專利名稱：一種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法。
背景技術(shù)：
大豆[Glycine max (L. ) Merr.]作為世界上最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，是人類蛋白質(zhì)和脂肪的重要來源，在食品、飼料、エ業(yè)上具有廣泛的用途。大豆種子的子葉顔色分為黃、綠兩色。我國大豆種質(zhì)資源豐富，但是具有綠子葉性狀的大豆種質(zhì)資源較少，僅占2. 77%。隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)的調(diào)整，人們對(duì)大豆的需求正逐步趨向多元化、多用途的方向發(fā)展，綠子葉大豆以其獨(dú)特的外觀品質(zhì)及特殊的食用、加工特性正逐步受到人們的關(guān)注及加工企業(yè)的青睞。因此，加快綠子葉大豆種質(zhì)資源的利用和新品種的選育，成為大豆遺傳 育種工作中的重要研究內(nèi)容之一。常規(guī)育種是通過性狀的表現(xiàn)型間接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，這種選擇方法雖然可行，但是由于目的基因位點(diǎn)有純合和雜合之分，需要多年自交鑒別，故育種年限較長。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種和分子設(shè)計(jì)育種等現(xiàn)代育種技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，使人們能夠直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇，選擇結(jié)果更加客觀、準(zhǔn)確，大大提高育種的效率和縮短育種的年限。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)選擇性狀進(jìn)行分子標(biāo)記，是分子標(biāo)記輔助育種和分子設(shè)計(jì)育種等工作的基礎(chǔ)，同時(shí)主要農(nóng)藝性狀分子標(biāo)記的獲得，對(duì)于控制該性狀基因的研究也具有十分重要的理論和實(shí)際意義。SSR (Simple Sequence Repeat)標(biāo)記是一種操作簡便的分子標(biāo)記,屬于顯性標(biāo)記，在基因組中分布平均、多態(tài)性高、結(jié)果準(zhǔn)確，在許多農(nóng)作物的遺傳多樣性研究、分子標(biāo)記、基因定位和分子標(biāo)記輔助育種等方面廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法。本發(fā)明提供了ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀大豆的方法(方法甲)，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，用Satt408引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果所述PCR擴(kuò)增在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果所述PCR擴(kuò)增在180-220bp區(qū)間內(nèi)沒有得到190bp±5bp的產(chǎn)物，或所述PCR擴(kuò)增在180-220bp區(qū)間內(nèi)除了得到190bp±5bp的產(chǎn)物還得到了 190bp±5bp以外的產(chǎn)物，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還提供了所述Satt408引物對(duì)在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用。本發(fā)明同時(shí)提供了所述Satt408引物對(duì)在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用。所述Satt408引物對(duì)或所述方法(方法甲)可用于篩選具有綠子葉性狀的大豆。
所述Satt408引物對(duì)或所述方法(方法甲)可用于綠子葉性狀大豆的育種，即將所述方法鑒定為的綠子葉性狀大豆用于育種。在方法甲的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了另ー種準(zhǔn)確度更高的輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法(方法こ)，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，分別用Satt408引物對(duì)和Sattl29引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果同時(shí)滿足特定條件甲和特定條件こ，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果不同時(shí)滿足特定條件甲和特定條件こ，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆；所述特定條件甲如下采用Satt408引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物；所述特定條件こ如下采用Sattl29引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在120-160bp區(qū)間內(nèi)只得到了 