專利名稱：快速檢測皮革真實屬性的試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測皮革真實屬性的試劑盒及其方法。
背景技術(shù)：
PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡稱，是分子生物學(xué)中廣泛運用的一項技術(shù)，主要原理是通過熱循環(huán)，達(dá)到目的基因片段的大量擴(kuò)增。目前這項技術(shù)越來越廣泛地運用于產(chǎn)品檢測之中。例如，運用PCR技術(shù)檢測牛奶或臘腸中的植物成分 等，運用PCR技術(shù)檢測肉骨粉等產(chǎn)品中的動物源性成分等，運用PCR技術(shù)檢測食品中的轉(zhuǎn)基因成分等。皮革主要是由哺乳類動物毛皮加工而成，是我國重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品。天然皮革按其動物來源種類分，主要有牛皮革、羊皮革、豬皮革、馬皮革、兔皮革等。由于天然皮革種類繁多，價格昂貴，一些不法商販為了尋求利益的最大化，以人造革冒充天然皮革，或以低檔皮革冒充高檔皮革，損害了廣大消費者的健康和利益，對社會經(jīng)濟(jì)以及皮革產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了不利的影響。目前，國內(nèi)外皮革材質(zhì)的鑒別主要仍以手摸眼看的感官鑒定方法為主，隨著皮革加工技術(shù)的提高，在某些方面，感官鑒別方法已很難鑒別出皮革種類，急需開發(fā)更為科學(xué)有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，本發(fā)明提供了一種快速檢測皮革真實屬性的試劑盒及其檢測方法。該試劑盒主要是依據(jù)不同種類皮革所承載的遺傳信息存在差異，通過基因檢測技術(shù)特異性地分析皮革樣品中的DNA信息來區(qū)分皮革種類。一種快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，包括(I) DNA提取緩沖液所述DNA提取緩沖液的組成為15 25mg/L十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、90 110nmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、15 25mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA2Na)、I. 3 I. 5mol/L 氯化鈉(NaCl)、0· 09 O. 12g/L 蛋白酶 Κ，0· 9 I. lmol/L 二硫蘇糖醇(DTT)；(2) Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的濃度為125IU ；(3) PCR 反應(yīng)液所述PCR反應(yīng)液的組成為2. 7 3. 3mmol/L氯化鎂，O. 3 O. 5 μ mol/L引物，
O.3 O. 5mmol/L的三磷酸脫氧核苷酸；所述引物為針對動物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2 ；(4)上樣緩沖液所述上樣緩沖液的組成為'2. O 3. Og/L溴酚藍(lán)、350 450g/L蔗糖。在其中一些實施例中，所述引物還包括針對牛、羊、豬、馬或兔的線粒體基因序列的引物。
在其中一個實施例中，所述針對牛線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO :3和SEQID NO :4。在其中一個實施例中，所述針對羊線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO :5和SEQID NO :6。在其中一個實施例中，所述針對豬線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO :7和SEQID NO :8。在其中一個實施例中，所述針對馬線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO :9和SEQID NO 10o在其中一個實施例中，所述針對兔線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO 11和SEQID NO 12ο 一種快速檢測皮革真實屬性的方法，采用上述試劑盒，包括以下步驟(I)制備樣品DNA剪取50cm2左右的經(jīng)酒精浸泡消毒后的皮革樣品，放入碎皮機(jī)中破碎，使用磷酸鹽緩沖溶液在不斷振蕩的條件下浸泡皮革樣品12 16小時，期間每隔2 3小時換一次溶液，以降低皮革試樣中的鹽離子如鉻離子等的含量；浸泡后將皮革樣品再次破碎，取3mL破碎的樣品，加入2mL DNA提取緩沖液，混勻。