一種快速檢測(cè)農(nóng)作物中代森環(huán)含量的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留分析和免疫分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能識(shí)別代森環(huán)的單克隆抗體制備及其酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明公開了特異性單克隆抗體、包被原、免疫原的制備方法和酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明制備的單抗可以識(shí)別代森環(huán)，本發(fā)明的試劑盒和方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【背景技術(shù)】
[0002]代森環(huán)主要用于蔬菜、果樹上多種病害的防治，對(duì)防治瓜類和白菜的霜霉病及小麥銹病效果也較顯著。代森環(huán)在環(huán)境中的降解產(chǎn)物乙撐硫脲引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物甲狀腺瘤，具有致癌性、致突變型和致畸性，因此安全問題受到高度重視。
[0003]目前，HPLC是測(cè)定代森環(huán)的主要手段，由于這類方法存在分析時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)所需樣品量大、及繁瑣的前處理步驟等不足，不適宜于測(cè)定大量樣品。與此相比，免疫學(xué)方法具有低成本、快速、無需復(fù)雜樣品前處理等特點(diǎn)，可作為一種高效的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004](一)本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便、價(jià)格便宜、便于攜帶、靈敏度高的用于代森環(huán)同時(shí)快速檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、靈敏、適合大量篩選的定量檢測(cè)方法。
[0005](二)本發(fā)明的技術(shù)方案
為解決所述問題，本發(fā)明綜合采用蛋白質(zhì)偶聯(lián)和生物化學(xué)制備等技術(shù)制備了可以識(shí)別代森環(huán)的單克隆抗體。將代森環(huán)與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工免疫抗原和包被抗原；用此人工免疫抗原免疫動(dòng)物制備代森環(huán)的單克隆抗體；將代森環(huán)包被抗原包被吸附于固相載體上；將檢測(cè)用的試劑配置成可直接使用的試劑。使用時(shí)，將代森環(huán)標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品加入代森環(huán)抗體工作液，待測(cè)樣品中殘留的代森環(huán)與固相載體上包被的代森環(huán)抗原競(jìng)爭(zhēng)代森環(huán)單克隆抗體，再加入酶標(biāo)記二抗進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中代森環(huán)殘留呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中代森環(huán)的含量。
[0006]本酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒由下列成分組成:
(1)包被了代森環(huán)抗原的酶標(biāo)板
(2)代森環(huán)抗體
(3)代森環(huán)標(biāo)準(zhǔn)品
(4)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
(5)酶標(biāo)二抗
(6)底物顯色液
(7)洗滌緩沖液
(8)終止液其中，代森環(huán)抗原及代森環(huán)單克隆抗體的制備方法為:
(1)代森環(huán)抗原的合成
將載體蛋白(BSA)的羧基用乙二胺活化，再通過水溶性碳化二亞胺法(EDC)將代森環(huán)與活化載體蛋白(BSA)的氨基相偶聯(lián)制備代森環(huán)抗原。本發(fā)明合成的免疫原采用免疫電泳測(cè)定其純度為98.6%。
[0007](2)代森環(huán)單克隆抗體制備
動(dòng)物免疫程序:采用代森環(huán)抗原為免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫劑量為50 μ g，首次免疫為含弗氏完全佐劑的免疫原，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐劑的免疫原加強(qiáng)免疫，前后共四次，可以得到血液里含有代森環(huán)抗原特異性抗體的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾細(xì)胞。
[0008]細(xì)胞融合與克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，制備雜交瘤細(xì)胞，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆化，篩選能穩(wěn)定分泌代森環(huán)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0009]單克隆抗體的制備與純化:采用體內(nèi)誘生法，將BALB/C小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后采集腹水，經(jīng)硫酸銨鹽析純化，分裝待用，-20°C保存。
[0010]其中，本發(fā)明的試劑盒所用試劑的配制方法如下:
