專利名稱：綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因的篩選方法。
背景技術(shù)：
隨著對(duì)不同物種全基因組序列的揭曉，基因的定量表達(dá)水平研究在生命科學(xué)領(lǐng)域日趨顯得重要了。RT-PCR技術(shù)作為一種高效的定量PCR技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)其在不同組織、細(xì)胞、個(gè)體以及不同發(fā)育階段或經(jīng)過某種特殊條件處理后的表達(dá)水平。為了去除不同樣本在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)錄效率以及移液器上可能存在的差異而獲得目標(biāo)基因特異性表達(dá)的真正差異，通常選擇特定的內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正。內(nèi)參基因擴(kuò)增中的變化能反映RNA產(chǎn)量、質(zhì)量和/或cDNA合成效率的變化。因此，為減少樣本間的差異選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因是必要的(wong等,2005 ；Nolan等,2006 ；Vandesom等，2002)。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該表達(dá)量適中，不存在假基因，在不同的細(xì)胞、組織中其無顯著性表達(dá)量差異，并且其不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響而體現(xiàn)在表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似(陳鳳花等，2005)。放之四海而皆準(zhǔn)的內(nèi)參基因是不存在的，因此，必須在特定的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)多種內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，從而篩選出符合實(shí)驗(yàn)特定條件的理想內(nèi)參(T h e 11 i η等，1999 ;Sturzenbaum等，2001)。有研究報(bào)道，定量PCR采取單一的內(nèi)參校正與標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因的表達(dá)的研究達(dá)到了 90%以上[69] (suzuki等，2000 ；vandesompel等，2002)其還闡明僅使用單個(gè)內(nèi)參的方法，可能使得實(shí)驗(yàn)表達(dá)數(shù)據(jù)產(chǎn)生二十倍甚至以上的誤差，盲目地使用一個(gè)持家基因作內(nèi)參，不但可能難以發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因的微小差異表達(dá)，甚至可能得出錯(cuò)誤的悖論。根據(jù)Thellin等[7CI], (1999), vandesompele 等，(2002),Brinor 等，(2006)和 PeterSeta[71] (2007)等的研究表明至少要使用兩個(gè)及其以上內(nèi)參基因才能對(duì)定量PCR進(jìn)行準(zhǔn)確的校正。因此，用于評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性的統(tǒng)計(jì)分析軟件geNorm(Vandesompele等,2002)應(yīng)運(yùn)而生。目前，常用的內(nèi)參基因有GAPDH、ACTB、18SrRNA、B2M、TBP、RPL13A等基因。目前，對(duì)于中國美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作為皮膚組織的內(nèi)參基因研究還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因的篩選方法，本發(fā)明解決了目前還沒有對(duì)中國美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作為皮膚組織內(nèi)參基因篩選方法的問題。為解決上述問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因的篩選方法，包括以下步驟—、確定內(nèi)參基因的方法以綿羊皮膚組織為試驗(yàn)樣品，首先，取10_20mg皮膚組織組織液氮中徹底研磨，RNA提取試劑盒對(duì)皮膚組織樣進(jìn)行總RNA提取，I %瓊脂糖凝膠電泳，O. 5 X TBE電泳緩沖液，100V, 15min來檢測(cè)RNA完整性；二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀釋2_10倍，用ddH20將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行測(cè)定RNA純度，取0D260/0D280讀數(shù)在I. 8-2. O之間的RNA樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，計(jì)算RNA終濃度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀釋倍數(shù)η) X 40 ;三、其次，取50ng/ μ L的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參考GenBank中綿羊相應(yīng)基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)并合成18S rRNA、β -Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP 這 6 個(gè)內(nèi)參基因的引物；四、再次，以反轉(zhuǎn)錄合成CDNA為模板，分別以6個(gè)內(nèi)參基因?yàn)橐?