將離心管置于65°C放置45 60min，不時搖動，使樣品充分裂解；取出，加入ImL飽和氯化鈉溶液，劇烈振蕩3 5min，置于(TC下放置5 lOmin，離心；取上清，用體積比為25 : 24 : I的苯酚氯仿異戊醇混合液進(jìn)行提取，離心；取上清，用體積比為24 I的氯仿異戊醇混合液進(jìn)行提取，離心；取上清，加入異丙醇沉淀核酸，_20°C放置2 4小時，使得異丙醇與核酸充分反應(yīng)，高速離心，獲得DNA沉淀；再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得樣品DNA ；(2) PCR擴(kuò)增反應(yīng)取PCR反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶置于反應(yīng)管中，混勻,加入樣品DNA,離心后置于擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)95°C預(yù)變性5min后，按94°C 30sec,55°C 45sec，72°C 60sec程序進(jìn)行40個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，于4°C結(jié)束反應(yīng)。(3)產(chǎn)物檢測反應(yīng)產(chǎn)物，加上樣緩沖液，充分混勻后點樣，用DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用含溴化己錠染色的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后，置紫外燈下觀察，出現(xiàn)目標(biāo)特異性條帶的為含有某物種基因成分，否則為不含該物種基因成分。皮革制品一般經(jīng)過浸灰、軟化、浸酸、鞣制等過程，這些過程直接影響到DNA的完整性，特別是在皮革鞣制過程中，皮革樣品中的DNA損失嚴(yán)重。此外，皮革樣品基質(zhì)復(fù)雜，含有多種PCR抑制因素，如鹽離子、色素等?？紤]到皮革樣品的特殊性，本發(fā)明中的皮革DNA提取方法采用磷酸鹽緩沖液與皮革材料充分混合的方式降低鹽離子及色素對DNA提取的干擾，利用DNA提取緩沖液裂解皮革組織，釋放核酸。用苯酚、氯仿、異戊醇混合溶液除去溶液中的蛋白，最后用異丙醇在低溫條件下使DNA沉淀，獲得純化的皮革樣品DNA。在獲得較高質(zhì)量的皮革樣品DNA后，篩選特異性引物對所提取皮革中的基因組分進(jìn)行分析檢測。首先采用本發(fā)明開發(fā)的試劑盒檢測皮革中的動物內(nèi)源基因成分，檢測到動物內(nèi)源基因后，再根據(jù)設(shè)計好的特異性的物種專一性基因擴(kuò)增引物，具體鑒別是牛、羊、豬、馬還是兔等物種的基因序列，并進(jìn)行測序驗證實驗結(jié)果。
本發(fā)明針對皮革樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾因素多，且皮革樣品中基因降解較為嚴(yán)重等問題，開發(fā)建立了高效的皮革DNA的提取方法，成功地從上百份不同類型的皮革樣品中提取獲得了較高質(zhì)量的DNA。在改進(jìn)并優(yōu)化了從皮革樣品DNA的提取到PCR檢測一整個過程中的提取試劑與反應(yīng)條件等關(guān)鍵控制性因素，開發(fā)建立了穩(wěn)定性高、快速簡便的一整套皮革真實屬性的基因檢測試劑盒。本發(fā)明從遺傳學(xué)角度對皮革樣品基因成分進(jìn)行分析鑒別，克服了傳統(tǒng)的感官鑒別方法所面臨的難題，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方法重現(xiàn)性好、檢測快速簡便等優(yōu)點，彌補(bǔ)了當(dāng)前皮革基因檢測方法的空白，為皮革種類的鑒定提供了一種精確且易于標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法，為質(zhì)量監(jiān)督等提供了技術(shù)支持，可廣泛應(yīng)用于皮革包括毛皮等樣品基因的提取、皮革品種鑒定等方面，具有良好的經(jīng)濟(jì)社會效益與重大的推廣應(yīng)用價值，對于有效監(jiān)管皮革產(chǎn)品質(zhì)量，保護(hù)廣大消費者利益具有重大意義。


