雙重實時熒光定量pcr檢測引發(fā)心內(nèi)膜炎的巴爾通體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學檢測領(lǐng)域，具體地說，涉及一種雙重實時熒光定量PCR檢 測引發(fā)心內(nèi)膜炎的巴爾通體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 心內(nèi)膜炎（IE)是一類嚴重危害身體健康、臨床表現(xiàn)非常復雜且檢測很困難的疾 病，該病的病因復雜，依據(jù)起初臨床表現(xiàn)、潛在心臟疾病、涉及病原微生物和并發(fā)癥存在與 否等表現(xiàn)出各種各樣的形式，其治療需內(nèi)科醫(yī)生、心臟病專家、外科醫(yī)生、微生物學家、傳染 病專家、神經(jīng)學家、神經(jīng)外科學家、放射科學家和病理學家等的會診與治療。自從磺胺類藥 和青霉素出現(xiàn)，IE治療得到了很大改觀，不再是普遍致命性的疾病。在過去30年里，預防 和治療水平雖然有了很大提高，但發(fā)病率和死亡率依然比較高，每年發(fā)病率為3~10例 /100000人，住院死亡率為9. 6%~26. 0%。Netzer等報道IE死亡率在20世紀50年代 約為40. 0 %~60. 0%，20世紀70年代到80年代降到約為30. 0%，1980~1995年約為 16. 0%~27. 0%。Slipczuk等研宄近五十年IE流行病顯示在20世紀70年代住院死亡率 為24. 4 %~36. 8 %，并且之后一直保持在這個水平。
[0003] 引起 IE 病原體有鏈球菌（Streptococcus spp.)、葡萄球菌（Staphylococcus spp·)、柯克斯體（Coxiella spp·)、巴爾通體（Bartonella spp·)、衣原體（Chlamydia spp.)、棒狀桿菌（Corynebacterium spp.)、布魯氏菌（Brucella spp.)、腸桿菌科 (Enterobacteriaceae spp.)和真菌等。其診斷方法主要依據(jù)微生物學檢查，比如血液及瓣 膜組織培養(yǎng)分離病原體、血清學、組織病理學和核酸分子診斷。報道BCNE患者在IE患者中 約占2. 5%~31.0%，主要是由于一類營養(yǎng)條件要求苛刻、生長緩慢、難以培養(yǎng)的病原體， 即巴爾通體與柯克斯體引起，其中BE發(fā)病率在IE患者中約占4. 5%。Slipczuk等報道全 世界BCNE患者在20世紀60年代約占18%，20世紀70年代約占14%，20世紀80年代約占 23%，20世紀90年代約占20%，21世紀前十年約占14%，近十年處于下降趨勢。英國報道 倫敦圣托馬斯醫(yī)院1975~2000年516份心內(nèi)膜炎病例，研宄顯示BCNE患者約占12. 2%， BE發(fā)病率在BCNE患者中約占11%。在法國BE發(fā)病率在IE患者中約占30%，在巴西BE患 者在BCNE患者中約占3. 9%。
[0004] 收集了 1993~2013年英國、法國、美國、印度、瑞典和希臘等全世界范圍內(nèi)報道的 52篇文獻，共計538例BE，其中47篇文獻詳細描述110例患者情況，5篇文獻只報道BE病 例數(shù)共428例。統(tǒng)計時剔除重疊病例報道。綜合各種方法檢測感染人心內(nèi)膜炎的巴爾通體 主要有8種，在110個病例患者中，由Bq感染的患者占50.0% (55例），Bh占23. 6% (26 例），另外Bvb (2例）、Bva(5例）、Ba(2例）、Be (1例）、Bk(l例）和Bm(l例），未確定種 的患者有17例。發(fā)現(xiàn)Bh和Bq為主要的病原體，此外也可引起人類CSD、戰(zhàn)壕熱和BA等多 種疾病。此外報道至少有6種巴爾通體可引起動物感染心內(nèi)膜炎，分別為Bq、BK Bvb、Bc、 B.bovis (牛巴爾通體）和 B.washoensis。
[0005] 目前，對Bh和Bq檢測方法主要是分離培養(yǎng)、血清學檢測、常規(guī)PCR和實時熒光定 量PCR檢測。巴爾通體菌生長緩慢、營養(yǎng)條件要求苛刻且難于分離培養(yǎng)，液體培養(yǎng)時生長相 對比較快。血清學檢測通常用IFA法和ELISA法檢測抗體，結(jié)果判讀存在主觀因素，靈敏度 和特異性均不高，不能很好區(qū)分Bq和Bh，且易與衣原體等其他微生物出現(xiàn)交叉反應。常規(guī) PCR檢測存在引物結(jié)合缺乏特異性、實驗室污染和臨床樣品中PCR抑制物存在造成假陰性 等，在基因擴增后還需電泳測序來驗證，相對耗時，成本也比較高。實時熒光探針PCR方法 依據(jù)序列特異性探針區(qū)別物種，增加了特異性和靈敏度，但需要合成探針價格比較貴，目前 國外報道實時熒光探針PCR方法檢測巴爾通體屬，國內(nèi)本實驗室已建立了檢測Bvb單重實 時熒光定量PCR探針法，其他實驗室報道采用TaqMan-MGB探針技術(shù)建立了檢測Bh和Bq單 重實時熒光定量PCR方法，但是一個PCR體系只能檢測一種或一類病原體，不能同時檢測多 種病原體。近年來多重實時熒光定量PCR探針法的應用越來越廣泛，該技術(shù)是幾種熒光探 針混合在一起，根據(jù)各自探針熒光顏色不同可在單一管中有效的區(qū)分多種病原體，節(jié)省樣 本、節(jié)約試劑、降低成本和加速實驗進程等。目前國內(nèi)外尚無應用雙重探針法同時檢測Bh 和Bq的報道，雙重PCR方法具有高效性、節(jié)約時間、節(jié)省樣本等優(yōu)點，在原來單重PCR基礎(chǔ) 上提高50 %的效率等。因此有必要建立了雙重實時熒光定量PCR探針法用以檢測引起人心 內(nèi)膜炎常見的兩種巴爾通體，為這兩種巴爾通體鑒別和區(qū)分提供有效檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種雙重實時熒光定量PCR檢測引發(fā)心內(nèi)膜炎的巴爾通體 (五日熱巴爾通體和漢賽巴爾通體）的方法。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供一種用于檢測引發(fā)心內(nèi)膜炎的巴爾通體 的實時熒光定量PCR引物組，所述引物組包括用于檢測漢賽巴爾通體的引物對I和用于檢 測五日熱巴爾通體的引物對II ;