，采用SYBRGreen I熒光染料試劑盒，進(jìn)行優(yōu)化條件的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)分析對(duì)象均取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，每次實(shí)驗(yàn)用ddH20作為陰性對(duì)照，讀取實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)檢測(cè)的每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值；五、最后,采用geNorm程序計(jì)算6個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子Vn/n+Ι的配對(duì)差異分析從而判定最適內(nèi)參基因的數(shù)目，同時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度平均值，即M值，并對(duì)其進(jìn)行排序，M值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定，最終篩選出在綿羊皮膚組織中表達(dá)最穩(wěn)定的 內(nèi)參基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三個(gè)內(nèi)參基因。本發(fā)明的技術(shù)效果理想的看家基因應(yīng)在各種實(shí)驗(yàn)因素條件下，各種類型的組織或細(xì)胞中均恒定表達(dá)。大量的研究表明，任何一種內(nèi)參基因的所謂恒定表達(dá)都僅僅是在一定類型的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)因素作用下“有范圍”的恒定。采用傳統(tǒng)的一種內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)化將導(dǎo)致相對(duì)大的誤差；而選擇多種內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)化因子來校正目的基因的表達(dá)效果更好。大量的研究證實(shí)在同一實(shí)驗(yàn)中選用2-4個(gè)內(nèi)參可有效提高目標(biāo)基因的定量準(zhǔn)確性。經(jīng)篩選對(duì)所有組織或細(xì)胞的內(nèi)參基因，最終確定出2個(gè)甚至以上標(biāo)準(zhǔn)作為內(nèi)參基因，從而得出更可信的結(jié)果，該程序?qū)τ谌魏位虻臏?zhǔn)確定量均具有極其重要意義。本發(fā)明在綿羊皮膚組織中同時(shí)使用β -Actin、GAPDH、18SrRNA等3個(gè)內(nèi)參基因，即標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參基因的
循環(huán)閾值計(jì)算公式為
Gt (內(nèi)參基因)\8SrRNA ^ A-Actin ^ GAPDH以校正目的基因表達(dá)水平。本發(fā)明首次利用SYBR Green I特異性地與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光的特性，以LightCycler 2. O為平臺(tái)，建立了中國美利奴羊(新疆型)皮膚組織中GAPDH基因的SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，旨在為進(jìn)一步研究中國美利奴羊(新疆型)相關(guān)基因的定量表達(dá)奠定基礎(chǔ)。為解決這一問題，首先選定合適的內(nèi)參并檢測(cè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性，最終確定出最適內(nèi)參的個(gè)數(shù)，都將需要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)考慮周全。目前，國內(nèi)尚未見綿羊皮膚組織中定量PCR分析基因表達(dá)研究中關(guān)于內(nèi)參基因篩選的相關(guān)報(bào)道。本研究將選擇18SrRNA、ACTB、GAPDH、B2M、TBP、RPL13A等6個(gè)內(nèi)參基因，檢測(cè)其在綿羊皮膚組織中表達(dá)穩(wěn)定性，旨在為后續(xù)RT-PCR最適內(nèi)參基因的選擇奠定基礎(chǔ)。


圖I是本發(fā)明綿羊皮膚組織中總RNA提取檢測(cè)結(jié)果圖；圖中M D2000 marker ;1、
2:細(xì)型細(xì)毛羊mRNA樣品；3、4 :超細(xì)型細(xì)毛羊mRNA樣品；圖2是本發(fā)明GAPDH基因RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果圖；圖中M D2000 marker ;1、2、3、4 :RT-PCR 產(chǎn)物；
圖3是本發(fā)明GAPDH擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比圖；其中a、GAPDH基因擴(kuò)增曲線，b、GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4是本發(fā)明6個(gè)內(nèi)參基因中Log (起始濃度)與循環(huán)閾值Ct線性關(guān)系圖；圖5是本發(fā)明GAPDH基因熔解曲線圖；圖6是本發(fā)明19個(gè)綿羊皮膚組織樣品在6個(gè)內(nèi)參基因中的循環(huán)閾值統(tǒng)計(jì)分析圖；圖7是本發(fā)明內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性平均值圖表；