圖I為實施例2的檢測方法中所提取的部分皮革樣品的DNA電泳圖譜；其中，M DNA Marker ;泳道I 3 :提取的牛皮革樣品DNA ;4 6 :提取的羊皮革樣品DNA ;7 9 :提取的豬皮革樣品DNA ；10 12 :提取的馬皮革樣品DNA ；13 16 :提取的兔皮革樣品DNA ；圖2為實施例2的皮革樣品中動物內(nèi)源基因檢測的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；其中，M DNA Marker ；P :陽性對照(牛肉DNA，稀釋至50ng/μ L) ；CK :陰性對照；泳道I 2 :提取的牛皮革樣品DNA ；3 :提取的羊皮革樣品DNA ；4 :提取的豬皮革樣品DNA ；5 :提取的馬皮革樣品DNA ；6 :提取的兔皮革樣品DNA ；圖3為實施例2的牛皮革DNA樣本中牛內(nèi)源基因檢測的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；其中，M DNA Marker ；P :陽性對照(牛肉DNA，稀釋至50ng/μ L) ；CK :陰性對照；1 6 :1 6號牛皮革DNA樣本；圖4為實施例2的羊皮革DNA樣本羊內(nèi)源基因檢測的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；其中，M DNA Marker ；P :陽性對照(羊肉DNA，稀釋至50ng/μ L) ；CK :陰性對照；1 5 :1 5號羊皮革DNA樣本；圖5為實施例2的豬皮革DNA樣本中豬內(nèi)源基因檢測的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；其中，M DNA Marker ；P :陽性對照(豬肉DNA，稀釋至50ng/μ L) ；CK :陰性對照；1 5 :1 5號豬皮革DNA樣本；圖6為實施例2的不同種類皮革DNA樣本中牛內(nèi)源基因檢測的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；其中，M DNA Marker ；P 陽性對照(牛肉DNA,稀釋至50ng/ μ L) ；CK 陰性對照;I 15 :I 15號皮革DNA樣本；圖7為實施例2的不同種類皮革DNA樣本羊內(nèi)源基因檢測的PCR產(chǎn)物電泳圖譜；其中，M DNA Marker ；P :陽性對照(羊肉DNA，稀釋至50ng/μ L) ；CK :陰性對照；1 9 :1 9號皮革DNA樣本。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。為防止提取過程中外源DNA的污染，我們采用無菌濾紙代替皮革樣品作陰性對照，提取方法與皮革樣品完全一致。實施例I快速檢測皮革真實屬性的試劑盒包括以下成分(可供進(jìn)行50份PCR反應(yīng))(I) DNA 提取緩沖液(IOOmL)分別稱取2.00mg CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)、I. 2 Img Tris. HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)、0. 58g EDTA2Na(乙二胺四乙酸二鈉)和8. 18g NaCl于容量瓶中，用水定容至IOOmL,混勻。經(jīng)過120°C、30min,高溫消毒滅菌后,再加入10. OOmg購置的蛋白酶K(購自大連寶生物公司)，15. 43g 二硫蘇糖醇(DTT)。(2) Taq DNA 聚合酶(25 μ I) 購置Taq DNA聚合酶25 μ I共125IU (購自大連寶生物公司)。(3) PCR 反應(yīng)液(1000 μ I)首先制備引物，制備的引物濃度為100nmol/L。按照本領(lǐng)域常規(guī)方法制備引物。在DNA自動合成儀(采用美國ABI公司的ABI3949型全自動DNA合成儀)上按照制造商的說明書進(jìn)行合成。分別合成如下引物動物基因成分通用引物，正向:5，-cctgagaaacggctaccat-3’(SEQ ID NO. I)；動物基因成分通用引物，反向:5，-cgtgtcaggattgggtaat-3’(SEQ ID NO. 2)；牛線粒體基因的正向引物5’-gccatatactctccttggtgaca-3’ (SEQ ID NO. 3)；牛線粒體基因的反向引物5’-gtaggcttgggaatagtacga-3’ (SEQ ID NO. 4)；羊線粒體基因的正向引物5’-tattaggcctcccccttgtt-3’ (SEQ ID NO. 5)；羊線粒體基因的反向引物5’-ccctgctcataagggaatagcc-3’ (SEQ ID NO. 6)；豬線粒體基因的正向引物5’-atgaaacattggagtagtcctactatttacc-3’ (SEQ IDNO. 7)；豬線粒體基因的反向引物5’-ctacgaggtctgttccgatataagg-3’ (SEQ ID NO. 8)；馬線粒體基因的正向引物5’-ccctcaaacatttcatcatgatgaaa-3’(SEQID NO. 9)；馬線粒體基因的反向引物5’-gctcctcaaaaggatatttggcctca-3’ (SEQ IDNO. 10)；兔內(nèi)源基因的正向引物5’-taatcgtcaccgcacatgcc-3，(SEQ ID NO. 11)；兔內(nèi)源基因的反向引物:5，-ctatgtcaggagccccaattatca-3’(SEQ ID NO. 12)；稱取O. 285mg MgCl2,用500 μ L水溶解,經(jīng)過120°C、30min,高溫消毒滅菌后,分別加入O. 