一種水產(chǎn)品細(xì)菌性疾病的快速檢測試劑盒及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速檢測水產(chǎn)品細(xì)菌性疾病的試劑盒，尤其涉及一種水產(chǎn)品細(xì)菌 性疾病的快速檢測試劑盒及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國海水養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，在過去10年間海水養(yǎng)殖產(chǎn)量增加了 5-6倍。但 是，前階段海水養(yǎng)殖的大發(fā)展帶有很大的盲目性、甚至破壞性，導(dǎo)致這兩年海水養(yǎng)殖產(chǎn)量增 長開始放緩，尤其是病害的問題變得愈來愈嚴(yán)重。
[0003] 蝦的常見細(xì)菌性病害有爛鰓病、褐斑病、紅點(diǎn)病三種，一般流行于4月、8月中 旬-10月中旬，爛鰓病在發(fā)病初期，病蝦鰓絲末端開始腐爛，嚴(yán)重時(shí)鰓絲大部分潰爛發(fā)黑， 外部幾丁質(zhì)膜皺縮，病蝦呼吸困難，活動(dòng)遲緩；褐斑病發(fā)病初期，蝦的甲殼上有斑點(diǎn)狀褐黑 色潰瘍，中間凹陷，邊緣往往變白色，嚴(yán)重時(shí)一直腐蝕到甲殼層下面組織，變成褐黑色，褐斑 通常在鰓部、腹部及其附肢上都有出現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)新老幾丁質(zhì)發(fā)生粘連，造成蛻皮困難而致 死；紅點(diǎn)病發(fā)病時(shí)，病蝦的尾部、游泳足、步足上出現(xiàn)紅點(diǎn)，并逐步擴(kuò)大，嚴(yán)重時(shí)引起蝦死亡。
[0004] 蟹常見細(xì)菌性病害有黑鰓病、腐殼病、腸胃炎三種，一般流行于5月、7月-9月，黑 鰓病病發(fā)時(shí)，病蟹鰓部受到致病菌感染，輕時(shí)鰓絲部分呈暗灰色或黑色，重時(shí)鰓絲全部變?yōu)?黑色，病蟹呼吸困難，行動(dòng)遲鈍，輕者有退避能力，重者就陸續(xù)死亡，發(fā)病時(shí)間7-9月份，規(guī) 格在80克/只以上個(gè)體常見發(fā)生，危害很大；腐殼病病發(fā)時(shí)，蟹甲殼受破壞幾丁質(zhì)的細(xì)菌感 染所致，病蟹的甲殼、步足上出現(xiàn)棕色、深褐色或黑色狀病灶，或出現(xiàn)白色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)逐步發(fā) 展連成塊狀，形成黑色潰瘍，嚴(yán)重時(shí)甲殼被侵蝕成孔，嚴(yán)重影響蟹攝食，進(jìn)而導(dǎo)致蟹死亡；腸 胃炎病發(fā)時(shí)，蟹腸胃發(fā)炎，打開病蟹臍蓋，輕壓肛門，可見黃色或淡紅色粘液流出，病蟹很少 攝食，嚴(yán)重的引起死亡。
[0005] 水產(chǎn)品細(xì)菌性病害的主要病原是弧菌、假單胞菌、黃桿菌、氣單胞菌、嗜水氣單胞 菌、哈維氏弧菌等。
[0006] 當(dāng)前病原檢測技術(shù)主要是以下幾種：1、常規(guī)生化檢測技術(shù)，它是將純化后的細(xì)菌 接種到含不同生化物質(zhì)的培養(yǎng)基中，由于不同種的細(xì)菌代謝的物質(zhì)不完全相同，與培養(yǎng)基 中顯色劑反應(yīng)的結(jié)果也不相同，將這些結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株和文獻(xiàn)記錄結(jié)果對照，就可以得出 結(jié)論。這種方法結(jié)果比較準(zhǔn)確，但是十分耗時(shí)，而且對新的種類的檢測結(jié)果并不十分可靠； 2、API-20E等快速細(xì)菌鑒定試劑盒，它采用檢測少數(shù)幾個(gè)生化指標(biāo)后統(tǒng)計(jì)分析得出鑒定結(jié) 論，相對比較節(jié)約時(shí)間，但結(jié)果不太可靠。
[0007] 中國專利公開號CN 1410550A，公開日2003年4月16日，名稱為一種快速檢測對 蝦桃拉病毒試劑盒，該申請案公開了 一種快速檢測對蝦桃拉病毒試劑盒，主要由以下幾種 試劑組成，試劑A，組織裂解液；試劑B :RNA提取液；試劑C :桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其 中含有特定引物TSV-Rl5 ' -TCACCAGGCAGTCCGGCATAAG ;試劑D :PCR反應(yīng)液，其中含有特定引 物TSV-F15' -CGAAAGTTGGGTACACGGCAGA。其不足之處在于，只能檢測一種病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于為了解決現(xiàn)有常規(guī)生化檢測技術(shù)十分耗時(shí)，而且對新的種類的 檢測結(jié)果并不十分可靠的缺陷而提供一種可靠，快速的水產(chǎn)品細(xì)菌性疾病的快速檢測試劑 盒。