圖8是本發(fā)明最適標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參基因數(shù)目的確定圖表。
具體實(shí)施例方式下面用最佳的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)的說明。I提取過程綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因的篩選方法，包括以下步驟—、確定內(nèi)參基因的方法以綿羊皮膚組織為試驗(yàn)樣品，首先，取10_20mg皮膚組織組織液氮中徹底研磨，RNA提取試劑盒對(duì)皮膚組織樣進(jìn)行總RNA提取，I %瓊脂糖凝膠電泳，O. 5 X TBE電泳緩沖液，100V, 15min來檢測(cè)RNA完整性；二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀釋2_10倍，用ddH20將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行測(cè)定RNA純度，取0D260/0D280讀數(shù)在I. 8-2. O之間的RNA樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，計(jì)算RNA終濃度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀釋倍數(shù)2-10) X 40 ;三、其次，取50ng/ μ L的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參考GenBank中綿羊相應(yīng)基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)并合成18S rRNA、β -Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP 這 6 個(gè)內(nèi)參基因的引物；四、再次，以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板，分別以6個(gè)內(nèi)參基因?yàn)橐铮捎肧YBRGreen I熒光染料試劑盒，進(jìn)行優(yōu)化條件的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)分析對(duì)象均取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，每次實(shí)驗(yàn)用ddH20作為陰性對(duì)照，讀取實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)檢測(cè)的每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值；五、最后，采用geNorrm程序計(jì)算6個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子Vn/n+Ι的配對(duì)差異分析從而判定最適內(nèi)參基因的數(shù)目，同時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度平均值，即M值，并對(duì)其進(jìn)行排序，M值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定，最終篩選出在綿羊皮膚組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三個(gè)內(nèi)參基因。2具體實(shí)驗(yàn)過程2. I實(shí)驗(yàn)材料2. I. I實(shí)驗(yàn)羊來源及樣品采集本實(shí)驗(yàn)所用19只中國美利奴羊(新疆型)均由新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)提供，其中，9只周歲超細(xì)型細(xì)毛羊，10只周歲細(xì)型細(xì)毛羊，采集其肩胛部皮膚組織樣品液氮中凍存。2. I. 2主要儀器設(shè)備I. BIOFUGE PRIMO R型低溫離心機(jī)美國Thermo公司2. ZHJH C1112B型超凈工作臺(tái)上海智誠3. Eppendorf 移液器德國 Eppendorf 公司4. DK-8P型電熱恒溫水槽國產(chǎn)精宏
5. IKA MS3型圓周振蕩器上海吉延環(huán)境儀器有限公司6. Mini-6K型微型離心機(jī)北京戴美克科技有限公司7. LightCycler 2. O 突光定量 PCR 儀Roche 公司8. My Cycler 型 PCR 儀美國 Bio-Rad 公司9. PowerPac Basic 型電泳儀美國 Bio-Rad 公司10. DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳槽北京六一儀器廠11. NAN0DR0P 2000型分光光度計(jì)美國Thermo公司
12. GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海博訊實(shí)業(yè)有限公司13. LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠14.摩爾Σ H20超純水機(jī)上海摩勒科學(xué)儀器廠15.微波爐國產(chǎn)美的公司16.電冰箱中國海爾公司2. I. 3試劑盒及普通試劑RNA抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒(含IOXRT mix、dNTP混合液、Oligo dT15、Quant Reverse Transcriptase、RNase-free · ddH20)、SYBR Green I 突光染料試劑盒(含2. 5XReal Master Mix、20XSYBR Solution、RNase-free · ddH20)、Taq 酶(含 IOXTaqbuffer>25mmol/LMg2+) > dNTP>D2000> Marker I 等均購自 Tiangen 公司；硼酸、EDTA、瓊脂糖(Agrose H)、溴化乙錠(EB)，無水乙醇、DEPC等試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。2. I. 4溶液與緩沖液的配制(I) I %瓊脂糖lg瓊脂糖，溶于IOOmL O. 5 X TBE，微波爐加熱溶解；(2)2%瓊脂糖2g瓊脂糖，溶于IOOmL O. 5XTBE，微波爐加熱溶解；(3)溴化乙錠 Etfc(10mg/mL) : IOOmL O. 5 X TBE 緩沖液中加入 8 μ L EtBr，完全熔