5 μ mo I的一對引物和O. 5mmol的三磷酸脫氧核苷酸，用水定容至1000 μ L。(4)上樣緩沖液(100 μ I)分別稱取2. 5g溴酚藍(lán)、400g蔗糖于容量瓶中，用水定容、混勻。實施例2利用實施例I的試劑盒檢測皮革樣品中的基因成分檢測方法包括以下步驟(I)樣品DNA的制備a皮革樣品剪取50cm2左右的經(jīng)酒精浸泡消毒后的皮革樣品，放入碎皮機(jī)中破碎。使用磷酸鹽緩沖溶液在不斷振蕩的條件下浸泡碎皮革樣品12小時，期間每隔2小時換一次緩沖溶液，以降低皮革試樣中的色素及鹽離子如鉻離子等的含量。浸泡后將皮革樣品再次破碎，取3mL破碎的樣品，加入2mL DNA提取緩沖液，混勻。將離心管置于65°C放置45 60min，不時搖動，使樣品充分裂解。取出，加入ImL飽和氯化鈉溶液，劇烈振蕩3 5min，置于0°C下放置5 lOmin，離心。取上清，用體積比為25 : 24 : I的苯酚氯仿異戊醇混合液進(jìn)行提取，離心。取上清，用體積比為24 I的氯仿異戊醇混合液進(jìn)行提取，離心。取上清，力口入異丙醇沉淀核酸，-20°C放置2小時，使得異丙醇與核酸充分反應(yīng)，高速離心，獲得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得樣品DNA。為防止提取過程中外源DNA的污染，采用無菌濾紙代替皮革樣品作陰性對照，提取方法與皮革樣品完全一致。b動物肉類(牛肉、羊肉、豬肉、馬肉、兔肉)樣品分別將牛肉、羊肉、豬肉、馬肉、兔肉等試驗材料，使用經(jīng)過120°C、30min高壓消毒過的固體粉碎機(jī)或研缽粉碎制成粉樣。分別稱取IOOmg研磨粉碎后的樣品于離心管中，加入ImL試劑盒中的DNA提取緩 沖液，混勻。將離心管置于65°C放置60min,不時搖動,使樣品充分裂解。用體積比為24 I的氯仿異戍醇混合液進(jìn)行提取，小心的混合兩相，12000r/min離心5min。將上清液移至
I.5mL離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的異丙醇,充分混勻，12000r/min離心5min,獲得DNA沉淀。再用70%的乙醇溶液洗沉淀物2次，室溫離心12000r/min，5min收集DNA，盡可能除去乙醇。用100 μ I雙蒸水溶解DNA沉淀，使DNA完全溶解后，即得樣品DNA，置于_20°C保存。(2)檢查DNA的純度和含量在石英比色皿中加入50 μ I按10倍稀釋的DNA樣品(5 μ I DNA樣品加水45 μ I混勻)，分別測定DNA樣品在260nm和280nm處的紫外光吸收值，并計算A26(l/A28(l值。A26tl/A280應(yīng)介于I. 7 I. 9之間，低于I. 7則表明制備物中存留顯著蛋白質(zhì)，應(yīng)重新提取DNA ’大于I. 9則表明DNA樣品中含有RNA，此時應(yīng)加入RNA酶進(jìn)行消化。計算DNA濃度10 X A26tl ( μ g/ μ I)。皮革樣品DNA提取結(jié)果見表I。表I.皮革樣品DNA提取結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，其特征在于，包括 (1)DNA提取緩沖液 所述DNA提取緩沖液的組成為15 25mg/L CTAB、90 11OnmoI/L Tris-HCl、15 25mmol/L EDTA2Na'I. 3 I. 5mol/L NaCl、0. 09 O. 12g/L 蛋白酶Κ、0· 9 I. lmol/L DTT ； (2)Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的濃度為125IU ; (3)PCR反應(yīng)液 所述PCR反應(yīng)液的組成為2. 7 3. 3mmol/L MgCl2,0. 3 O. 5ymol/L引物，O. 3 O. Smmol /T, dNTPs ； 所述引物為針對動物源性基因序列的通用引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2 ； (4)上樣緩沖液 所述上樣緩沖液的組成為2. O 3. Og/L溴酚藍(lán)、350 450g/L蔗糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，其特征在于，所述引物還包括針對牛、羊、豬、馬或兔的線粒體基因序列的引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，其特征在于，所述針對牛線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，其特征在于，所述針對羊線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，其特征在于，所述針對豬線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO 7和SEQ ID NO :8。