[0009] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種水產(chǎn)品細(xì)菌性疾病的快速檢測試劑盒的應(yīng)用。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種水產(chǎn)品細(xì)菌性疾病的快速檢測試劑盒，所述快速檢測試劑盒包括： a) DNA提取試劑一份：含緩沖試劑A和細(xì)胞裂解試劑B，緩沖試劑A含有NaCl 0· 1-0. 3mol/L，pH為L 8-8. 2的三羥基甲基氨基甲烷l-80mmol/L，pH為L 8-8. 2的乙二胺 四乙酸0. l-8mmol/L與體積分?jǐn)?shù)為10-20 %的曲拉通X-100 ;細(xì)胞裂解試劑B含有濃度為 1-lOmg/mL的溶菌酶與pH為7. 8-8. 2的三羥基甲基氨基甲烷l-80mmol/L ;所述快速檢測試 劑盒還包括： b) PCR反應(yīng)試劑甲一份：PCR反應(yīng)試劑甲含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液2-4 μ L、 22-27mmol/L 的氯化鎂溶液 1-3 yL、2. 2-2. 7mmol/L 的 dNTP 1-3 yL、3-7mmol/L 的引物 VPtllO. 1-1 μ L、3-7mmol/L 的引物 VPtl2O. 1-1 μ L、3-7U 的 Taq 酶 0· 1-0. 5 μ L 與無核酸酶滅菌 水 10-15yL ; c) PCR反應(yīng)試劑乙一份：PCR反應(yīng)試劑乙含有10倍聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液2-4 μ L、 22-27mmol/L 的氯化鎂溶液 1-3 yL、2. 2-2. 7mmol/L 的 dNTP 1-3 yL、3-7mmol/L 的引物 VPtl3O. 1-1 μ L、3-7mmol/L 的引物 VPtl4O. 1-1 μ L、3-7U 的 Taq 酶 0· 1-0. 5 μ L 與無核酸酶滅菌 水 10-15yL ; d) PCR雜交液一份：PCR雜交液由20倍檸檬酸鈉緩沖溶液1-5 μ L、體積分?jǐn)?shù)為10%的 十二磺基硫酸鈉溶液0. 1-0. 5 yL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25 %的甲酰胺3-5 yL與50倍Denhardts溶 液1-3 μ L組成。
[0011] 在本技術(shù)方案中，試劑A和試劑B將樣品中的細(xì)菌進(jìn)行裂解，釋放出細(xì)菌DNA，然 后通過PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對樣品釋放出的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，然后將 PCR反應(yīng)產(chǎn)物與PCR雜交液進(jìn)行雜交反應(yīng)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，使得PCR反應(yīng)產(chǎn)物與 基因芯片上的探針雜交形成穩(wěn)定的雙鏈，間接的對待測序列進(jìn)行了定性分析。
[0012] 作為優(yōu)選，VPc^g 16SrRNA 引物 F :GGITTCGGATGTTACAGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO. 1)； VP0Jg 16SrRNA 引物 R :GACGGGCGGTGTGTGCA(SEQ ID NO. 2); VP03指 gyrB-F:TGCACTGCAGAAGCGTCCAGCGATGTATATCGG(SEQ ID N0.3); VP04指 gyrB-R :AGCTGAGCTCCCGGCTGAATCTCCCTCGAC(SEQ ID NO. 4)。
[0013] 在本技術(shù)方案中，VPQ1、VPQ2、VPQ3、VP ciJt為進(jìn)行PCR反應(yīng)的特異引物和必需成分， 是PCR反應(yīng)的主要成分。