(1)代森環(huán)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)代森環(huán)1mg，精確到0.00001 g，配成1 μ g/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液；使用時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋成所需的濃度(10-1000 ng/mL)；
(2)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為0.05 mol/L Tris-HCl，pH 8.0,0.9%NaCl 的緩沖液；
(3)包被緩沖液為0.1 mol/L 碳酸緩沖液，ρΗ7.8，含 0.05% NaN3，0.9% NaCl ；
(4)封閉液為0.05 mol/L Tris-HCl 溶液，ρΗ8.0，含0.5% BSA,0.9% NaCl,0.04% NaN3 ；
(5)洗滌緩沖液為0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9% NaCl，0.04% Tween20 ；
(6)代森環(huán)單克隆抗體工作液:將抗體用PH7.4,0.02 mol/L，含1%卵清蛋白的磷酸鹽緩沖液稀釋成蛋白濃度為0.1-1 μ g/L使用；
(7)酶標(biāo)二抗工作液:辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗；
(8)底物顯色液A液:過氧化氫或過氧化脲；
(9)底物顯色液B液:鄰苯二胺(0PD)或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；
(10)底物顯色液對(duì)硝基磷酸鹽緩沖液:pH8.1，含有MgCl2 0.01% 100 mmol/LTris-HCl ；
(11)終止液:2mol/L硫酸。
[0011 ] 其中，酶標(biāo)板的包被方法為:包被抗原以合適濃度與包被緩沖液混合，添加于酶標(biāo)板中且置于室溫下反應(yīng)14 h。用洗滌緩沖液洗滌3次后，用封閉緩沖液在37°C進(jìn)行封閉(約1 h)，去除孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0012]本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理和檢測(cè)方法:
將代森環(huán)抗原偶聯(lián)物包被吸附于固相載體上，加入代森環(huán)標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，并加入代森環(huán)抗體工作液，待測(cè)樣品中殘留的代森環(huán)與固相載體上包被的代森環(huán)抗原競(jìng)爭(zhēng)代森環(huán)單克隆抗體，洗滌去除游離的抗原抗體復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記二抗進(jìn)行酶活性放大作用，顯色后終止，測(cè)定樣品的吸光度值，該值與樣品中代森環(huán)殘留呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣品中代森環(huán)的含量。
[0013](三)本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明所制備的能識(shí)別代森環(huán)的酶聯(lián)免疫試劑盒，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可用于定性或定量檢測(cè)果蔬等樣品中代森環(huán)的殘留量；其最低檢測(cè)限為0.01 ng/g，檢測(cè)時(shí)間僅需3小時(shí)。本方法平均回收率為97-121%,批內(nèi)誤差小于8%,批間誤差小于13%。
[0014]本發(fā)明的試劑盒采用高特異性的代森環(huán)單克隆抗體，主要試劑以工作液形式提供，可以減少操作步驟，節(jié)省時(shí)間。
【附圖說明】
[0015]圖1為代森環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1試劑盒組分的制備 1、抗原的合成
a、取載體牛血清白蛋白(BSA)10 g溶于35 mL pH9.6碳酸鹽緩沖液中，加入10g乙二胺進(jìn)行活化；
b、取代森環(huán)1g溶于10 mL 0.5 Μ的氫氧化鈉溶液中；
c、取1g碳化二亞胺溶于5 mL純水，然后加到代森環(huán)溶液中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)；
d、將活化的載體蛋白BSA滴加到代森環(huán)溶液中4°C攪拌反應(yīng)過夜；
e、將反應(yīng)完所獲得的人工抗原對(duì)0.1 Μ的PBS緩沖液透析5天，每天更換緩沖液4次；將獲得的純化的人工抗原經(jīng)超濾濃縮或凍干保存。
[0017]2、代森環(huán)單克隆抗體制備
a、動(dòng)物免疫程序:采用代森環(huán)人工抗原為免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫劑量為50μ g，首次免疫為含弗氏完全佐劑的免疫原，頸背部皮下多點(diǎn)注射，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐劑的免疫原加強(qiáng)免疫，前后共四次，可以得到血液里含有代森環(huán)特異性抗體的小鼠；最后一次免疫后10天，采血，取脾細(xì)胞。
[0018]b、細(xì)胞融合與克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞，按照5:1的比例與小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞雜交融合，制備雜交瘤細(xì)胞，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)