解后置棕色瓶中招箔包裹4°C保存；(4) 10XTBE 108g Tris 堿、55g 硼酸、9. 3g EDTA 溶于 IOOOmL 去離子水中。2. 2實(shí)驗(yàn)方法2. 2. I內(nèi)參基因引物設(shè)計(jì)參考GeneBank中綿羊相應(yīng)基因的核苷酸序列,采用Primer 5. O軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物(上海)有限公司合成，內(nèi)參基因的基本信息見表2-1。表2-1內(nèi)參基因的基本信息
權(quán)利要求
1.綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 一、確定內(nèi)參基因的方法以綿羊皮膚組織為試驗(yàn)樣品，首先，取10-20mg皮膚組織組織液氮中徹底研磨，RNA提取試劑盒對(duì)皮膚組織樣進(jìn)行總RNA提取，1%瓊脂糖凝膠電泳，O. 5 X TBE電泳緩沖液，100V, 15min來檢測(cè)RNA完整性； 二、取一定量的RNA提取物，用ddH20稀釋2-10倍，用ddH20將分光光度計(jì)調(diào)零，取稀釋液進(jìn)行測(cè)定RNA純度，取0D260/0D280讀數(shù)在I. 8-2. O之間的RNA樣品進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，計(jì)算 RNA 終濃度(ng/ μ L) = (0D260) X (稀釋倍數(shù) 2-10) X 40 ； 三、其次，取50ng/l·!L的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，參考GenBank中綿羊相應(yīng)基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)并合成18S rRNA、β-Actin、GAPDH、B2M、RPL13A、TBP這6個(gè)內(nèi)參基因的引物； 四、再次，以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板，分別以6個(gè)內(nèi)參基因?yàn)橐?，采用SYBRGreen I熒光染料試劑盒，進(jìn)行優(yōu)化條件的實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)分析對(duì)象均取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，每次實(shí)驗(yàn)用ddH20作為陰性對(duì)照，讀取實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)檢測(cè)的每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值； 五、最后，采用geNorm程序計(jì)算6個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子Vn/n+Ι的配對(duì)差異分析從而判定最適內(nèi)參基因的數(shù)目，同時(shí)，統(tǒng)計(jì)分析各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定度平均值，即M值，并對(duì)其進(jìn)行排序，M值越小，基因表達(dá)越穩(wěn)定，最終篩選出在綿羊皮膚組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是18S rRNA、β-Actin、GAPDH三個(gè)內(nèi)參基因。
全文摘要
綿羊皮膚組織中內(nèi)參基因的篩選方法，涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域。步驟確定內(nèi)參基因的方法；取一定量的RNA提取物，用ddH2O稀釋2-10倍；其次，取50ng/μL的RNA樣品作為模板，采用cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；再次，以反轉(zhuǎn)錄合成cDNA為模板，分別以6個(gè)內(nèi)參基因?yàn)橐铮蛔詈?，采用geNorm程序計(jì)算6個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化因子Vn/n+1的配對(duì)差異分析從而判定最適內(nèi)參基因的數(shù)目。本發(fā)明解決了目前還沒有對(duì)中國美利奴羊(新疆型)GAPDH基因作為皮膚組織內(nèi)參基因篩選方法的問題。本發(fā)明利用SYBR Green I特異性與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出熒光的特性，建立了中國美利奴羊(新疆型)皮膚組織中GAPDH基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102839215SQ20121033127
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者田可川, 黃錫霞, 田月珍, 徐新明, 狄江, 哈尼克孜·吐拉甫, 吳偉偉, 付雪峰 申請(qǐng)人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院畜牧科學(xué)研究所