130bp±5bp的產(chǎn)物；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對(duì)由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明還保護(hù)所述Satt408引物對(duì)和所述Sattl29引物對(duì)在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)所述Satt408引物對(duì)和所述Sattl29引物對(duì)在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用。引物組合物或所述方法(方法こ)可用于篩選具有綠子葉性狀的大豆；所述引物組合物由所述Satt408引物對(duì)和所述Sattl29引物對(duì)組成。所述引物組合物或所述方法(方法こ)可用于綠子葉性狀大豆的育種，即將所述方法鑒定為的綠子葉性狀大豆用于育種。本發(fā)明還保護(hù)ー種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒，包括所述Satt408引物對(duì)。所述試劑盒還可包括所述Sattl29引物對(duì)。本發(fā)明提供的方法中，利用分子標(biāo)記鑒定植株幼苗中是否存在綠子葉基因，同時(shí) 可鑒定出控制子葉的基因型，進(jìn)而推斷植株將產(chǎn)生何種顏色的子葉，其后代是否會(huì)發(fā)生子葉顔色分離，對(duì)育種具有重大價(jià)值。本發(fā)明可應(yīng)用于綠子葉品種的分子標(biāo)記輔助育種和分子設(shè)計(jì)育種，能夠大大減少田間選擇的工作量、縮短育種年限。同時(shí)由于所獲得的綠子葉的分子標(biāo)記Satt408_19(lbp標(biāo)記和Sattl29_13(lbp標(biāo)記與綠子葉基因之間的遺傳距尚只有2. IcM,可利用該標(biāo)記對(duì)綠子葉基因進(jìn)行進(jìn)一歩深入研究。


圖I為Satt408引物對(duì)在部分‘科豐14’ X ‘丹豆6號(hào)’的F2代分離群體中的PCR擴(kuò)增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號(hào)’ ；3-12 F2代分離群體中的黃子葉單株；13-20 F2代分離群體中的綠子葉單株。圖2為Sattl29引物對(duì)在部分‘科豐14’ X ‘丹豆6號(hào)’的F2代分離群體中的PCR擴(kuò)增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號(hào)’ ；3-13 F2代分離群體中的黃子葉單株；14-20 F2代分離群體中的綠子葉單株。圖3為實(shí)施例2中采用Satt408引物對(duì)時(shí)部分樣本的PCR擴(kuò)增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號(hào)’ 3-10 :黃子葉性狀大豆(依次為中黃4號(hào)、中黃7號(hào)、中黃10號(hào)、中黃14號(hào)、中黃18號(hào)、中黃27號(hào)、中品662、中品661) ；11-20綠子葉性狀大豆(依次為T41、PI157416、黑皮青瓤、大青仁、魯莊大黑豆、開江黑豆、仙游綠心豆、7904、L62-1027、L69-4663)。圖4為實(shí)施例2中采用Sattl29引物對(duì)時(shí)部分樣本的PCR擴(kuò)增電泳圖；1 ‘科豐14’ ；2 ‘丹豆6號(hào)’ 3-10 :黃子葉性狀大豆(依次為中黃4號(hào)、中黃7號(hào)、中黃10號(hào)、中黃14號(hào)、中黃18號(hào)、中黃 27號(hào)、中品662、中品661) ; 11-18綠子葉性狀大豆(依次為T41、PI157416、黑皮青親、大青仁、魯莊大黑丑、開江黑丑、仙游綠心丑、7904)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實(shí)施例I、輔助鑒定大豆綠子葉性狀的SSR引物對(duì)及相應(yīng)分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)以黃子葉大豆品種‘科豐14’為母本，綠子葉大豆品種‘丹豆6號(hào)’為父本，進(jìn)行雜交，獲得Fl代，F(xiàn)l代自交，獲得子葉顔色性狀分離的F2代種子。F2代種子的子葉顔色分析表明，黃子葉和綠子葉種子的比例分別為5968粒1957粒，為3:1，符合經(jīng)典遺傳學(xué)I對(duì)基因分離規(guī)律，證實(shí)為黃/綠子葉性狀由I對(duì)基因控制，黃子葉對(duì)綠子葉為顯隱性關(guān)系。選取同I株Fl植株上收獲的子葉顔色分離的F2代種子，總粒數(shù)為246粒，具有黃子葉的187粒，具有綠子葉的59粒，黃、綠分離比為3. 17 :1，接近3 :1，經(jīng)卡平方檢測，X2=0. 1348 < X20.05jl = 3. 84，符合由I對(duì)顯性基因控制的3黃I綠的理論比例。