[0008] 所述引物對I為：
[0009] BhF :5' -GAGTCAGATGGAATGGTATTGGTTATC-3' ；
[0010] BhR :5' -CGGTTTATCCCCCACAAGATAGG-3' ；
[0011] 所述引物對II為：
[0012] BqF :5' -TGCCAAGTATGCGAGTTCCTG-3' ；
[0013] BqR : 5 ' -TCAGAGTTAGGTGCAAGTTCTATGG-3 '。
[0014] 本發(fā)明還提供了與前述引物組配合使用的探針，所述探針為：
[0015] 探針 I :
[0016] BhT：FAM-CCCTCCCGGTTTTTCTCTGGGCCT-BHQ1 ；
[0017] 探針 II:
[0018] BqT ：CY5-TCTGCGCCCGGTTCTGAAATGCCT-BHQ2 ；
[0019] 其中，F(xiàn)AM和CY5為熒光報告基團，BHQl和BHQ2為熒光淬滅基因。
[0020] 本發(fā)明還提供了含有前述引物組及前述探針的試劑盒。
[0021] 進一步地，所述試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反應緩沖液中的一 種或多種。
[0022] 進一步地，所述試劑盒的工作步驟是利用前述引物組及前述探針對引發(fā)心內(nèi)膜炎 的巴爾通體進行TaqMan實時熒光定量PCR檢測。
[0023] 進一步地，所述工作步驟具體包括：
[0024] 1)提取樣品中的DNA ;
[0025] 2)以步驟1)中提取的DNA為模板，利用前述引物組及前述探針進行雙重實時熒光 定量PCR反應；
[0026] 3)分析實時熒光定量PCR產(chǎn)物。
[0027] 進一步地，所述試劑盒的PCR反應體系以20 μ 1計為：
[0028]
[0029] 作為優(yōu)選，所述引物的濃度為10ym〇l/L，所述探針的濃度為lOymol/L。
[0030] 作為優(yōu)選，所述試劑盒的PCR反應條件為：95°C 2分鐘，單個循環(huán)；95°C 3秒， 60°C 30秒，共40個循環(huán)。
[0031] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0032] 本發(fā)明建立的雙重實時熒光定量PCR探針法特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好。特 異性實驗結(jié)果顯示只有漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體擴增出熒光信號，其他種屬的細 菌均未見熒光信號；敏感性實驗結(jié)果顯示在20 μ L的反應體系中，雙重實時實時熒光定量 PCR探針法檢測漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體最低檢出限分別為3. 64Χ IO1個拷貝和 3. 28Χ101個拷貝，比常規(guī)PCR敏感性提高了 100倍，此外也顯示出良好的線性關(guān)系和擴增 效率，相關(guān)系數(shù)R2分別為0. 994和0. 998, E值分別為100. 0%和103. 4%。重復性實驗結(jié) 果顯示組內(nèi)和組間的CV值為0. 19% -0. 53%和0. 49% -1. 66%，在允許范圍內(nèi)。采用本方 法可同時快速檢測出漢賽巴爾通體和五日熱巴爾通體，為這兩種巴爾通體所引起的心內(nèi)膜 炎等一系列疾病的早期快速診斷、監(jiān)測和流行病學調(diào)查等研宄提供有效手段。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明實施例1中漢賽巴爾通體㈧和五日熱巴爾通體⑶不同退火溫度 的擴增曲線。
[0034] 圖2為本發(fā)明實施例1中漢賽巴爾通體㈧和五日熱巴爾通體⑶不同探針濃度 的擴增曲線。
[0035] 圖3為本發(fā)明實施例1中漢賽巴爾通體㈧和五日熱巴爾通體⑶不同引物濃度 的擴增曲線。
[0036] 圖4為本發(fā)明實施例1中實時熒光定量PCR探針法特異性檢測五日熱巴爾通體和 漢賽巴爾通體的結(jié)果。
[0037] 圖5為本發(fā)明實施例1中實時熒光定量PCR探針法特異性檢測國內(nèi)分離的14株 巴爾通體（6株Bh和8株Bq)的結(jié)果。
[0038] 圖6為本發(fā)明實施例1中漢賽巴爾通體單重實時熒光定量PCR探針法敏感性分析 的擴增曲線（A)和標準曲線（B)，其擴增效率為98. 1%，相關(guān)系數(shù)R2為0.996。
[0039] 圖7為本發(fā)明實施例1中五日熱巴爾通體單重實時熒光定量PCR探針法敏感性分 析的擴增曲線（A)和標準曲線（B)，其相關(guān)系數(shù)R2為