[0014] 一種水產(chǎn)品細(xì)菌性疾病的快速檢測試劑盒的應(yīng)用，依次包括以下步驟： 1) 樣品處理：取0. 1-0. 5g樣品，用100-300 μ L的緩沖試劑A懸浮樣品，并將樣品充分 混勾；10000-12000g離心2-4min，留下沉淀，棄上清液； 2) DNA提?。河?00-300 μ L緩沖試劑A再次懸浮步驟1)得到的沉淀，并加入20-80 μ L 細(xì)胞裂解試劑B混勻，室溫下放置4-5min，再在沸水浴中保溫5-10min ;然后10000-12000g 離心8-10min，取上清液，向上清液中加入上清液體積2-4倍的無水乙醇；在室溫下放置 5-10min后，10000-12000離心5-8min ;棄上清液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)75-80%的乙醇洗滌沉淀2-3 次，待乙醇完全揮發(fā)后，將所得沉淀溶于10-50 μ L滅菌雙蒸水中，得到DNA提取液； 3) PCR擴(kuò)增：取步驟2)得到的DNA提取液1-3 μ L與PCR反應(yīng)試劑甲混合，在93-95 °C反 應(yīng) 3-5min，然后 93-95°C變性 0· 5-lmin，在 54-58°C復(fù)性 0· 5-lmin，72°C下延伸 lmin-2min， 然后變性、復(fù)性、延伸步驟循環(huán)30-50次，最后在70-75°C下保溫5-8min，得到一號PCR產(chǎn) 物；另取步驟2)得到的DNA提取液1-3 μ L與PCR反應(yīng)試劑乙混合，在93-95°C反應(yīng)3-5min， 然后 93-95°C變性 0· 5-lmin，在 54-58°C復(fù)性 0· 5-lmin，72°C下延伸 lmin-2min，然后變性、 復(fù)性、延伸步驟循環(huán)30-50次，最后在70-75°C下保溫5-8min，得到二號PCR產(chǎn)物； 4) 雜交反應(yīng)：取2. 5-3. 5 μ L步驟3)得到的一號PCR產(chǎn)物與2. 5-3. 5 μ L步驟3)得到 的二號PCR產(chǎn)物混勻，得到PCR產(chǎn)物，然后與PCR雜交液混勻，3000-3500rpm離心25-35s， 在93-95°C下變性2-4min，然后驟冷冰浴l-3min，得到PCR雜交反應(yīng)液； 5) 點(diǎn)樣檢測：將步驟4)得到PCR雜交反應(yīng)液在基因芯片上均勻點(diǎn)樣，放入40-45°C恒 溫水浴鍋中雜交2-2. 5h，然后移出基因芯片，并在微生物基因芯片監(jiān)測系統(tǒng)軟件判讀，得到 結(jié)果。
[0015] 點(diǎn)樣所用探針為檢測探針與質(zhì)控探針。
[0016] 檢測探針的設(shè)計(jì)：從RDPII (http://rdp. cme. msu. edu/)中下載所需要的細(xì)菌的 核酸序列，分析流程為下載序列數(shù)據(jù)，整理后導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫，抽取所有細(xì)菌的通用引物所包括 的序列，進(jìn)行全局聯(lián)配，根據(jù)聯(lián)配圖得到某指定細(xì)菌的特征區(qū)段，在特征區(qū)域設(shè)計(jì)種特異性 探針，再進(jìn)行引物特異性檢驗(yàn)、性能評價(jià)和分級，調(diào)整Tm值和棄用特異性有問題的探針，最 終得到表1所示的檢測探針序列。
[0017] 表1、檢測探針表
表2、質(zhì)控探針表
表3、基因芯片點(diǎn)樣表
本發(fā)明的主要原理是，試劑A和試劑B將樣品中的細(xì)菌進(jìn)行裂解，釋放出細(xì)菌DNA，然 后通過PCR反應(yīng)試劑進(jìn)行多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，對樣品釋放出的DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，然后將 PCR反應(yīng)產(chǎn)物與PCR雜交液進(jìn)行雜交反應(yīng)，使樣品中的DNA與探針根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則 充分反應(yīng)，帶有熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物與基因芯片上的互補(bǔ)探針雜交結(jié)合形成穩(wěn)定的雙鏈， 然后在微生物基因芯片監(jiān)測系統(tǒng)軟件進(jìn)行判讀，得出定性分析結(jié)果，判定該細(xì)菌的菌屬。
[0018] 本發(fā)明基于核酸的檢測技術(shù)，包括DNA探針和PCR技術(shù)，相對于其它的病原檢測技 術(shù)而言，本發(fā)明的有益效果是： 1) 該方法檢測十分快速，5-6h即可得知檢測結(jié)果，而其他方法則至少需要3天或一個(gè) 星期以上； 2) 該方法檢測靈敏度高； 3) 該方法可以檢測多種細(xì)菌病毒，如黃桿菌屬、嗜冷黃桿菌、弧菌屬、霍亂弧菌、哈維氏 弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、諾卡氏菌屬、嗜水性氣單胞菌、鏈球菌 屬等，而其他檢測方法則只能檢測一種細(xì)菌病毒。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋： 曲拉通X-IOO購自上海研域生物