將F2代種子按照子葉顔色分別種植，獲得123個(gè)F2代單株的幼苗(102株為黃子葉、21株為綠子葉；部分種子沒有出苗)。分別提取F2代單株幼苗的基因組DNA，利用集群分離分析法(BulkedSegregant Analysis, BSA),以大豆SSR引物對(duì)為DNA擴(kuò)增反應(yīng)的引物，篩選與綠子葉性狀(基因)緊密連鎖的分子標(biāo)記。經(jīng)PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳，在840對(duì)SSR弓丨物的篩選結(jié)果中，有2對(duì)SSR引物(Satt408引物對(duì)和Satt129引物對(duì))在綠子葉幼苗的DNA中能夠各自擴(kuò)增出I條特異的DNA片段，分子量分別為190bp±5bp和130bp±5bp (部分結(jié)果見圖I和圖2)。Satt408引物對(duì)(該引物對(duì)的退火溫度為60°C，靶序列位于Dla染色體位點(diǎn))對(duì)于具有綠子葉性狀大豆的特異性靶序列為190bp±5bp，將該特異性靶序列命名為Satt408_19一標(biāo)記。Satt408引物對(duì)對(duì)于具有黃子葉性狀且黃子葉基因?yàn)榧兒闲偷拇蠖沟奶禺愋园行蛄袨?10bp±5bp。Satt408引物對(duì)對(duì)于具有黃子葉性狀且黃子葉基因/綠子葉基因?yàn)殡s合型的大豆來說，同時(shí)具有上述兩種特異性靶序列。Sattl29引物對(duì)(該引物對(duì)的退火溫度為60°C，靶序列位于Dla染色體位點(diǎn))對(duì)于具有綠子葉性狀的大豆的靶序列為130bp±5bp，將該特異性靶序列命名為Sattll29_13(lbp.記。Sattl29引物對(duì)對(duì)于具有黃子葉性狀且黃子葉基因?yàn)榧兒闲偷拇蠖沟奶禺愋园行蛄袨?45bp±5bp。Sattl29引物對(duì)對(duì)于具有黃子葉性狀且黃子葉基因/綠子葉基因?yàn)殡s合型的大豆來說，同時(shí)具有上述兩種特異性靶序列。同吋，收獲F2代植株產(chǎn)生的種子，分析每個(gè)植株種子子葉的顔色，確定每個(gè)植株子葉的基因型，并與分子標(biāo)記測定的基因型比較。表I為試驗(yàn)材料中各個(gè)單株實(shí)際的基因型及SSR引物Satt408和Sattl29擴(kuò)增產(chǎn)生的分子標(biāo)記帶型統(tǒng)計(jì)表。Satt408列中，A表示采用Satt408引物對(duì)擴(kuò)增僅具有與‘科豐14’具有相同的帶型，B表示采用Satt408引物對(duì)擴(kuò)增僅具有與‘丹豆6號(hào)’具有相同的帶型，H表示采用Satt408引物對(duì)擴(kuò)增同時(shí)具有‘科豐14’和‘丹豆6號(hào)’的帶型，-表示采用Satt408引物對(duì)擴(kuò)增不具有‘科豐14’的帶型且不具有‘丹豆6號(hào)’的帶型。Sattl29列中，A表示采用Sattl29引物對(duì)擴(kuò)增僅具有與‘科豐14’具有相同的帶型，B表示采用Sattl29引物對(duì)擴(kuò)增僅具有與‘丹豆6號(hào)’具有相同的帶型，H表示采用Sattl29引物對(duì)擴(kuò)增同時(shí)具有‘科豐14’和‘丹豆6號(hào)’的帶型，-表示采用Sattl29引物對(duì)擴(kuò)增不具有‘科豐14’的帶型且不具有‘丹豆6號(hào)’的帶型。因?yàn)辄S色子葉相對(duì)綠色子葉為顯性，且單株中可能發(fā)生了標(biāo)記位點(diǎn)交換,如果Satt408列和Sattl29列中至少有ー個(gè)為H且子葉性狀為黃色，基因型填寫為H，如果子葉性狀為綠色、基因型填寫為B，如果Satt408列和Sattl29列均為A且子葉性狀為黃色，基因型填寫為A。表1F2代分離群體中各個(gè)單株的實(shí)際子葉基因型及Satt408和Satt129擴(kuò)增產(chǎn)生的分子標(biāo)記帶型統(tǒng)計(jì)

權(quán)利要求
1.一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，用Satt408引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果所述PCR擴(kuò)增在180_220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果所述PCR擴(kuò)增在180-220bp區(qū)間內(nèi)沒有得到190bp±5bp的產(chǎn)物，或所述PCR擴(kuò)增在180_220bp區(qū)間內(nèi)除了得到190bp±5bp的產(chǎn)物還得到了 190bp±5bp以外的產(chǎn)物，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大ii ;所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
2.Satt408引物對(duì)在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
3.Satt408引物對(duì)在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