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，其特征在于，所述針對馬線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO 9和SEQ ID NO :10。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測皮革真實屬性的試劑盒，其特征在于，所述針對兔線粒體基因序列的引物為SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12。
8.一種快速檢測皮革真實屬性的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1-7任一項所述的試劑盒，包括以下步驟 (1)制備樣品DNA 剪取經(jīng)酒精浸泡消毒的皮革樣品，破碎，用磷酸鹽緩沖溶液浸泡12 16小時，期間每隔2 3小時換一次溶液，浸泡后再次破碎；取樣品，加入DNA提取緩沖液，混勻，65°C放置45 60min,不時搖動,加入飽和氯化鈉溶液,劇烈振蕩3 5min,0°C下放置5 IOmin ;離心取上清，用體積比為25 24 I的苯酚氯仿異戊醇混合液進(jìn)行提?。浑x心取上清，用體積比為24 I的氯仿異戊醇混合液進(jìn)行提取；離心取上清，加入異丙醇，_20°C放置2 4小時，高速離心，獲得DNA沉淀，再用70%的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得樣品DNA ； (2)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 取PCR反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶置于反應(yīng)管中，混勻,加入樣品DNA,離心后置于擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)95°C預(yù)變性5min后，按94°C 30sec,55°C 45sec，72°C 60sec程序進(jìn)行40個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，于4°C結(jié)束反應(yīng)； (3)產(chǎn)物檢測 反應(yīng)產(chǎn)物，加上樣緩沖液，充分混勻后點樣，用DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用含溴化己錠染色的I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)束后，置于紫外燈下觀察，出現(xiàn)目標(biāo)特異性條帶的為含有某物種基 因成分，否則為不含該物種基因成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測皮革真實屬性的試劑盒及其檢測方法，所述試劑盒包括DNA提取緩沖液、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、上樣緩沖液。本發(fā)明從遺傳學(xué)角度對皮革樣品基因成分進(jìn)行分析鑒別，克服了傳統(tǒng)的感官鑒別方法所面臨的難題，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方法重現(xiàn)性好、檢測快速簡便等優(yōu)點，彌補(bǔ)了當(dāng)前皮革基因檢測方法的空白，為皮革種類的鑒定提供了一種精確且易于標(biāo)準(zhǔn)化的分析方法，為質(zhì)量監(jiān)督等提供了技術(shù)支持，可廣泛應(yīng)用于皮革包括毛皮等樣品基因的提取、皮革品種鑒定等方面，具有良好的經(jīng)濟(jì)社會效益與重大的推廣應(yīng)用價值，對于有效監(jiān)管皮革產(chǎn)品質(zhì)量，保護(hù)廣大消費者利益具有重大意義。
文檔編號C12Q1/68GK102796826SQ20121033109
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者羅海英, 柯振華, 吳玉鑾, 郭新東, 劉春生, 冼燕萍, 陳筱婷, 陳意光, 羅東輝, 吳文海 申請人:廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院