篩選有研究?jī)r(jià)值的關(guān)鍵基因。然而準(zhǔn)確而又可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果受起始材料的用量、RNA的純度、酶的效率、內(nèi)參基因(內(nèi)源對(duì)照)的選擇等多方面因素的影響，其中穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因是最為關(guān)鍵的如提條
件。目前最常用的計(jì)算方法2_“CT或者使用單一內(nèi)參基因，目的基因表達(dá)量
的變化高度依賴于所使用的單一內(nèi)參基因表達(dá)量的變化。廣泛的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明內(nèi)參基因可能受不同組織、不同發(fā)育階段或不同環(huán)境脅迫等條件的影響而穩(wěn)定性發(fā)生變化，所以單一內(nèi)參可能導(dǎo)致有偏差不準(zhǔn)確甚至錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低、操作簡(jiǎn)便的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法。
[0005]一種使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，包括如下步驟:
[0006](1)對(duì)胡楊進(jìn)行抗逆脅迫處理，并分別提取胡楊在每個(gè)處理下的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR的模板；
[0007](2)使用多個(gè)胡楊常用的內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因數(shù)量大于等于9，設(shè)計(jì)特異性引物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上選擇SYBR Green法進(jìn)行反應(yīng)，得到CT值；
[0008](3)通過(guò)geNorm軟件的PV值計(jì)算功能，以0.15為閾值確定所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下需要的內(nèi)參基因的數(shù)目η;
[0009](4)根據(jù)所需數(shù)目選擇內(nèi)參基因，將選擇的η個(gè)內(nèi)參基因和目的基因一起進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，將得到的CT值通過(guò)geNorm軟件，得到目的基因在每個(gè)處理下相對(duì)表達(dá)量的
變化數(shù)據(jù)，采用以下公式計(jì)算:
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)對(duì)胡楊進(jìn)行抗逆脅迫處理，并分別提取胡楊在每個(gè)處理下的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR的模板； (2)使用多個(gè)胡楊常用的內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因數(shù)量大于等于9，設(shè)計(jì)特異性引物在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上選擇SYBR Green法進(jìn)行反應(yīng)，得到CT值； (3)通過(guò)geNorm軟件的PV值計(jì)算功能，以0.15為閾值確定所選擇的實(shí)驗(yàn)條件下需要的內(nèi)參基因的數(shù)目η ； (4)根據(jù)所需數(shù)目選擇內(nèi)參基因，將選擇的η個(gè)內(nèi)參基因和目的基因一起進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，將得到的CT值通過(guò)geNorm軟件，得到目的基因在每個(gè)處理下相對(duì)表達(dá)量的變化數(shù)據(jù)，采用以下公式計(jì)算:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:步驟(2)和(4)的PCR體系均為20 μ 1，加樣順序及用量依次為10 μ 12X SuperReal PreMixPlus, 0.3μ 120μΜ 正向引物，0.3μ 120μΜ 正向引物，I μ I cDNA 模板，2μ 150XROXReference Dye Δ , 6.4 μ I RNase-free ddH20，反應(yīng)程序?yàn)?95°C 15min,95°C 20s60°C 60s循環(huán)數(shù)45，得到溶解曲線。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:步驟(2)中使用的內(nèi)參基因?yàn)?6個(gè)，分別為18S、60S、Actin、Cpn60P、EF1 a、eIF_5A、GAPDH、GII a , HIS、LIPL、LTP、RA、RP、RPL17、TUB 和 UBQ, 16 個(gè)候選的內(nèi)參基因引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO: 32所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:所述環(huán)境脅迫處理為脫落酸處理、寒冷處理、脫水處理、干旱處理、短期鹽脅迫處理或長(zhǎng)期鹽脅迫處理中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:目的基因?yàn)镻eSCL7，其引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:37~SEQ ID N0:38所示，抗脅迫處理方式為脫水處理O、1、3、6、9、12小時(shí)，步驟(4 )中n=3，3個(gè)內(nèi)參基因分別為HIS、60S 和 Actin0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:步驟(4)中目的基因?yàn)?PePYLl，PeSCOF-1、PeCDPK6、PeCHYI 或PeWRKYl，其中 PePYLl，PeSCOF-1引物對(duì)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:33~SEQ ID N0:36所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:所述抗逆脅迫處理包括如下步驟:在每年的四月份取來(lái)自新疆維吾爾族自治區(qū)的胡楊仔苗，四月上旬種植于直徑60cm高50cm的圓盆內(nèi)，每盆3_5棵,土壤以沙土為主,含有少量蛭石和花卉營(yíng)養(yǎng)土，每周澆兩次水，待小苗生長(zhǎng)3-4個(gè)月，即七月初或月末，苗高60~80cm的時(shí)候進(jìn)行抗逆脅迫處理，所述抗逆脅迫處理方法為以下方法中的一種或幾種:A、脫落酸處理:對(duì)胡楊小苗葉面噴灑200mMABA溶液，溶液由ABA固體粉末配制而成，處理時(shí)間為12個(gè)小時(shí)，未噴灑ABA溶液的植株作為對(duì)照； B、冷處理，將胡楊小苗連盆放在4-6°C的環(huán)境下，室溫約25°C度下的植株作為對(duì)照，保持對(duì)照和處理的光照一致，處理時(shí)間12h ； C、脫水處理，從土壤中避免損傷根 的前提下取出小苗，洗盡根部泥土直接裸露放置于濕度70%、溫度25°C的環(huán)境下，正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照，處理時(shí)間12h ； D、干旱處理；通過(guò)澆水量控制相對(duì)土壤水分含量75%-10%，呈六個(gè)梯度，一直充分澆水的植株RSMC約75%-70%的作為對(duì)照，處理時(shí)間為一個(gè)月； E、短期鹽處理，將土壤中移出未傷根的胡楊苗洗盡根部泥土后水培于含有350mMNaCl的溶液中，未含NaCl的水培苗作為對(duì)照，每隔6h換一次水避免根部缺氧，處理時(shí)間12h ； F、長(zhǎng)期鹽脅迫，對(duì)長(zhǎng)有胡楊苗的盆澆200mMNaCl水溶液2L，之后維持正常不含鹽溶液的水25d ； 其中，每種處理6個(gè)梯度，每個(gè)梯度三盆植物材料；在ΑΒΑ、冷、脫水、短期鹽脅迫處理1、3、6、9、12小時(shí)的時(shí)候，在長(zhǎng)期鹽脅迫5、10、15、20、25天的時(shí)候，干旱脅迫控制RSMC —個(gè)月后，取20-30片同一位置的葉子速凍于液氮中，然后再放置于_80°C保存材料。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的使用多內(nèi)參基因組合研究胡楊基因的方法，其特征在于:在提取胡楊葉片的總RNA操作過(guò)程的最后一步用DNA酶消化，用Thermo NanoDrop2000測(cè)RNA的濃度，通過(guò)測(cè)OD26tZOD28tl以及0D26(i/0D23(i兩個(gè)值來(lái)檢測(cè)RNA的純度，用1%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè)RNA的質(zhì)量，Agilent2100微流控芯片檢測(cè)RNA是否降解，每個(gè)處理每個(gè)梯度取1.8 μ g的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將得到的cDNA稀釋8_10倍，保持終濃度的一致。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898223SQ201410138911
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】尹偉倫, 夏新莉, 王厚領(lǐng) 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)