4.Satt408引物對(duì)或權(quán)利要求I所述的方法在篩選具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成。
5.一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法，包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，分別用Satt408引物對(duì)和Sattl29引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果同時(shí)滿足特定條件甲和特定條件乙，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果不同時(shí)滿足特定條件甲和特定條件乙，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆； 所述特定條件甲如下采用Satt408引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了 190bp±5bp的產(chǎn)物； 所述特定條件乙如下采用Sattl29引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在120-160bp區(qū)間內(nèi)只得到了 130bp±5bp的產(chǎn)物； 所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所不的單鏈DNA分子和序列表的序列2所不的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對(duì)由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
6.Satt408引物對(duì)和Sattl29引物對(duì)在輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對(duì)由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
7.Satt408引物對(duì)和Sattl29引物對(duì)在制備輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒中的應(yīng)用；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對(duì)由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
8.引物組合物或權(quán)利要求5所述的方法在篩選具有綠子葉性狀的大豆中的應(yīng)用；所述引物組合物由Satt408引物對(duì)和Sattl29引物對(duì)組成；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述Sattl29引物對(duì)由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
9.一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的試劑盒，包括Satt408引物對(duì)；所述Satt408引物對(duì)由序列表的序列I所示的單鏈DNA分子和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括Sattl29引物對(duì)；所述Sattl29引物對(duì)由序列表的序列3所示的單鏈DNA分子和序列表的序列4所示的單鏈DNA分子組成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定具有綠子葉性狀的大豆的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟以待測大豆的基因組DNA為模板，用Satt408引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；如果在180-220bp區(qū)間內(nèi)只得到了190bp±5bp的產(chǎn)物，待測大豆為候選的具有綠子葉性狀的大豆；如果在180-220bp區(qū)間內(nèi)沒有得到190bp±5bp的產(chǎn)物，或在180-220bp區(qū)間內(nèi)除了得到190bp±5bp的產(chǎn)物還得到了190bp±5bp以外的產(chǎn)物，待測大豆為候選的不具有綠子葉性狀的大豆；Satt408引物對(duì)由序列1和2所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明的方法中利用分子標(biāo)記鑒定植株幼苗中是否存在綠子葉基因，進(jìn)而推斷植株將產(chǎn)生何種顏色的子葉，其后代是否會(huì)發(fā)生子葉顏色分離，對(duì)育種具有重大價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102851367SQ20121033029
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月7日
發(fā)明者謝皓, 陳學(xué)珍, 倪資園, 郭蓓, 楊柳, 張嬌, 薛樹鵬, 郭遠(yuǎn) 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院